全 文 ：※工艺技术 食品科学 2014, Vol.35, No.02 47
高速逆流色谱分离纯化苦荞中芦丁、槲皮素
朱 琳，任 清*，徐笑颖
（北京工商大学食品学院，食品添加剂与配料北京高校工程研究中心，北京 10004 8）
摘 要：利用乙醇溶液提取苦荞麸皮中总黄酮，将得到的苦荞黄酮粗提物用DA-201大孔树脂进行初步纯化。以
得到的黄酮初步纯化产物为原料，应用高速逆流色谱对其中的芦丁和槲皮素进行分离、纯化。所用两相溶剂体系
为乙酸乙酯-正丁醇（4∶1∶5，V/V），上相为固定相，下相为流动相，流速2 mL/min，转速850 r/min，检测波长
254 nm。所得产物经高效液相色谱检测，结果表明得到芦丁纯度为99%，槲皮素纯度为94%。表明该法分离制备苦
荞麸皮中芦丁、槲皮素简便，所得产物纯度高。
关键词：苦荞；芦丁；槲皮素；高速逆流色谱
Isolation and Preparation of Flavones from the Bran of Tartary Buckwheat Using High Speed Counter Current Chromatography
ZHU Lin, REN Qing*, XU Xiao-yin g
(Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients, School of Food and Chemical Engi neering,
Beijing Technology and Business University, Be ijing 100048, China)
Abstract: The bran of tartary buckwheat was extracted with 60% ethanol. A DA-201 macroporous resin column was applied
in the purification of flavonoids from the extract. High speed counter current chromatography (HSCCC) method was used
for preparative isolation and purification of rutin and quercetin from the preliminarily purified extracts. A two-phase solvent
system composed of ethyl acetate, n-butyl alcohol and water (4:1:5, V/V) was used at a flow rate of 2.0 mL/min for HSCCC
separ ation at a rotation speed of 850 r/min and the pooled eluates were detected at 25 4 nm. The purity of rutin and quercetin
obtained was 99% and 94%, respectively, as detected by high performance liquid chromatography (HPLC). These results
indicate that this method is convenient and effective and can be used to extract and purify rutin and quercetin from tartary
buckwheat bran.
Key words: tartary buckwheat; rutin; quercetin; high speed counter current chromatography (HSCCC)
中图分类号：TS207.3 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）02-0047-04
doi:10.7506/spkx1002-6630-201402009
收稿日期：2013-05-17
基金项目：国家现代农业产业技术体系建设专项（CARS-08-D-3）
作者简介：朱琳（1988—），女，硕士研究生，研究方向为食品生物技术。E-mail：happy.sure@hotmail.com
*通信作者：任清（1969—），男，副教授，博士，研究方向为生物活性成分的分离提取及功能。E-mail：renqing@th.btbu.edu.cn
荞麦又名乌麦、花麦或三角麦，有甜荞和苦荞两
个可食品种。俄罗斯是荞麦种植第一大国，我国第
二，但我国的苦荞种植面积和产量均居世界第一位[1]。
荞麦营养丰富 [2-3]，其中生物类黄酮是苦荞最为重要的
生物活性物质之一，赋予苦荞多种生理功能，主要有
抗氧化 [4]、抑菌 [5]、降血糖 [6]、降血脂、抗肿瘤等多种
药理活性。苦荞麸皮是苦荞麦片和苦荞制粉生产过程
中的副产品，研究表明苦荞麦麸皮中总黄酮含量可达
6%～7%[7]，主要成分有槲皮素、山柰酚和芦丁等，
而其中芦丁含量高达70%～90%[8]。从苦荞麦中提取
黄酮类化合物作为保健食品或药品的原料具有较好的
前景。
高速逆流色谱（high-speed counter-current
chromatography，HSCCC）是一种液-液分配色谱技术。
HSCCC不用任何固体载体或支撑体作为固定相，避免了
样品的不可逆性吸附和样品组分的化学变性等，使样品
的完全回收成为可能，同时还具有应用范围广、仪器操
作简单、分离量大等优点[9]，因而近年来在天然产物领域
得到了较为广泛的关注和应用[10]。而将HSCCC应用于分
离苦荞麸皮中的黄酮类物质在国内外鲜见报道。本实验
以苦荞籽粒为原料，研究苦荞麸皮总黄酮的提取及分离
纯化工艺，运用HSCCC分离苦荞麸皮中的黄酮类物质，
以期得到分离苦荞麸皮中黄酮的快速简便的方法。
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1 材料与方法
1.1 材料与试剂
苦荞籽粒 山西农业科学院农产品加工研究所。
芦丁对照品（98%） 百灵威科技有限公司；槲皮
素对照品（98%） 上海同田生物技术股份有限公司；
DA-201大孔树脂 江苏苏青水处理工程集团有限公
司；乙腈、甲醇（色谱纯） 美国Fisher公司；亚硝酸
钠、硝酸铝等均为分析纯。
1.2 仪器与设备
T6新世界紫外-可见光分光光度计 北京普析通用
仪器有限公司；RE-52AA旋转蒸发器 上海亚荣生化仪
器厂；2-4 LSC真空冷冻干燥机 德国 Christ公司；1100
高效液相色谱系统（配有DAD检测器） 美国Agilent公
司；Ultimate XB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱
月旭材料科技（上海）有限公司；TBE-300A半制备型高
速逆流色谱仪（柱体积280 mL；配有S-1007型微机单缸
泵；TBD-23UV Detector紫外检测器；N2000双通道色谱
工作站） 浙江大学智达信息工程有限公司。
1.3 方法
1.3.1 苦荞预处理及总黄酮的提取
1.3.1.1 苦荞预处理工艺路线
苦荞籽粒→洗净干燥→粉碎机粉碎→过100目筛
（除去淀粉）→过40目筛得到苦荞麸皮。
1.3.1.2 溶液的制备
对照品溶液[11]：准确称取真空干燥至恒质量的芦丁
对照品0.010 0 g，用体积分数30%乙醇水浴微热溶解，
并完全转入100 mL容量瓶中，用30%乙醇定容，制成
0.100 0 mg/mL的芦丁标准溶液。
样品溶液 [ 1 2 ]：准确称取过 4 0目筛的苦荞麸皮
10.000 g，按料液比1∶10加入体积分数60%乙醇溶液，
在80 ℃水浴中搅拌提取，提取2次，每次提取2 h。将提
取液减压抽滤，得到待测样品溶液。将样品溶液真空浓
缩，冷冻干燥，得到苦荞黄酮粗提物。
1.3.1.3 芦丁标准曲线的绘制[13]
精密吸取0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL上述
芦丁标准溶液，分别 置于6支10 mL刻度试管中，加30%乙
醇至5 mL，加5% NaNO2溶液0.30 mL，摇匀后放置5 min，
加10% Al(NO3)3溶液0.30 mL，摇匀后放置6 min，加4%
NaOH溶液2.00 mL，再用30%乙醇稀释至刻度，摇匀后放
置10 min，置l cm比色皿中在510 nm波长处测定吸光度，
以吸光度为纵坐标，以芦丁质量浓度（mg/mL）为横坐标
得标准曲线y＝0.150 2x＋0.002 4，R2＝0.999 9，表明芦
丁标准曲线的线性好。
1.3.1.4 样品总黄酮含量及粗提物纯度的测定
将黄酮样品溶液稀释适当的倍数，取3 mL稀释溶液
加2 mL 30%乙醇，处理方法同1.3.1.3节，根据吸光度从
标准曲线回归方程求出苦荞中总黄酮的含量，为4.30%。
称取一定量的黄酮粗提物，用30%乙醇溶解，用相同方
法得出其中总黄酮的量并计算纯度，为40.2%。
1.3.2 苦荞麸皮黄酮的初步纯化
1.3.2.1 DA-201大孔树脂预处理[14]
取一定量的树脂，用95%的乙醇浸泡24 h，然后用乙
醇洗涤，直到洗出液中加适量蒸馏水无白色浑浊现象，
再用蒸馏水洗至无醇。依次用4% NaOH溶液、5% HCl溶
液浸泡2～4 h，分别用蒸馏水洗至中性，将预处理好的
DA-201树脂湿法装入20 mm×300 mm玻璃层析柱中。
1.3.2.2 DA-201大孔树脂纯化工艺[15]
将提取液真空（60 ℃，0.09 MPa）浓缩，加水制
成0.75 mg/mL的黄酮溶液100 mL，以2 mL/min流速通过
DA-201树脂柱，用蒸馏水洗至无色，再用150 mL 70%的
乙醇以2 mL/min洗脱并收集洗脱液，真空浓缩，冷冻干
燥，制得初步纯化苦养麸皮黄酮，并测定其纯度。
1.3.3 苦荞麸皮黄酮的纯化物的高效液相色谱（high
performance liquid chromatography，HPLC）分析
1.3.3.1 HPLC色谱条件
色谱柱：Ultimate XB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；
波长：375 nm；流动相A：0.05%（V/V）冰醋酸溶液；
流动相B：乙腈；流速：0.8 mL/min；进样量：20 μL；
梯度洗脱：0～8 min、18% B，8～18 min、18%～28%
B，18～28 min、28% B，28～35 min、28%～100% B，
35～40 min、100% B，40～45 min、18% B。
1.3.3.2 芦丁、槲皮素标准曲线制作及样品测定
混合对照品溶液制备[16]：分别精密称取对照品芦丁
100 mg、槲皮素2.5 mg于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，
再将溶液稀释10倍，配成质量浓度分别为1.00 mg/mL和
0.025 mg/mL的混合对照品贮备液。
样品溶液制备：精密称取纯化的样品10 mg于10 mL容量
瓶中，用甲醇定容，配成质量浓度1 mg/mL的样品溶液。
标准曲线制作：将混合对照品溶液分别进样10、
15、20、25、30 μL，以对照品的质量（mg）为横坐标，
峰面积为纵坐标绘制标准曲线。
样品溶液的测定：取样品溶液进样20 μL，按上述
HPLC方法进行测定，记录峰面积，根据标准曲线回归方
程计算样品中芦丁和槲皮素的含量。
1.3.4 苦荞麸皮黄酮的HSCCC纯化
1.3.4.1 溶剂体系的选择[17]
溶剂体系的选择对分离效果至关重要。研究表明，
一个好的溶剂系统应满足下列要求：固定相要有较高的
保留率；两相溶剂系统的分层时间小于30 s；分配系数K
应尽量符合0.5＜K＜2[18]。
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参照Ito溶剂体系选择方法[19]，对比氯仿-甲醇-水体
系，本实验选用毒性较小的乙酸乙酯-正丁醇-水体系，所
选用的3种溶剂的配比分别为：2∶3∶5、3∶2∶5、4∶1∶5、
5∶0∶5以及正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水1∶5∶1∶5、2∶5∶2∶5、
3∶5∶3∶5，利用HPLC分别测定在不通过溶剂体系中芦丁
和槲皮素的分配系数。
分配系数的测定方法[20]：取约4 mg苦荞黄酮纯化物
于10 mL玻璃试管中，加入预先达到平衡的两相溶剂系
统的上相和下相各4 mL于此试管中，超声振荡混匀，使
黄酮纯化物充分溶解。待达到分配平衡后，分别取上相
和下相各1 mL，水浴蒸干后用1 mL色谱纯甲醇溶解，经
HPLC检测后得到上相中化合物的峰面积A1和下相中化合
物的峰面积A2，则分配系数K＝A1/A2。
1.3.4.2 HSCCC分离苦荞麸皮黄酮中芦丁、槲皮素
在分液漏斗中按比例配制两相溶剂系统，充分振摇
后静置，使用前分取上下相，超声脱气后泵入逆流色谱
仪。先将HSCCC分离管中充满上相，调整主机转速为
850 r/min，再以2 mL/min流速泵入下相，待流动相从柱
出口流出，表明两相在分离管中建立了动态平衡。取初
步纯化黄酮样品80 mg溶于8 mL流动相中，由进样阀进
样，流出液用紫外检测器在254 nm波长处进行检测，同
时记录色谱图，根据色谱图接收各流分[21]。
1.3.4.3 HPLC检验纯度
按1.3.3.1节的HPLC条件，对收集到的各流分中芦
丁、槲皮素含量进行测定，对照标准曲线回归方程得到
经HSCCC纯化后的芦丁与槲皮素的纯度。
2 结果与分析
2.1 HPLC分析芦丁、槲皮素对照品标准曲线绘制
500
400
300
200
100
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
ᰦ䰤/min
ጠ
䶒
〟
/ m
A
U
㣖б
•Ⳟ㍐
图 1 芦丁、槲皮素混合标品HPLC图谱
Fig.1 HPLC profiles of mixed standards of rutin and quercetin
由图1可知，芦丁保留时间为15.023 min，槲皮素保
留时间为33.476 min。按照1.3.3.2节方法，绘制得芦丁标
准曲线：y＝1×106x－27 935，R2＝0.999 9；槲皮素标准
曲线：y＝1×106x＋56 786，R2＝0.999 5。
2.2 大孔树脂初步纯化的黄酮中芦丁、槲皮素含量的
HPLC测定
500
400
300
200
100
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
ᰦ䰤/min
ጠ
䶒
〟
/ m
A
U
㣖б
•Ⳟ㍐
图 2 大孔树脂纯化物的HPLC图谱
Fig.2 HPLC profiles of the products purified by macroporous resin
chromatography
利用吸光度法得，经大孔树脂纯化所制得的样品中总黄
酮含量为88.4%。对经大孔树脂初步纯化的样品进行HPLC分
析，得出样品中芦丁、槲皮素含量分别为80.5%与3.01%。
2.3 HSCCC分配系数的测定
表 1 不同溶剂体系中芦丁、槲皮素的分配系数
Table 1 Partition coefficients of rutin and quercetin in solvent systems
with different proportions
溶剂体系 比例 芦丁分配系数 槲皮素分配系数
乙酸乙酯-正丁
醇-水
2∶3∶5 4.45 85.82
3∶2∶5 3.6 76.94
4∶1∶5 1.15 50.97
5∶0∶5 0.054 36.77
正己烷-乙酸乙
酯-甲醇-水
1∶5∶1∶5 0.022 25.03
2∶5∶2∶5 0.006 18.54
3∶5∶3∶5 0.003 3.82
组分在HSCCC达到良好的分离，需满足分配系数
0.5＜K＜2，且组分的分配系数有较大的差距，从表1可
以看出，乙酸乙酯-正丁醇-水（4∶1∶5）的芦丁分配系数
在0.5～2，但槲皮素分配系数较大，会出现出峰时间较
长，峰形变宽，本实验采用反推洗脱模式，在芦丁出峰
结束后，将槲皮素组分反推出来，可缩短分离时间。而
正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（3∶5∶3∶5）体系中芦丁分配
系数较小，槲皮素分配系数较为合适，会造成芦丁出峰
时间过早，不易分离，但有利于芦丁、槲皮素的一次分
离，所以本实验选用乙酸乙酯-正丁醇-水（4∶1∶5）与正
己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（3∶5∶3∶5）体系进行HSCCC分
离纯化，并分别检验其纯度。
2.4 初步纯化苦荞黄酮的HSCCC分离
按1.3.4.2节的方法对经大孔树脂纯化的苦荞黄酮进
行HSCCC分离纯化，溶剂体系选用乙酸乙酯-正丁醇-水
（4∶1∶5）与正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（3∶5∶3∶5），
固定相保留率分别为50%、66.7%。洗脱时间分别为4、
5 h。在乙酸乙酯-正丁醇-水（4∶1∶5）体系的180 min时采
用反推模式，主机调为反转，将流动相换成固定相。两
体系的高速逆流图谱如图3、4所示。
50 2014, Vol.35, No.02 食品科学 ※工艺技术
10
10
30
50
70
90
110
130
150
170
⭥
঻
/ m
V
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260
ᰦ䰤/min
ĉ
Ċ
ċ Č
č
图 3 乙酸乙酯-正丁醇-水（4∶1∶5）体系高速逆流色谱图
Fig.3 HSCCC profiles of flavonoids in ethyl acetate-n-butyl alcohol-
water (4:1:5, V/V)
0
20
40
60
80
120
100
140
160
⭥
঻
/ m
V
0 40 80 120 160 200 240 280 320
ᰦ䰤/min
1
2
3
4
图 4 正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（3∶5∶3∶5）体系高速逆流色谱图
Fig.4 HSCCC profiles of flavonoids in n-hexane-ethyl acetate-
carbinol -water (3:5:3:5, V/V)
收集图3中的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ各组分以及图4中
的1、2、3、4组分按1.3.3.1节的HPLC条件进行分析，结
果如图5所示。
100
80
60
40
20
0
0 10 20 30
m
A
U
ᰦ䰤/min
A 15.033
100
120
80
60
40
20
0
0 10 20 30
m
A
U
ᰦ䰤/min
B 33.284
图 5 乙酸乙酯-正丁醇-水4∶1∶5体系组分Ⅱ（A）和Ⅳ（B）HPLC色谱图
Fig.5 HPLC profile of flavonoid componentⅡin ethyl acetate-n-
butyl alcohol-water (4:1:5, V/V) and that of component Ⅳ in the same
solvent mixture
图5为乙酸乙酯-正丁醇-水（4∶1∶5）体系中组分Ⅱ和
组分Ⅴ的HPLC图谱。对照保留时间可知组分Ⅱ为芦丁，
组分Ⅴ为槲皮素，质量分别为53.6、1.9 mg。通过标准曲
线回归方程得到芦丁和槲皮素纯度分别达99%和94%，
且分离时间较短，仅为4 h。而在正己烷-乙酸乙酯-甲醇-
水（3∶5∶3∶5）体系中，由于芦丁分配系数<<1，出峰时间
太短，与其他组分没有得到很好的分离，得到纯度较低，
但是槲皮素纯度较高，综合考虑选用乙酸乙酯-正丁醇-水
（4∶1∶5）体系进行苦荞黄酮中芦丁和槲皮素的分离。
3 结 论
本实验采用乙醇提取方法，以较优的提取条件：
料液比1∶10、乙醇体积分数60%、温度80 ℃、搅拌提
取、时间2 h、提取两次，测得苦荞麸皮中总黄酮含量为
4.30%，粗提物纯度为40.2%。选用DA-201大孔树脂对提
取得到的黄酮粗提物进行了初步纯化，得到纯化产物纯
度为88.4%。运用HPLC外标法对苦荞麸皮初步纯化产物
中的芦丁、槲皮素进行了定量测定，得出芦丁、槲皮素
含量分别为80.5%与3.01%。以经初步纯化的苦荞麸皮黄
酮为原料，进行了高速逆流的分离纯化，选用两相溶剂
体系：乙酸乙酯-正丁醇-水（4∶1∶5），上相为固定相，
下相为流动相，进样速率2 mL/min，转速850 r/min。于
140 min收集到芦丁，在180 min时进行反推，于220 min
时收集到槲皮素。经高效液相测定芦丁、槲皮素纯度分
别为99%、94%。表明本研究采用的提取分离方法可以简
便、有效的分离苦荞麸皮中的芦丁、槲皮素，为今后进
一步的功效研究奠定了一定的基础。
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