全 文 ：33※基础研究 食品科学 2011, Vol. 32, No. 19
苦荞多糖的分离纯化及单糖组成测定
颜 军 1，孙晓春 2，谢贞建 1，何 钢 1，易 勇 1，房 晨 1，苟小军 1 ,2 ,*
(1.成都大学中药化学实验室，四川 成都 610106；2.四川抗菌素工业研究所，四川 成都 610052)
摘 要：采用水提醇沉法获得苦荞多糖，经离子交换柱分离，高效凝胶过滤色谱法(HPGFC)纯度鉴定并测定多糖
的相对分子质量。硫酸水解后，用 1-苯基 -3-甲基 -5-吡唑啉酮(PMP)衍生水解后的单糖，衍生物采用反相高效液
相色谱法测定单糖组成。结果表明：苦荞经水提醇沉，用 Sevag 法脱蛋白后，获得苦荞多糖(TBP)；DEAE-纤维
素柱层析获得 3个苦荞多糖组分 TBP-1、TBP-2和 TBP-3，相对分子质量分别为 144544、445656和 636795。柱
前衍生液相色谱分析可知：TBP-1、TBP-2 是由葡萄糖组成的均一多糖；TBP-3 由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛
酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖组成的杂多糖，其物质的量比为 4.32:2.41:1.00:39.8:9.64:2.02。
关键词：苦荞；多糖；单糖；衍生化；高效液相色谱法
Purification and Monosaccharide Composition Analysis of Tartary Buckwheat Polysaccharides
YAN Jun1，SUN Xiao-chun2，XIE Zhen-jian1，HE Gang1，YI Yong1，FANG Chen1，GOU Xiao-jun1,2,*
(1. Laboratory for Chemistry of Traditional Chinese Medicine, Chengdu University, Chengdu 610106, China；
2. Sichuan Industrial Institute of Antibiotic, Chengdu 610052, China)
Abstract ：Tartary buckwheat polysaccharides (TBPs) were extracted by boiling water, precipitated by alcohol and purified
by ion-exchange column chromatography. The purity and molecular weight of TBPs were determined by high performance gel
filtration chromatography (HPGFC). Polysaccharide samples were hydrolyzed with sulfuric acid solution, and derivatized with
1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone (PMP). The monosaccharide composition of the hydrolysates obtained was analyzed by RP-
HPLC. The results showed that TBPs could be obtained by water extraction and alcohol precipitation after protein removal by
Savag method. Three polysaccharides, named as TBP-1, TBP-2 and TBP-3, were obtained by DEAE-cellulose column chroma-
tography with molecular weights of 144544, 445656 and 636795, respectively. Liquid chromatographic analysis based on pre-
column derivatization showed that TBP-1 and TBP-2 were composed of glucose and TBP-3 of mannose, rhamnose, glucuronic
acid, glucose, galactose and arabinose in a molar ratio of 4.32:2.41:1.00:39.8:9.64:2.02.
Key words：tartary buckwheat；polysaccharide；monosaccharide；derivatization；high performance liquid
chromatography (HPLC)
中图分类号：TS207.3 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2011)19-0033-04
收稿日期：2010-12-16
基金项目：四川省中医药管理局科技专项资助项目(2008-01)；四川省教育厅科研项目资助项目(08ZA173)；
成都大学校基金项目(2010XJZ24)
作者简介：颜军(1971—)，男，副教授，硕士，研究方向为生物活性成分的分离与检测。E-mail：yj7162@cdu.edu .cn
*通信作者：苟小军(1974—)，男，教授，博士，研究方向为药食同源植物加工技术。E-mail：jmee@cdu .edu .cn
植物多糖作为各种药物和功能性食品的有效成
分，具有免疫增强活性。对于预防和治疗包括癌症在
内的许多种疾病具有巨大的潜力。关于多糖的提取工
艺、结构性质和药理作用越来越受到国内外学者的广
泛关注[ 1- 2]。
我国栽培荞麦的历史悠久，品种资源丰富。四川
省凉山地区是荞麦的主产地之一。在栽培的荞麦品种
中，主要为苦荞，其次为甜荞[ 3]。由于荞麦营养丰富，
所以倍受人们青睐。目前，对荞麦研究主要集中在黄
酮的提取及其抗氧化性方面[4-6]。文献[7-10]对荞麦多糖的
提取、分子质量测定及生物活性进行了研究，但未见
关于苦荞多糖单糖组成的报道。
多糖的单糖组成研究常用的方法有高效液相色谱
法[11]、气相色谱法[12-13]、毛细管区带电泳法[14-15]等。本
研究拟采用水提醇沉法获得苦荞多糖，经DEAE-纤维素
柱层析纯化，硫酸水解、PMP 衍生化后，应用反相高
2011, Vol. 32, No. 19 食品科学 ※基础研究34
效液相色谱法测定苦荞多糖的单糖组成及物质的量比，
为苦荞多糖的进一步研究及开发提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
荞麦(采于凉山地区的苦荞麦)，晒干备用。
DEAE-纤维素(DE-52) 美国Whatman公司；1-苯
基 -3-甲基 -5-吡唑啉酮(PMP) 成都市科龙化工试剂厂；
乙腈(色谱纯) 上海陆都化学试剂厂；单糖对照品(D-葡
萄糖(Glc)、D-阿拉伯糖(Ara)、D-鼠李糖(Rha)、D-半
乳糖(Gal)、D-甘露糖(Man)、D-葡萄糖醛酸(GlcUA)、
D-(+)-半乳糖醛酸 -水(GalUA)) 国药集团化学试剂有限
公司；Dextran (T-10、T-40、T-70、T-500、T-2000)
Solarbio公司；其他试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
P680液相色谱仪、PDA-100二极管阵列检测器 戴
安(中国)有限公司；L-2000液相色谱仪、L-2490示差折
光检测器 Hitachi公司；旋转蒸发仪 瑞士Buchi公
司；GL-21M型高速冷冻离心机 长沙湘仪离心机仪器
有限公司；FD-1C-55型冻干机 北京博医康实验仪器有
限公司；BS-100A 自动部分收集器 上海青浦沪西仪器
有限公司。
1.3 方法
1.3.1 苦荞多糖的提取、分离与纯化
将苦荞于 70℃烘干 2h，粉碎；取苦荞粉末 100g，
5倍乙醇回流提取两次，每次 2.5h。抽滤后，取滤渣，
用 10倍水 100℃提取两次，每次 3h；合并提取液，浓
缩后加入乙醇，至乙醇体积分数为 80%为止。静置过
夜，离心后弃去上清液。Sevag法除蛋白，60℃烘干，
备用。
DEAE-纤维素柱(1.5cm× 20cm)蒸馏水平衡后，取
200mg苦荞多糖样品溶解于 20mL蒸馏水中上样，蒸馏
水洗脱 100mL后，以 0～3mol/L NaCl溶液梯度洗脱，
流速 1.0mL/min，每管收集 2mL，硫酸 -苯酚法显色检
测 [ 1 6 ]。透析冻干，备用。
1.3.2 多糖相对分子质量的测定
采用高效凝胶过滤色谱法(high performance gel filtra-
tion chromatography，HPGFC)。
1.3.2.1 色谱条件
色谱柱：YMC Pack-Diol 200(300mm× 8.0mm，
5μm，200A°)；流动相：蒸馏水；流速：0.8mL/min；柱
温：35℃；检测器：示差折光检测器；进样量：2 0μL。
1.3.2.2 标准曲线的制作
以葡萄糖及系列标准葡聚糖 T-10、T-40、T-70、
T-500、T-2000为标准品，分别用流动相溶解配制成
2mg/mL溶液进样，记录洗脱峰的保留时间。先用T-2000
洗脱测得外水体积 V0；再进葡萄糖标样，洗脱测得 V t；
然后分别用T-500、T-70、T-40、T-10的标准品相继进样，
分别求得它们的洗脱体积 Ve。相对分子质量Mw与其在凝
胶柱上的洗脱体积 V e、分配系数 K av 存在如下关系：
Ve＝a－blnMw (1)
Kav＝K1－K2lnMw (2)
Kav＝(Ve－V0)/(Vt－V0) (3)
式中：a 、b 、K1、K2 为常数。
以Kav(x)对 lnMw(y)进行线性回归处理，得线性回归
方程。
1.3.2.3 相对分子质量的确定
分别取苦荞多糖组分配制成 2mg/mL溶液，按1.3.2.1
节的条件进行色谱分析，记录样品保留时间。由样品
保留时间计算该苦荞多糖组分在凝胶柱上的洗脱体积
Ve，从而获得分配系数 K av。通过 1.3.2.2节的回归方程
即可得该苦荞多糖组分的相对分子质量Mw。
1.3.3 单糖组成测定
1.3.3.1 色谱条件
WondaSilTM C18色谱柱(4.6mm× 150mm，5μm)；
柱温：35.0℃；流动相：20mmol/L磷酸盐(pH6.72)缓冲
液 -乙腈(体积比为 82:18)；流速：1.0mL/min；检测波
长：2 5 0 n m。
1.3.3.2 对照品溶液的制备
分别取对照品甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半
乳糖醛酸各 0.025g，葡萄糖 0.800g、半乳糖 0.150g、阿
拉伯糖 0.050g，精密称量，用蒸馏水溶解，并转移至
1 0 m L 容量瓶中，定容至刻度，摇匀，即得。
1.3.3.3 衍生化标记
取单糖对照品混合溶液 500μL与 500μL 0.25mol/L
Na O H 溶液，置于 5m L 离心管中混匀，再加 500μL
0.25mol/L PMP甲醇溶液，涡旋混匀；70℃水浴反应
90min后，取出冷水浴 10min；加 500μL 0.3mol/L HCl
溶液中和，涡旋 2min 后，加 1mL 氯仿萃取 3 次。将
水相用 0.45μm微孔膜过滤后HPLC进样分析。
1.3.3.4 多糖的水解及衍生
分别取 5mL苦荞多糖组分样品(2mg/mL)于安瓿瓶
中，加 0.1mL 浓硫酸，充N2密封，120℃水解 4h，NaOH
溶液中和，离心得上清液[ 1 7 ]。
分别取上清液，按1.3.3.3节方法衍生化后进行HPLC
分析。
1.3.3.5 单糖物质的量比测定
分别取单糖对照品溶液配制成一系列不同浓度的混
合标样，按 1.3.3.3节方法衍生化，并在 1.3.3.1节所述
色谱条件下进样分析。以测得的各种糖的峰面积(y)对相
35※基础研究 食品科学 2011, Vol. 32, No. 19
应质量浓度(x )进行线性回归，制作标准曲线，获得回
归方程及线性范围。
苦荞多糖水解后，按1.3.3.3节方法衍生化，并在1.3.3.1
节所述色谱条件下进样分析，记录峰面积。采用组分单
糖峰面积及回归方程计算得苦荞多糖各单糖质量浓度。
2 结果与分析
2.1 苦荞多糖的提取、分离与纯化结果
采用1.3.1节方法提取、分离，Sevag法除蛋白，60℃
烘干即得苦荞多糖(tartary buckwheat polysaccharide，
TBP)，得率为 6.84%。
由图1可知，分别合并12～20管、56～62管、63～78
管，透析得苦荞多糖3个组分：TBP-1、TBP-2、TBP-3。
TBP-1由蒸馏水洗脱，初步判断为中性多糖。TBP-2和
TBP-3为 NaCl溶液梯度洗脱，为酸性多糖成分。透析
冻干，备用。
2.2 多糖相对分子质量测定结果
不同相对分子质量标准葡聚糖 HPGFC分析结果见
表 1 。
标准品 相对分子质量 保留时间 /min
Glc 198 13.940
T-10 10000 10.537
T-40 40000 8.747
T-70 70000 8.180
T-500 500000 6.377
T-2000 2000000 5.387
表 1 标准样品的 HPGFC保留时间
Table 1 HPGFC retention times of standard samples with different
molecular weights
将苦荞多糖样品在相同色谱条件下进样分析，TBP-1、
TB P- 2 和 TB P -3 的洗脱峰形对称，保留时间分别为
7.547、6.352min和 5.973min。由样品保留时间计算该苦
荞多糖组分在凝胶柱上的洗脱体积 Ve，从而获得分配系
数Kav。通过线性回归方程 y＝－ 3.497x＋ 6.0431(r＝
0.9949)，即可获得苦荞多糖组分 TBP-1、TBP-2和TBP-3
的相对分子质量(Mw)分别为 144544、445656和 636795。
2.3 单糖组成分析结果
2.3.1 对照品 PMP衍生物的分离
将 5种单糖和 2种糖醛酸的混合标样，按 1.3.3.3节
衍生化，并在 1.3.3.1节所述色谱条件下进样检测。结
果见图 2，5种单糖和 2种糖醛酸的 PMP衍生物实现了
良好的分离。
2.3.2 各单糖的标准曲线
将 5种单糖和 2种糖醛酸配制成一系列不同质量浓
度的混合标样，按 1.3.3.3节衍生化，并在 1.3.3.1节所
述色谱条件下进样检测。以测得的各种糖的峰面积 y对
相应质量浓度 x 进行线性回归得各单糖标准曲线、相关
系数及线性范围见表 2。
单糖 线性范围 /(mg/mL) 标准曲线 相关系数 r
甘露糖 0.0036～0.1071 y＝ 312.16x－ 0.0018 0.9996
鼠李糖 0.0036～0.1071 y＝ 203.08x－ 0.0987 0.9996
葡萄糖醛酸 0.0036～0.1071 y＝ 217.13x＋ 0.0572 0.9996
半乳糖醛酸 0.0036～0.1071 y＝ 420.88x－ 0.7615 0.9989
葡萄糖 0.1143～3.4286 y＝ 79.78x－ 3.3027 0.9998
半乳糖 0.0214～0.6429 y＝ 238.39x－ 1.654 0.9998
阿拉伯糖 0.0071～0.2143 y＝ 482.85x－ 1.133 0.9993
表 2 5 种单糖和 2 种糖醛酸的标准曲线
Table 2 Regression equations and linear ranges of 5 monosaccharides,
glucuronic acid and galacturonic acid
2.3.3 苦荞多糖的 PMP衍生物分析
分别取 5mL苦荞多糖组分 TBP-1、TBP-2和 TBP-3
样品，按 1.3.3.4节方法水解并衍生后，进行 HPLC分
析。结果分别见图 3。
将 TBP-1、TBP-2和 TBP-3水解产物的 PMP衍生物
色谱图与混合标准单糖 PMP衍生物的色谱图对照，可
图 1 苦荞多糖 DEAE-纤维素柱层析的洗脱曲线
Fig.1 Elution curve of TBP on DEAE-cellulose column
5
4
3
2
1
0
－1
TBP-1
A
49
0n
m
管号
0 20 40 60 80 100
TBP-2
TBP-3
1.1-苯基 -3 -甲基 -5 -吡唑啉酮；2.甘露糖；3.鼠李糖；4.葡萄
糖醛酸；5 .半乳糖醛酸；6 .葡萄糖；7 .半乳糖；8 .阿拉伯糖。
图 2 混合标准单糖 PMP衍生物的 HPLC图
Fig.2 HPLC chromatogram of PMP derivatives of mixed standard
monosaccharides
400
300
200
100
－30
1
m
A
U
时间 /min
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0
2
3 4 5
6
7
8
2011, Vol. 32, No. 19 食品科学 ※基础研究36
以确定 TBP-1和 TBP-2由葡萄糖组成；TBP-3由甘露糖、
鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖
组成。由峰面积及标准曲线回归方程计算得 TBP-3各单
糖质量浓度，与物质的量之比得各单糖物质的量浓度，各
单糖物质的量浓度之比即为物质的量比。可得，TBP-3中
甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、
阿拉伯糖的物质的量比为4.32:2.41:1.00:39.8:9.64:2.02。
明去除效果较好。用DEAE-纤维素柱层析，可分离得到
TBP-1、TBP-2和TBP-3三个苦荞多糖组分。根据DEAE-纤
维素的性质、洗脱液的性质及洗脱体积，可判断TBP-1为
中性多糖组分，TBP-2和 TBP-3为酸性多糖组分。
多糖相对分子质量只代表相似链长的平均分布而不是
确切的分子质量大小，所以多糖相对分子质量的测定没有
一种绝对的方法，采用不同的方法会得到不同的相对分子
质量。此外，不同的品种、产地、制备和检测方法，
也会得到不同的分子质量分布。本研究采用HPGFC法测定
苦荞多糖TBP3个组分的相对分子质量，TBP-1、TBP-2和
TBP-3相对分子质量分别为 144544、445656、636795。
采用 PMP柱前衍生 HPLC分析苦荞多糖的单糖组
成，5种单糖和两种糖醛酸的衍生物分离度良好。在此
条件下测定，TBP-1和 TBP-2是由葡萄糖组成的均一多
糖；T B P - 3 由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄
糖、半乳糖、阿拉伯糖组成的杂多糖，其物质的量比
为4.32:2.41:1.00:39.8:9.64:2.02。
通过标准曲线可以发现，检测器对各单糖类物质衍
生物的响应因子不同，不能简单地采用面积归一化法进
行单糖组成物质的量比的计算。在数据处理中采用标准
曲线计算得各单糖物质的量浓度，各单糖物质的量浓度
之比即为物质的量比。
参 考 文 献 ：
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1.1-苯基 -3 -甲基 -5 -吡唑啉酮；2.葡萄糖。
500
400
300
200
100
－50
2
m
A
U
时间 /min
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0
1
a
1.1-苯基 -3 -甲基 -5 -吡唑啉酮；2.葡萄糖。
500
400
300
200
100
－50
2
m
A
U
时间 /min
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0
1
b
1.1-苯基 -3-甲基 -5-吡唑啉酮；2. 葡萄糖；2＇. 甘露糖；3.鼠李糖；4.
葡萄糖醛酸；5.半乳糖；6.阿拉伯糖。a. TBP-1；b.TBP-1；c.TBP-1。
图 3 TBP-1, TBP-2, TBP-3水解产物的 PMP衍生物的 HPLC图
Fig.3 HPLC chromatogram of PMP derivatives of TBP-1, TBP-2 and
TBP-3 hydrolysis products
200
150
100
50
－10
m
A
U
时间 /min
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0
1
2＇
3 4
2
5
6
c
3 讨 论
在多糖提取方法中，采用乙醇先回流提取。这样可
以使大分子蛋白质变性，同时脂肪和色素留在乙醇溶液
中。然后加水浸提多糖，这样所得的多糖色白。用 Sevag
法脱蛋白，需要重复多次才能去除多糖中所含的杂蛋
白。实验中采用 5次 Sevag法脱蛋白，紫外扫描检测表
. .