全 文 ： 野扁桃 ISSR-PCR反应体系的优化
罗淑萍 1 ,曾　斌 2 ,孙晋科 1 ,李　疆 2
( 1.新疆农业大学 生命科学系 ,新疆 乌鲁木齐 830052; 2.新疆农业大学 园艺学院 ,新疆 乌鲁木齐 830052)
摘　要: 以野扁桃为材料 ,对影响 IS SR-PCR扩增结果的 Mg2+ 、 dN TPs、 Taq酶、模板 DNA、引物等因素进
行筛选和优化 ,确立了适合野扁桃 IS SR分析的最佳反应体系: 25μL PCR反应体系中包含 1× Buf fer,
2. 0 mm ol· L- 1Mg2+ , 160μmol· L- 1 dN TPs,模板 DNA30 ng, Taq聚合酶 1 U,引物 15 pmol。
关键词: 野扁桃 ; IS SR;反应体系
中图分类号: S662. 9　　　文献标识码: A　　　文章编号: 1003- 8981( 2007) 03- 0001- 05
Optimization of ISSR-PCR Reaction System
in Amygdalus Ledebour iana Schleche
LUO Shu-ping1 , ZENG Bin2 , SUN Jin-ke1 , LI Jiang2
( 1. Life and Science Co lleg e; 2. Ho rticultural Colleg e,
Xinjiang Ag ricultural Univ e rsity , U rumqi 830052, Xinjiang , China )
Abstract: Some influencing facto r s on ISSR-PCR analysis, such as Mg2+ , dN TPs, Taq
po lymerase, templa te DNA and primer , w ere selected and optimized, using Amygdalus
Ledebouriana Schleche as ma teria ls. The optimal ISSR-PCR reac tion sy stem fo r A .
Ledebouriana Schleche was de termined a s fo llow s: 1× buffe r, 2. 0 mmol· L- 1 Mg2+ and 160
μmol· L- 1 dN TPs, 30 ng template DNA, 1U Taq po lymerase, 15 pmo l prim er in 25μL PCR
reac tion system.
Key words: Amygdalus Ledebouriana Schleche; ISSR; r eaction sy stem
野扁桃 ( Amygdalus Ledebouriana Schleche)为蔷薇科李亚科桃属扁桃亚属植物 ,它原产于欧洲东南部、亚
洲中西部 ,而现在的欧洲已无分布 ,多呈化石。 在我国主要分布于新疆维吾尔自治区塔城地区裕民县境内巴尔
鲁克山的山地草原上 ,是残遗的稀有古植物树种 ,其中有 400 hm2连片成林的新疆维吾尔自治区野扁桃自然保
护区 ;野扁桃还零星分布于塔城县、托里县以及阿尔泰山脉布尔津县和哈巴河流域。野扁桃是研究植物系统发
育、形态演化及地理区系的重要材料 [1～ 3 ]。
简单重复序列区间 ( inter simple seuquence repeat , ISSR) ,是利用 16～ 25 bp个碱基的重复 ,锚定引物扩增
SSR之间的片段 ,具有重复性好、稳定性高 ,多态性丰富 , DN A用量少 ,成本低等特点 ,目前 ISSR技术已广泛应
用于品种鉴定、遗传作图、基因定位、分类、进化及遗传多样性等方面的研究 [4, 5 ]中。文中以新疆野扁桃基因组
DNA为模板 ,探讨了 ISSR-PCR反应体系中 5种因素对扩增的影响 ,以期获得野扁桃 ISSR扩增的最佳反应体
系 ,为新疆野扁桃资源遗传多样性的研究奠定基础。
经济林研究　 2007, 25( 3): 1-5
Nonwood　 Forest　 Research 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
收稿日期: 2007-03-07
基金项目: 国家自然科学基金项目“扁桃结实率低的生理机制研究” ( 30460115)和新疆教育厅高校科研计划重点项目 “新疆野扁桃种质
资源的研究” ( X JEDU2006I26)。
作者简介: 罗淑萍 ( 1962- ) ,女 ,甘肃武威人。 副教授 ,硕士生导师 ,主要从事生物化学与分子生物学的教学与科研工作。
通讯作者: 李　疆 ( 1959- ) ,男 ,湖南邵东人。 教授 ,博士生导师 ,研究方向为果树栽培生理和种质资源。
Tel: 0991- 8762363, E-mai l: lijiangx j@ 163. com。
DOI : 10. 14067 /j . cnki . 1003 -8981. 2007. 03. 004
1　材料与方法
1. 1　材　料
试验材料采集于新疆塔城地区裕民县巴尔鲁克山的野扁桃自然保护区。
1. 2　试　剂
引物购自上海生工生物工程有限公司 , Taq聚合酶、 PCR反应缓冲液、 dN T PS均为北京天为时代科技有
限公司的产品。
1. 3　方　法
1. 3. 1　 DN A的提取与检测
以野扁桃叶片为材料 ,参照并略作修改有关文献 [6～ 8 ]中提出的方法用以提取 DNA。用紫外吸收法测定提取
后的 DNA的浓度 ,用琼脂糖凝胶电泳仪检测 DNA的质量 ,用于 ISSR-PCR扩增反应。
1. 3. 2　 ISSR-PCR初始条件及扩增程序
根据本实验室建立的扁桃 RAPD反应体系 ,参照相关文献 [9～ 12]中的 ISSR反应体系 ,野扁桃 ISSR-PCR
初始 25μL反应体系包含: 1× Buf fer, 1. 0 mmol· L- 1 Mg2+ , 160μmo l· L- 1 dN T Ps,引物 10 pmol, Taq酶
0. 5 U, DN A模板 30 ng。 在美国 BIO-RAD公司生产的 PCR仪上进行扩增反应。扩增程序为: 94℃预变性 ,
5 min, 94℃变性 45 s, 49℃复性 45 s, 72℃延伸 90 s,共 40个循环后 , 72℃延伸 7 min。
1. 3. 3　 ISSR-PCR反应体系的优化
ISSR的技术操作快速简便 ,但是 PCR扩增涉及到的反应因素多 ,对反应条件敏感 ,任何一种反应因子设
置不当都会影响整个扩增反应过程。 因此 ,对不同的研究对象 ,不同的 PCR反应仪器 ,必须摸索其最佳反应条
件 ,为确保试验的准确性和可重复性 ,在初始实验的条件上获得稳定的 ISSR标记 ,必须对 ISSR反应条件逐一
进行筛选 ,以建立优化的反应体系 [13～ 15 ]。
表 1　野扁桃 ISSR-PCR体系优化的因素与水平
水平 Mg2+ 浓度
/ ( mmol· L- 1 ) dN T Ps
浓度
/(μmol· L- 1) Taq
酶用量
/U
模板 DN A用量
/ng
引物用量
/pmol
1 0. 5 80 0. 25 10 5
2 1. 0 160 0. 50 30 10
3 1. 5 240 0. 75 50 15
4 2. 0 320 1. 00 70 20
5 2. 5 400 1. 25 90 25
下面就本试验筛选出的 10个 ISSR
引物中的 I2引物对影响 ISSR-PCR扩增
反应的因素如模板 DNA、 Mg2+ 、 dN T P、
引物、 Taq酶用量等 5个因素各 5个水平
进行试验研究 ,各反应参数变化量如表 1
所示。退火温度的确定参照各引物的 Tm
值 ,每次设置 8个温度梯度 ,采用梯度
PCR进行退火温度筛选。
1. 3. 5　 ISSR-PCR产物检测
扩增产物用 1. 5%琼脂糖凝胶电泳分离 ,电压为 5 V /cm , EB染色。电泳结束后在紫外凝胶成像系统 ( UV P
GDS- 8000)上观察并拍照。
2　结果与分析
2. 1　 Mg2+ 的浓度对 ISSR扩增的影响
Mg
2+ 是 Taq聚合酶的活性剂 ,能够增强酶蛋白的稳定性 ,对 PCR扩增有明显的影响。 在野扁桃的 ISSR-
PCR反应中 , Mg2+浓度的变化对 ISSR扩增条带的数量和强弱的影响较大。 实验结果表明:当 Mg2+的浓度在
0. 5 mmo l· L- 1时 ,扩增条带数目较少 ,背景模糊难辨 ;当 Mg2+的浓度为 1. 0～ 1. 5 mmol· L- 1时 ,扩增条带数
目和亮度均有增加 ;当 Mg2+的浓度增加至 2. 0 mmol· L- 1时 ,扩增条带数目多且清晰稳定。而当 Mg2+ 的浓度增
加至 2. 5 mmol· L- 1时 ,扩增条带数目减少 ,亮度减弱 (如图 1所示 )。因此 ,试验中选择了较为适宜的 Mg2+ 的浓
度 ,即为 2. 0 mmo l· L- 1。
2. 2　dN T Ps的浓度对 ISSR扩增的影响
dN TPs是 PCR的原料 ,其浓度变化对 ISSR带的数量和强弱的影响较大。不同 dN T Ps的用量对扩增结果
的影响如图 2所示。由图 2可知:当 dN TPs的浓度为 80μmol· L- 1时 ,扩增条带数目较少 ;而当浓度增加到
160μmol· L- 1时 ,扩增条带数目多 ,谱带清晰 ;当 dN T Ps的浓度达到 240～ 400μmol· L- 1时 ,扩增条带数目不
2 经　　济　　林　　研　　究 第 25卷　
变 ,亮度均依次递减。 因此 ,选择的 dN TPs的浓度以 160μmo l· L- 1较为适宜。
图 1　不同 Mg Cl2用量对
扩增结果的影响
图 2　不同 dN TP用量对
扩增结果的影响
2. 3　 Taq聚合酶单位对 ISSR扩增的影响
Taq聚合酶的用量对试验结果的影响也较大。酶的用量过高不仅使成本提高 ,而且会产生非特异性的扩增产
物 ;酶的用量过低则会使酶过早地消耗完 ,产物合成效率低。 Taq聚合酶的用量对扩增结果的影响如图 3所示。从
图 3中可以看出:当 25μL反应体积中 , Taq聚合酶单位为 0. 25 U时 ,扩增条带较弱 ;当 Taq聚合酶的单位增加至
0. 5～ 0. 75 U时 ,条带亮度渐趋增加。 而 Taq聚合酶的单位增加至 1. 0 U时 ,谱带最清晰 ,效果最佳。增加至
1. 25 U时 ,条带数减少 ,背景模糊不清晰。因此 ,在 25μL反应体积中最合适的 Taq聚合酶的用量为 1. 0 U。
2. 4　模板 DNA用量对 ISSR扩增的影响
作为 PCR扩增的 DNA模板的用量是影响 ISSR-PCR扩增的重要因素之一。DNA用量过少 ,扩增产物少或
无扩增产物 ; DN A用量过多 ,又会相应增加非特异性产物 ,模板 DNA用量的变化对野扁桃 ISSR带的数量和强
弱的影响较大。不同模板 DNA用量对扩增结果的影响如图 4所示。图 4显示:当模板 DNA的用量为 10 ng时 ,
条带数目较少 ;当模板 DNA用量为 30 ng时 ,可扩增的条带最多且清晰明亮 ;模板 DNA用量为 50～ 90 ng时 ,
扩增条带数逐渐减少 ,大片段缺失。 因此 ,模板 DNA的用量以 30 ng最为适宜。
图 3　不同 Taq聚合酶用量对
扩增结果的影响
图 4　不同模板 DN A用量对
扩增结果的影响
3第 3期 罗淑萍等:野扁桃 ISSR-PCR反应体系的优化
2. 5　引物浓度对 ISSR扩增的影响
作为 PCR扩增体系中的重要组成成分——引物的不足会导致扩增产物偏少 ,而过多的引物又会引起非特
异扩增。试验中引物浓度的变化对 ISSR带的数量和强弱影响较为明显 ,如图 5所示。从图 5中可以看出: 当引
物浓度为 5 pmo l时 ,条带数目较少 ,亮度较低 ;当引物浓度升高到 10 pmo l时 ,条带数目和亮度增加 ;当引物浓
度为 15 pmol时 ,扩增条带数最多效率最高 ,谱带清晰。当引物浓度升高到 20 pmol时 ,条带亮度减弱 ;当引物浓
度为 25 pmol时 ,条带数目和亮度都较低 ,背景模糊。因此 ,试验中选择了 15 pmol为引物的适宜浓度。
2. 6　退火温度对 ISSR-PCR扩增的影响
不同引物退火温度不同 ,而同一引物对于不同的物种 ,退火温度可能不同 ,退火温度对 ISSR-PCR的稳定
性的影响较大。
为了确定所选引物各自最佳的退火温度 ,我们参照各引物的 Tm值 ,设置 8个温度梯度。图 6显示了引物 I21
的 8个退火温度 ( 37. 0、 37. 8、 39. 2、 41. 4、 44. 2、 46. 5、 48. 0、 49. 0℃ )的 ISSR-PCR扩增情况。在退火温度分别为
37. 8、 39. 2、 41. 4℃时 ,扩增条带清晰 ,多态性好 ;当温度高于 44. 2℃时 ,大片段条带缺失 ,背景模糊。 因此 ,野
扁桃 ISSR反应体系中引物 I21最适宜的退火温度为 41℃。
图 5　不同引物浓度用量对
扩增结果的影响
图 6　不同退火温度对
扩增结果的影响
图 7　优化的 ISSR体系对 10份扁桃材料的扩增结果 (引物 I76 )
2. 7　 ISSR-PCR优化体系的验证
综上所述 ,影响 ISSR-PCR扩增结果的因子很多 ,为
了利用该分子标记对其进行遗传多样性分析 ,获得稳定、
可靠及重复性较高的 ISSR图谱 ,提高分析的准确性 ,本
实验研究对其影响因素进行优化 ,筛选出了最适宜的
ISSR条件。并利用该优化的 ISSR-PCR反应体系 ,以筛
选出的 ISSR引物 I76对 10份扁桃材料进行扩增 ,得到了
清晰、多态性高的 ISSR谱带 (如图 7所示 ) ,并具有较好
的重复性 ,说明建立的体系稳定可靠。
3　讨论与结论
扁桃 ( Amygdalus communis L. ) ,又名巴旦杏 ,和野扁桃同属于蔷薇科桃属扁桃亚属植物 ,是世界著名干
果和木本油料树种 ,具有极高的营养及药用价值 ,其栽培面积、产量及贸易量均居世界干果之首 [15, 16 ]。 我国除
新疆南部有集中分布外 ,其它省区尚未形成规模生产 [17, 18 ]。 对野扁桃种质资源及其近缘栽培种扁桃的亲缘演
化关系进行评价 ,可为科学保护和利用野扁桃种质资源、改良栽培种及选育抗逆新品种提供理论依据 [3 ]。
本研究以野扁桃 DNA为材料 ,建立了重复性好 ,分辨率高的 ISSR反应体系 ,即在 25μL反应体系中 ,包含
1× Buf fer, 2. 0 mmo l· L- 1 Mg2+ , 160μmol· L- 1 dN TPs,模板 DNA30 ng , Taq聚合酶 1 U,引物 15 pmo l。扩增
4 经　　济　　林　　研　　究 第 25卷　
程序为: 94℃预变性 5 min, 94℃变性 45 s, 49℃复性 45 s, 72℃延伸 90 s,循环 40次 ,最后 72℃延伸 7 min, 4℃保
存。利用该优化的 ISS R-PCR反应体系对 10份扁桃材料进行扩增 ,得到了清晰、多态性高、重复性好的 ISSR谱
带 ,这说明建立的体系稳定可靠。
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[本文编校:伍敏涛 ]
5第 3期 罗淑萍等:野扁桃 ISSR-PCR反应体系的优化