全 文 ：31 卷 08 期
Vol． 31，No． 08
草 业 科 学
PＲATACULTUＲAL SCIENCE
1475 － 1480
08 /2014
DOI:
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10． 11829 \ j． issn． 1001-0629． 2013-0458
植物
生产层
无芒隐子草 CsLEA基因超表达载体和
反义表达载体构建
段 珍，狄红艳，张吉宇，霍雅馨，孔令芳
(草地农业生态系统国家重点实验室 兰州大学草地农业科技学院，甘肃 兰州 730020)
摘要:根据已克隆出的无芒隐子草(Cleistogenes songorica)晚期胚胎发生丰富蛋白基因 CsLEA(GenBank 序列号为
FJ972827)基因和植物表达载体的酶切位点特征，分别将 CsLEA基因编码区序列 480 bp正向和反向插入 pBI121，
构建了超表达载体 pBI121 35S::CsLEA和反义表达载体 pBI121 35S::AS-CsLEA。电击法转入根癌农杆菌 GV3101
中，并通过花粉管通道法转化拟南芥(Arabidopsis thaliana) ，经卡那霉素抗性筛选和 PCＲ 鉴定，已获得 T1 代阳性
植株。
关键词:CsLEA基因;超表达载体;反义表达载体;拟南芥
中图分类号:S543 + . 903;Q943． 2 文献标识码:A 文章编号:1001-0629(2014)08-1475-06*
Construction of the over and antisense expression vector of CsLEA gene
DUAN Zhen，DI Hong-yan，ZHANG Ji-yu，HUO Ya-xin，KONG Ling-fang
(State Key Laboratory of Graaland Agro-ecosystems，College of Pastoral Agriculture Science and
Technology，Lanzhou University，Lanzhou 730020，China)
Abstract:According to the restriction enzyme sites of plant expression vector and sequence of CsLEA gene from
Cleistogenes songorica，over expression vector was recombined by inserting the open reading frame (OＲF)sequence
to pBI121，and the antisense plant expression vector was constructed by ligating 480 bp sequence of CsLEA gene to
pBI121 in the antisense orientation． Moreover，the recombined plasmid was transformed into Agrobacterium tumefa-
ciens GV3101 by electroporation method． Using pollen-tube pathway，the plasmid was transformed into Arabidopsis
thaliana and T1 positive plants were obtained by kanamycin resistance selection and PCＲ confirmation．
Key words:CsLEA gene;over expression vector;antisense expression vector;Arabidopisis thaliana
Corresponding author:ZHANG Ji-yu E-mail:zhangjy@ lzu． edu． cn
LEA 蛋白(Late Embryogenesis Abundant Pro-
teins，LEA)是生物体中广泛存在的一类与渗透调节
有关的家族蛋白［1］，该蛋白的编码基因在植物种子
胚胎发育晚期表达量丰富［2］，而且在植物受到干
旱、低温和盐渍等逆境状态下能够大量表达［3］，通
过积累细胞内高浓度离子避免干旱胁迫时引起的损
伤。LEA蛋白作为一种脱水保护蛋白，特别在脱水
组织中被认为是分子伴侣［4］，具有很强的亲水性和
热稳定性［5］，能够在干旱胁迫条件下保护生物大分
子，尤其是保持生物膜结构的稳定性，从而减轻干旱
造成的伤害［6］。
大量研究表明，LEA 蛋白基因的超表达可以提
高转基因植物在非生物胁迫下的抗逆性［7］。例如，
大麦(Hordeum vulgare)LEA(HVA1)的超表达可以
* 收稿日期:2013-08-14 接受日期:2013-11-29
基金项目:国家自然科学基金(31101759) ;甘肃省农业生物技术研究与应用开发项目(GNSW-2011-16) ;长江学者和创新团队发展计划
(IＲT13019)
第一作者:段珍(1989-) ，女，甘肃民勤人，在读硕士生，主要从事分子生物学研究。E-mail:duanzhensmiling@ 163． com
通信作者:张吉宇(1977-) ，男，甘肃民乐人，副教授，博士，主要从事牧草育种与分子生物学研究。E-mail:zhangjy@ lzu． edu． cn
PＲATACULTUＲAL SCIENCE(Vol． 31，No． 08) 08 /2014
提高转基因水稻(Oryza sativa)的耐盐性［8］;马铃薯
(Solanum sogarandinum)的第 2 族 LEA蛋白 DHN24
的超表达显著提高黄瓜(Cucumis sativus)转基因株
系的抗寒性［9］;小麦(Triticum aestivum)LEA(Ta-
LEA2)基因转入拟南芥(Arabidopsis thaliana) ，适当
干旱处理使转基因拟南芥的生长状况明显优于野生
型，说明在一定范围内转基因植株的耐旱性提
高［10］。反义 ＲNA技术是近年来发展起来的生物技
术，反义 ＲNA 可以通过碱基配对的方式与靶 ＲNA
的特定互补区域结合，控制基因的表达和参与基因
表达的调控，从而抑制基因的正常表达，因此，反义
ＲNA编码的 DNA 是高度特异性的基因表达抑制
子［11］。
无芒隐子草(Cleistogenes songorica)是禾本科隐
子草属多年生旱生草本植物［12］，是荒漠草原建群种
和优势种［13-14］，在草原化荒漠则成为伴生种和亚优势
种［13］。在长期的进化过程中，已经演化形成一套适
应水分亏缺的机制和策略，具有很强的抗旱性［15］。
Zhang等［16］已从无芒隐子草中克隆出 CsLEA 基因并
转入拟南芥中以 rd29A 启动子诱导表达提高了拟南
芥抗逆性，但关于 CsLEA基因超表达和反义表达的研
究未见相关报道。本研究利用基因超表达和反义抑
制的原理，构建组成型表达启动子驱动 CsLEA基因的
超表达和反义表达载体，并进行拟南芥转化，以期为
CsLEA基因的功能验证奠定基础。
1 材料与方法
1． 1 供试的菌株、载体及试剂
试验用的菌株主要有大肠杆菌 DH5α、农杆菌
GV3101。载体 pGEM-T Vector 购自 Promega 公司，
载体 PBI121 由笔者所在实验室提供。
Ex Taq 酶、buffer、dNTP 等 PCＲ 试剂、T4 DNA
连接酶、DNA Marker DL2000、限制性内切酶均购于
Takara公司。DNA片段回收采用 OMEGA公司的琼
脂糖凝胶 DNA回收试剂盒。DNA 提取使用天根生
化科技(北京)有限公司的植物基因组 DNA 提取试
剂盒。引物由上海生工生物工程公司合成。卡那霉
素(Kanamycin，Kan)、庆大霉素(Ｒentamicin，Gm)、
利福平(Ｒifampin，Ｒif)等抗生素购自上海生物工程
技术有限公司。
1． 2 目的片段的选取及引物设计
基于 NCBI发表的无芒隐子草 CsLEA 基因序列
和植物表达载体 pBI121 的酶切位点，利用 DNA-
MAN软件设计 CsLEA 基因带酶切位点的引物。构
建超表达载体设计引物时，5’端含有 BamH I 位点，
3’端含有 Sac I位点，扩增片段长度约为 480 bp。设
计引物为:
上游引物 CsLEA_35S_BamH I_F:GCGGGATC-
CATGGAGCACCAGGGACGGTAC
下游引物 CsLEA_35S_Sac I_Ｒ:GCGGAGCTCT-
TAGGGCTGGCCGGGGAG
构建反义表达载体设计引物时，5’端含有 Sac I
位点，3’端含有 BamH I 位点，与植物表达载体
pBI121 的酶切位点反向对应，扩增片段长度约为
480 bp。设计引物为:
上游引物 AS-CsLEA_35S_Sac I_F:GCGGAGCT-
CATGGAGCACCAGGGACGGTAC
下游引物 AS-CsLEA_35S _BamH I _Ｒ:GCGG-
GATCCTTAGGGCTGGCCGGGGAG
1． 3 目的片段的扩增
PCＲ 反应体系 25 μL，包含 1 μL 模板(125
ng·μg －1) ，2． 5 μL的 10 × PCＲ 缓冲液，2 μL的2． 5
mmol·L －1 dNTP，1． 0 μL 5 U Ex Taq 酶，10 μmol·
L －1的上、下引物各 1． 0 μL，ddH2O 补足至 25 μL。
扩增条件为:1)94 ℃预变性 3 min，2)94 ℃变性 30
s，3)67 ℃退火 45 s，4)72 ℃延伸 1 min，5)2 ～ 4 步
骤 32 个循环，6)72 ℃延伸 10 min。PCＲ 扩增产物
经 1． 2%的琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察并照相
记录。
1． 4 PCＲ产物的克隆与测序
将扩增出的产物用 DNA 琼脂糖凝胶回收试剂
盒(OMEGA BIO-TEK 公司的 Gel Extraction Kit)回
收，连接 PGEM-T Easy Vector，4 ℃过夜，转化大肠杆
菌 DH5a感受态细胞，在含 X-gal和 IPTG的 Amp 平
板上筛选阳性质粒，经菌落 PCＲ鉴定后送往上海生
物工程技术有限公司测序。
1． 5 正义、反义表达载体构建
用 BamH I和 Sac I 分别对阳性质粒和 pBI121
酶切，回收目的片段并测定含量，将酶切后的 CsLEA
基因与 pBI121 载体按照摩尔比 3∶ 1 混合，与 16 ℃
连接 4 h，转化大肠杆菌感 DH5α受态细胞。在含有
50 μg·mL －1卡那霉素的 LB 平板上进行筛选阳性
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克隆。挑取阳性克隆进行培养，用菌落 PCＲ初步筛
选阳性重组质粒，将 PCＲ鉴定为阳性的克隆提取质
粒进行双酶切鉴定。
1． 6 根癌农杆菌的转化及农杆菌菌液 PCＲ检测
采用电击法将筛选到的阳性克隆转化至农杆
菌 GV3101，并用菌落 PCＲ 方法检测阳性转化菌
株。PCＲ反应体系如下:1． 0 μL 的 10 × PCＲ 缓冲
液(Mg2 + Plus) ，0． 8 μL 的 dNTP Mixture(2． 5
mmol·L － 1) ，0． 5 μL 的菌液，10 μmol·L － 1的上、
下引物各 0． 5 μL，2． 5 U·10 μL － 1的 Taq 酶 0． 1
μL，ddH2O补足至 10 μL。扩增条件为:1)94 ℃预
变性 2 min，2)94 ℃变性 30 s，3)56 ℃退火 45 s，
4)72 ℃延伸 1 min，5)2 ～ 4 步骤 32 个循环，6)72
℃延伸 5 min。PCＲ 反应结束后，用 1． 2%的琼脂
糖凝胶电泳检测扩增效果及判断扩增产物的分子
量大小。
1． 7 CsLEA基因对拟南芥的遗传转化及转基因植
株的 PCＲ检测
通过花粉管通道法［17］转化拟南芥，使外源
DNA在授粉后通过花粉管进入胚囊，最终整合到植
物基因组中。花序浸染两次后，使拟南芥在恒温室
中正常生长，待种子成熟收取种子，将收获的种子在
4 ℃放置 2 周后将种子种在含抗生素的 MS 培养基
中进行筛选，约 1 周后可筛选到阳性植株，将抗生素
筛选出的阳性植株移到土壤中，待植株长大后进行
检测。提取阳性植株的叶片 DNA，以正向和反向插
入片段的特异引物进行 PCＲ检测，以野生型拟南芥
DNA为对照。
2 结果与分析
2． 1 目的片段的扩增
以 CsLEA_35S_BamH I_F，CsLEA_35S_Sac_I Ｒ
和 AS-CsLEA_35S_Sac I_F，AS-CsLEA_35S_BamH I_Ｒ
分别为正向和反向的引物对含全长 CsLEA 基因的
质粒进行扩增后，均获得了 480 bp 的目的条带(图
1)。连接 T 载体后送交测序，结果正确，可用于植
物表达载体的构建。
2． 2 重组质粒的构建和鉴定
用 BamH I、Sac I 酶切质粒 pBI121 回收12 946
bp 左 右 的 载 体 大 片 段，酶 切 pGEM-CsLEA
和 pGEM-AS-CsLEA，回收480 bp片段，并与载体
图 1 CsLEA基因带酶切位点的 PCＲ产物
Fig． 1 PCＲ product of CsLEA gene with
restriction enzyme sites
注:a，正向 CsLEA基因序列带酶切位点的 PCＲ 产物;b，反向 CsLEA
基因序列带酶切位点的 PCＲ产物;M，DL2000 DNA Marker;(－) ，阴
性对照。
Note:a，n orientation of PCＲ product of CsLEA gene with restriction en-
zyme sites;b，u orientation of PCＲ product of CsLEA gene with restriction
enzyme sites;M，DL2000 DNA Marker; (－) ，negative control．
大片段连接，用 BamH I、Sac I 酶切鉴定，可分别切
出 12 946 和 480 bp的两条带，表明载体构建正确，
重组质粒命名为 pBI121 35S::CsLEA 和 pBI121
35S::AS-CsLEA(图 2)。其上均含有 35S 启动子调
控的 CsLEA基因，可用于转化农杆菌。
2． 3 农杆菌的转化及鉴定
用电击法将表达载体 pBI121 35S::CsLEA 和
pBI121 35S::AS-CsLEA 转入农杆菌 GV3101，并在
LB 固体培养基(含 Kan 50 mg· L －1 + Gm 50
mg·L －1 + Ｒif 50 mg·L －1)上筛选阳性克隆，然后
分别以转化后的农杆菌单菌落为模板，利用正向和
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反向插入片段扩增引物进行 PCＲ 扩增(图 3) ，单菌
落均扩增出与预期序列大小一致的目的条带，阴性
对照无条带。可以证明重组质粒已转入根癌农杆菌
中。
2． 4 农杆菌介导的遗传转化及阳性植株检测
通过花粉管通道法将超表达表达载体 pBI121
35S::CsLEA 和反义表达载体 pBI121 35S::AS-Cs-
LEA转化拟南芥，将收获的种子铺于含 Kan 的 MS
培养基上进行抗性筛选，移栽具有抗性的转化植株
幼苗在土壤介质中生长。分别获得 pBI121 35S::
CsLEA和 pBI121 35S::AS-CsLEA 的转化植株，提取
转化植株的叶片 DNA，分别用 CsLEA基因的正向和
反向插入片段扩增引物进行 PCＲ 扩增，均得到 480
bp左右的与预期序列大小一致的目的条带(图 4) ，
初步证明目的片段已转入拟南芥植株中。
图 2 植物表达载体双酶切凝胶电泳图
Fig． 2 Agarose gel electrophoresis of double digestion vector
注:M，DL2000 DNA Marker;(+) ，酶切前重组质粒 recombined plasmid before digestion．
图 3 植物表达载体导入农杆菌的 PCＲ检测
Fig． 3 Detecting of PCＲ products for plant expression vector into Agrobacterium
注:a，pBI121 35S::CsLEA农杆菌菌液 PCＲ结果;b，pBI121 35S::AS-CsLEA农杆菌菌液 PCＲ结果;M，DL2000 DNA Marker;(－) ，阴性对照。
Note:a，PCＲ amplification of Agrobacterium solution with pBI121 35S::CsLEA;b，PCＲ amplification of Agrobacterium solution with pBI121 35S::AS-Cs-
LEA;M，DL2000 DNA Marker;(－) ，negative control．
3 讨论
LEA基因是在种子成熟和发育阶段表达的基
因，至少发现了 6 组这样的基因，称为晚期胚胎发生
丰富蛋白基因［18］。植物在受到干旱胁迫时会诱导
LEA基因的表达［19］，LEA基因通过编码 LEA蛋白对
植物起保护作用。LEA基因表达的调节也有多种途
径，例如，对梅花(Prunus mume)LEA 基因全基因组
的鉴 定 和 分 析 表 明，PmLEA 基 因 在 花 中 大
量表达且在ABA处理下表达量上调［20］;LEA组的
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图 4 阳性植株目的基因 PCＲ检测
Fig． 4 PCＲ detecting of target gene in positive plants
注:a，pBI121 35S::CsLEA转化植株 PCＲ验证;b，pBI121 35S::AS-CsLEA转化植株 PCＲ验证;M，DL2000 DNA Marker;(－) ，阴性对照;CK +，重
组质粒;CK －，野生型拟南芥。
Note:a，PCＲ identification of pBI121 35S::CsLEA transformed plants;b，PCＲ identification of pBI121 35S::AS-CsLEA transformed plants;M，DL2000
DNA Marker;(－) ，negative control;CK +，recombined plasmid;CK －，wide type．
4B基因在植物组织中表现出对 ABA、脱水以及高盐
胁迫下的响应［21］;在自然干旱和盐胁迫处理下菘蓝
(Isatis indigotica)LEA基因在菘蓝幼苗体内不表达，
但随着胁迫时间的延长其表达量逐渐增加，到 9 h
时表达量达到峰值，表明该基因可能受逆境胁迫诱
导表达［22］;拟南芥中位于线粒体中的疏水蛋白
SAG21 /AtLEA5，在非生物胁迫下其表达影响地上部
生物量，开花和叶片衰老时间以及根系的生长结构
和发育［7］;无芒隐子草 CsLEA 基因受干旱诱导，只
在受严重胁迫的幼苗叶和根中大量表达［16］，这种强
胁迫下的适应能力可能是由于 CsLEA 与其他胁迫
相关基因共同作用的结果。
Zhang等［16］从无芒隐子草中发现脱水诱导基因
编码的一种新的 LEA 蛋白可提高转基因拟南芥的
渗透胁迫能力;Wang 等［23］发现，小麦 LEA 蛋白基
因 TaLEA3 在羊草(Leymus chinensis)中超表达后其
抗旱性显著提高;将紫杆柽柳(Tamarix and ross-
owii)LEA基因导入新疆早熟棉(Gossypium hirsutum)
中，干旱胁迫后转 LEA 基因棉花的基因表达量显著
增加，表现出了优良的生长和生理优势，显示出转
LEA基因棉花的抗旱能力［24］。反义 ＲNA 技术是植
物基因表达调控的一个重要路径，能在不破坏目的
基因的前提下调控基因的表达并且产生特异的阻抑
效应，合适的条件下，应用反义 ＲNA 技术通过封闭
某一特定基因的表达可以人为地模拟基因的点突
变，在植物基因工程中具有广阔的应用前景［25］。
Hamilton等［26］首次通过 pTOM13 反义基因的表达
减少番茄(Lycopersicon esculentum)的乙烯生物合成，
延迟了转基因果实的成熟期;徐晓峰等［27］通过 ACC
氧化酶反义基因在青花菜(Brassica oleracea)中表
达，使乙烯的合成在不同程度上受到抑制;Zhong
等［28］运用反义技术将豌豆(Pisum sativum)基质金
属蛋白酶反义基因转化进入拟南芥，大量降低转基
因拟南芥叶绿体基质金属蛋白酶活性同时抑制了物
质吸收过程;Gal等［29］采用 ＲNA干扰技术敲除线虫
Ce-lea-1 基因后，发现其耐脱水胁迫能力显著下降。
由此，通过转基因技术，使转基因植物积累
LEA蛋白，从而提高植物的抗渗透胁迫能力;同样
可以运用反义 ＲNA 技术抑制基因正常表达来深入
研究 CsLEA 基因的功能。本研究利用植物表达载
体 pBI121 将 CsLEA基因的 cDNA片段分别正向、反
向插入 BamH I 和 Sac I 两个酶切位点之间，使该
cDNA片段位于 35S 强启动子下游，提高了转基因
植株的转录水平，而根据核酸杂交原理 CsLEA 基因
的反义链可以有效地抑制目的基因的表达［21］。在
此基础上构建以组成型表达启动子 CaMV 35S 驱动
CsLEA 基因的植物超表达载体和植物反义表达载
体，经检测后，与预期结果相符。目前，已用电击法
将构建好的 CsLEA 基因植物表达载体成功地转入
了根癌农杆菌 GV3101 并获得工程菌，并通过花粉
管通道法转入拟南芥，已获得 T1 代阳性转化植株，
为深入研究 CsLEA基因的功能奠定了基础。
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(责任编辑 武艳培)
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