全 文 ：才邃乞创` 塑匕五丛迪必鱼匹业鱼咧旦
生物自显影技术在革莽英抑菌成分分离中的应用
郝淑贤` 黄 卉 2 刘 欣 2 陈永泉“
1( 南海水产研究所营养与食品工程研究室 , 广州 , 51 0 300)
2 (华南农业大学 , 广州 , 5 1 064 2 )
摘 要 应用硅胶板层析技术 , 以枯草芽抱杆菌作为指 示菌 , 研 究生物 自显影对革养英提取物抑
菌成分 的活性跟踪方法 。 用 Zo o m岁m L 革养英提取 物丙酮溶液点样 4 拌L , 以二 元溶剂 v ( c 肠:)
v ( 甲醇 ) = 8 . :5 1 . 5 展开 , 贴板 10 m in , 37 ℃培养 10 h 即可得到清晰的抑菌斑 色谱图 。 应 用该方法
可将革莽英粗提物 乙酸 乙醋部分分离得到 6 个活性组分 。
关健词 革养英 . 生物 自显影 , 分离 , 分离度
李莽是典型的具有药理作用 的食品原料 ,
革莽英是革莽中主要的活性物质 , 民间又将其
称作马蹄黄 , 在革莽果皮与果肉之 间的部位富
集 。 如果 能够将 马蹄加工后的废弃物 加以利
用 , 分离出一种天然抑菌防腐成分 , 满足各种保
健食品生产的需要 , 对增加产品附加值将具有
不可估量的意义 。
传统的测定抑菌成分抑菌效果的方法有物
理法 、 化学法及微生物学方法 2[] 。 实验中采用
微生物法中的扩散法对孽莽英提取物抑菌成分
的分离效果进行研究 , 以期对工业化生产提供
理论依据 。
1 材料与方法
1
.
1 材 料
1
.
1
.
1 菌种及其来源
枯草芽抱杆 菌 ( B a e i l l u : : u b t i l i: ) , 由华南
农业大学食品微生物教研室提供 。
1
.
1
.
2 培养基
牛肉膏蛋白陈琼脂培养基 (一般用于培养
细菌 ) 。
1
.
1
.
3 季养英提取物的制备
苹莽英粗品取 自于某马蹄粉厂 。
取革莽英粗品若干 , 用体积分数为 95 % 的
乙醇于室温下浸提 1 周 , 浸提液过滤 。 滤 渣用
相应溶剂浸提 2 次 , 方法同上 。 合并滤液 即为
革莽英粗提液 。 将粗提液于低于 50 ℃ 的条件
下浓缩 , 棕色膏状物为待测革莽英粗提物 。
1
.
2 实验方法
1
.
2
.
1 革养英抑 菌成分的硅胶板层析方法
用铅笔在已活化的硅胶板下端 1 。 m 处划
一平行于底边的细线并等距离标志点样点 。 点
样采用 5 拜L 微量进样器 , 点样直径 < Z m m 。 展
开采用立式玻璃展开槽展开 。 先向展开室注入
展开剂 , 静置 30 m in , 使展开槽内部充满饱和气
体 , 之后将硅胶板迅速放入 , 尽量不破坏展开槽
内溶剂的饱和状态 , 进行线性上行展开 。 层析
结束时取 出硅胶板 , 及时用铅笔标记溶剂前沿 ,
于室温下将溶剂 自然挥发至干 , 待检。
1
,
2
.
2 生物 自显 影方法
在无菌条件下将制好的枯草芽抱杆菌菌悬
液 ( 1 0 6 一 1 0 7 U C F , 0 . l m L )加入到培养基中 ( 6 0
m )L
, 摇匀后倾注平皿 , 每个培养皿倒入培养基
约 3 0 m L 。 待培养基凝固后 , 将 已层析完并挥
去展开剂的硅胶板贴于培养基上 , 盖好平皿 , 静
置一段时间使抑菌活性物质扩散到培养基中 ,
将硅胶板轻轻揭下 , 平皿置于培养箱中 37 ℃ 培
养一定时间即可观察分离状况 。
1
.
2
.
3 染 色
在培养好的平皿中加入 1 % 的碱性品红溶
液 (刚好布满培养基表面即可 ) , 染色 Z m in , 倒
掉碱性品红溶液 , 用清水冲洗至洗 出液无色为
第一作者 : 硕士研究生 , 助理研究员 。
收稿时间 : 2 0 0 3 一 1 2 一 2 2
( 8 8 )
DOI : 10. 13995 /j . cnki . 11 -1802 /ts . 2004. 05. 021
止 。 拍照 , 取滤纸 (剪相应形状 )放于培养基表
面 ,摊平 (注意不能留有气泡 ) , 待充分接触后取
出滤纸 , 则滤纸上印有抑菌圈 , 晾干 , 描绘成图 。
1
.
2
.
4 点样蚤的确定
将革 莽英 提 取 物 乙 酸 乙 醋 部分 配 成
2 0 0m g /m L 丙酮溶液作为试验样 , 点样量分别
为 1拌L , 2 拌L , 3拌L , 4 拌L , 用乙酸乙醋展开 , 用生
物自显影测定分离效果。 实验重复 3 次 。
1
.
2
.
5 贴板时问的确定
用 2 0 0m g / m L 提取物丙酮溶液点样 , 点样
量 3 拌L , 乙酸乙醋展开 , 待溶剂挥干后 , 将硅胶
板贴于含菌的琼脂培养基上 , 分别静置 s m in,
1 0 m i n
,
1 5 m i n
,
2 0 m i n
, 使抑菌活性物质扩散到
培养基中 , 取下硅胶板 , 于 37 ℃ 培养箱中培养 ,
待出现抑菌斑时即可观察不同贴板时间的分离
状况 。 实验重复 3 次 。
1
.
2
.
6 培养时间的确定
用 2 0 0 m g /m L 提取物丙酮溶液点样 , 点样
量 3 拼L , 乙酸乙醋展开 , 贴板 10 m in , 于 37 ℃分
别培养 10 h , 15 h , 20 h , 观察抑 菌斑直径的变
化 。 实验重复 3 次 。
1
.
2
.
7 层析剂的选择
一元溶剂 : 采用甲醇 、 乙酸 乙酷 、 正丁醇 、 异
丙醇 、 石油醚 、 C 从、 乙醇 、 丙酮 , 按照常规薄层
层析法将革莽英粗提物乙酸乙酷部在硅胶板上
展开 , 采用生物 自显影法检测其分离状况 , 每种
溶剂重复 3 次 。
二元溶剂 : 采用 v ( C C从) : v (甲醇 ) 二 8 . :5
1
.
5
、
9 : 1
,
V ( C C从) : V (丙酮 ) = 8 : 2 , V ( C C玩) :
V (乙酸乙 醋 ) = 1 : 9 , V (乙酸 乙醋 ) : V (异丙
醇 ) = 9 : 1 , 按常规薄层层析法将革莽英粗提物
乙酸 乙醋部在硅胶板上展开 , 采用 生物自显影
法检测其分离状况 , 每个比例重复 3 次 。
图 1 点样量对生物自显影结果的影响
2
.
2 贴板时间的确定
对图 2 进 行分析 可知 , 当贴板时间为 10
im
n 时 , 所得的抑菌斑色谱图最清晰 。 这是 因
为压板 时间过短 , 硅胶板上的抑菌成分来不及
扩散 , 致使抑菌斑不显著 ;压板时间过长 , 板上
硅胶充分润湿 , 部分硅胶脱落 , 影响生物 自显影
效果 。
2 结果与讨论
2
.
1 点样 t 的确定
由图 1可见 , 当点样量为 1一 2 拌L 时 , 只出
现单一抑菌斑 , 点样量为 3一 4 拌L 时 , 分离效果
好 , 可分为 3 个清晰的部分 。
图 2 贴板时间对生物自显影结果的影响
2
.
3 培养时间的确定
层析板经过不同培养时间后抑菌状况见图
3
, 分别测量抑菌斑 C 的直径 , 见表 1。 结果表
明 , 当培养时间为 10 h , 即刚刚出现清晰的抑菌
斑时 , 抑菌斑 C 直径最大且提取物可以明显地
分为 3 个部分 。 培养时间过长 , 菌体生长 , 抑菌
圈逐渐缩小 , 直至消失 。
( 8 9 )
图 4 b 一元溶剂生物自显影现象比较 ( n )
图 3 培养时间对生物自显影结果的影响
表 1 不同培养时间下抑菌斑 C 的直径
培养时间 / h
直径 /~ 10
.
04 士 0
.
5 6
.
10 士 0 . 74 无明显斑点
2
.
4 生物自显影展开剂的选择
2
.
4
.
1 一元溶 剂生物 自显影现象比较
一元溶剂对萃莽英粗提物的分离效果如图
4 所示 。 低极性溶剂石油醚 、 C队 不能把组分
分开 , 活性斑点只有 1 个且停留在原点上 ;中等
极性有机溶剂乙酸乙酷 、正丁醇 、 异丙醇的分离
效果较好 , 丙酮虽然也可以得到 2 个抑菌斑 , 但
二者相距较近 , 分离效果不 明显 。 强极性溶剂
乙醇 、 甲醇只得到 1 个抑菌斑 , 这是由于极性过
强 , 对其中的成分有较强的拖动力 , 致使抑菌斑
集中 。 以上 8 种有机溶剂生物自显影的斑点数
及 fR 列于表 o2
表 2 一元溶荆生物 自显影所得斑点数及 R , 值
溶 剂 斑点数 R f值
石油醚 1 0 . 0 0 士 0 . 0 0
C C肠 1 0 . 0 0 土 0 . 0 0
乙酸乙醋 0 . 5 1士 0 . 0 1 . 0 . 0 0 土 0 . 0 0
丙 酮 2 0 . 7 9士 0 . 0 2 , 0 . 5 1 士 0 . 0 3
异丙醉 2 0 . 5 1 士 0 . 0 1 , 0 . 10 士 0 . 0 1
正丁醇 2 0 . 5 1土 0 . 0 3 , 0 . 0 9 士 0 . 0 0
乙 醇 1 0 . 3 5 士 0 . 02
甲 醇 1 0 . 4 4 士 0 . 02
2
.
4
.
2 二元溶 剂生物 自显影现象比较
采用 v (C 玩) : v (甲醇 ) 二 8
.
5 : 1
.
5
、
9 : l
,
V ( C叽 ) : V (丙酮 ) = 8 : 2 , V ( C C从) : V ( 乙酸乙
酷 ) = 1 : 9 , V (乙酸乙酷 ) : V (异丙醇 ) 二 9 : 1 硅
胶板层析生物自显影 , 结果见表 3 。 其中分离
效果较好的溶剂是 V ( C C玩) : V (甲醇 ) = 8 . :5
1
.
5 和 v ( C C从) : v ( 甲醇 ) = 9 : 1 , 分别将革荞
英粗提物乙酸乙醋部分分为 6 和 4 个活性组分
(见图 5 ) 。
图 4 ( a) 一元溶剂生物自显影现象 比较 ( I ) 图 5 二元溶剂生物自显影现象比较
( 9 0 )
— 馨瓢纂表 3 二元溶剂生物自显影试验结果溶 剂C 14 : 甲醇 体积比 斑点数 R f值e e l4 : 甲醇C C 14 : 丙酮c cI 4 : 乙酸乙醋乙酸乙醋 : 异丙醇 8 . 5 : 1 . 58 : 27 : 31 : 9 0 . 9 7 , 0 . 8 8 , 0 . 7 4 ,0 . 6 3 , 0 . 2 2 , 0 . 0 20 . 6 5 , 0 . 5 7 , 0 . 4 8 ,0 . 3 3 0 . 100 . 3 8 , 0 . 170 . 6 0 , 0 . 3 9 , 0 . 0 00 . 7 5 , 0 . 4 8,`几、介生物 自显影法依据的原理是 , 具有生物活性的物质 , 如抗菌素等 , 在纸或薄层上分离后与有相当的微生物的琼脂培养基表面接触 , 在一定温度下培养后 , 有抗菌活性物质处的微生物生长受到抑制 , 琼脂表面 出现抑 菌点而得到定位 。 通过该法进行活性检测 , 一方面可 以充分节约原料 , 达到活性跟踪的 目的 ; 另一方面还可以初步证实革养英 中存在单一组分对菌体具有抑菌活性 , 证实继续分离纯化得到单一抑菌活性组分的可能性 。生物 自显影指示菌的选择非常重要 。 革莽英提取物对枯草芽泡杆菌的抑制效果 良好 , 并且枯草芽抱杆菌生长速度快 , 30 ℃ 培养 16 一 17h 即可观察结果 , 此外枯草芽泡杆菌对 人体 的
危害也不大 , 因此研究中采用枯草芽抱杆菌作
为指示菌 。
薄层分离是被分离物质即样 品 、 吸附剂及
展开剂共同作用的结果 , 因此选择与样品及 吸
附剂相 匹配的展开剂是分离效果好坏的关键 。
展开剂 的选择应尽可能从以下几个方面考虑 :
( 1) 毒性尽 可能小 ; ( 2) 溶剂 的粘 度不宜过高 ;
( 3 )沸点适 中 。
研究中所用的革莽英粗提物活性组分的定
性方法 , 只有活性组分才能产生抑菌斑 , 测定结
果不受杂质的影响 , 具有方法简单快速 、 灵敏度
高 、培养周期短 、 成本低廉等优点 。
3 结 论
以硅胶板层析为基础 , 以枯草芽抱杆菌为
指示菌的生物自显影法检测条件为 , 革莽英粗
品提取物浓度 2 0 o m g / m L , 点样量为 3 一 4 拼L ,
贴板 1 0 m i n , 3 7℃ 培养 , 1 0 h 即可得到清晰的抑
菌斑色谱图 。 生物 自显 影展开剂 V ( C C动 :
v (甲醇 ) = 8 . 5 : 1 . 5 时展开效果最好 , 孽莽英
粗提物可以被分开为 6 个活性组分 , 说明该提
取物中至少有 6 种成分具有抑菌活性 。
参 考 文 献
中药大辞典【M 〕. 上海 :上海科学技术出版社 , 1 986
张绪敏编 . 抗菌素微生物效价测定法 〔M 〕 . 北京 :
人 民卫生出版社 , 1 9 6 3 . 1 一 10 9
凌关庭 , 王亦芸 , 唐述潮 . 食品添加剂手册 [M ] . 北
京 : 化学工业出版社 , 1 99 5 . 223 一 2 24
A P P l i c a t i o n o f B io l o g ic a l D e v e l o Pm e n t T e c h n i q u e i n Q u a l i t a t i v e
A n a l y s i s fo r A n r im i c r o b i a l C o m P o n e n t s o f P u c h i i n E x t r a c t
H a o s h u x i a n l H u a n g H u i Z L i u x i n Z e h e n Y o n g q u a n Z
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d F 以记 E n g in e e ir 昭 n v is io n , 段川 th C h in a eS a
F is h e h es R
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A ST T R A C T T h
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i e a l d e v e lo p m e n t t e e h n iq u e w a s u s e d t o P or
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T h e o p t im u m c o n d i t i o n w a s o b t a i n e d w i t h 2 0 0m g / m L e x t r a e t i n a e e t o n e so l u t io n
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sa m p l e v o l u m e o f 4 拜L , d i f f u s io n t im e o f 1 0 m in a n d e u l t u r e t im e o f 1 0 h a t 3 7℃ . S i x d if f e r e n t a n t i b a e -
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