全 文 ： 2005, Vol. 26, No. 7 食品科学 ※基础研究78
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荸荠英抑菌成分活性跟踪方法的研究
刘 欣 1，郝淑贤 2，赵力超 1，黄 慧 1，陈永泉 1
(1.华南农业大学食品学院，广东 广州 510642；
2.南海水产研究所营养与食品工程研究室，广东 广州 510300)
摘 要：本文通过抑菌活性分析，确定敏感菌，运用硅胶板层析技术，研究生物自显影对荸荠英提取物抑菌成
分的活性跟踪方法：用 200mg/ml荸荠英提取物丙酮溶液点样 4μ l，以二元溶剂氯仿:甲醇＝ 8.5:1.5展开，贴板
10min，37℃培养 10h即可得到清晰的抑菌斑色谱图。应用该方法可将荸荠英粗提物乙酸乙酯部分分离得到六个活
性组分。
关键词：荸荠英；抑菌；生物自显影；分离度
Study on Tracking Bacteriostatic Components in Puchiin
LIU Xin1，HAO Shu-xian2，ZHAO Li-chao1，HUANG Hui1，CHEN Yong-quan1
(1.College of Food South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China；2.Nutrition and Food
Engineering Lab, South China Sea Fisheries Institute, Guangzhou 510300, China)
Abstract ：The biological development technique was used to provide a qualitative analysis method for tracking bacferiostafic
components in puchiin. In the study, the Bacillus subtilis was regarded as indicator organism. The optimum conditions were
obtained as follows with 200mg/ml acetone solution extract: the volumn of sample was 4μl, the diffusion time and the culture
time were 10min and 10h respectively under the temperature of 37℃. Six different antibacterial points appeared with the
mixture of chloroform and carbinol in the ratio of 8.5 to 1.5.
Key words：puchiin；bacteriostatic；bioautography；R f
中图分类号：Q58 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2005)07-0078-04
收稿日期：2004-04-01
作者简介：刘欣( 1 9 5 8 -)，女，副教授，硕士，主要从事农产品加工贮藏。
民间将荸荠英又称作马蹄黄，据说在荸荠果皮与果
肉之间的部位富集比较多。《中药大辞典》[ 1 ]中认为荸
荠英是荸荠中主要的活性物质。我国作为荸荠生产大
国，现仅限于马蹄淀粉，马蹄饮料，马蹄罐头的生产，
而荸荠皮往往被作为产品废料弃去，例如某马蹄粉厂日
产淀粉 30吨，其产生的废液量在 35吨以上，含水量为
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88%的湿渣则高达 185吨，如果能够将这些废弃物加以
利用，分离出一种天然抑菌防腐成分，满足各种保健
食品生产的需要，对增加产品附加值将具有不可估量的
意义。
在活性组分分离纯化过程中常用的快速检测方法为
化学显色法、紫外可见光吸光光度法和高效液相色谱
法，但由于实验初期没有标准品作为对照又不清楚其化
学结构，难以进行定性和定量；若采用其它生物活性测
定方法如滤纸片法，则需要的样品量较大，在达到有
效的活性跟踪的目的的同时，也造成了原料的大量浪
费，实际上不利于微量成分的纯化、分离。另外，因
植物组织中通常含有多种成分，如单萜、倍半萜、醛
类、酯类、酸类、酮类、醇类等，它们中有可能是
一种物质具有抑菌活性，也可能是几种或多种共同作用
使得植物组织具有较强抵御病菌入侵能力[2 ]。生物自显
影法依据的原理是：具有生物活性的物质，如抗菌素
等，在纸或薄层上分离后与有相当的微生物的琼脂培养
基表面接触，经在一定温度下培养后，有抗菌活性物
质处的微生物生长受到抑制，琼脂表面出现抑菌点而得
到定位。通过该法进行活性检测，一方面可以充分节
约原料，达到活性跟踪的目的；另一方面还可以初步证
实荸荠英中存在单一组分对菌体具有抑菌活性，证实继
续分离纯化得到单一抑菌活性组分的可能性。本文则探
讨该法对荸荠英提取物抑菌成分的分离效果，以期为后
期的提取分离工作提供有效的跟踪方法。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种及其来源
细菌：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) ；
金色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) ；
大肠杆菌(Escherichia coli) ；
沙门氏菌(Salmonella sp.)。
酵母菌：啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) ；
假丝酵母(Candida sp.)。
霉 菌：黑曲霉(Asperiyillus nigar van) ；
米曲霉(Asperiyillus oryzae)。
以上菌种由华南农业大学食品微生物教研室提供。
1.1.2 荸荠英粗提物的制备
荸荠英粗品取自于某马蹄粉厂。
取荸荠英粗品若干，用浓度为 95%的乙醇于室温下
浸提一周，浸提液过滤。滤渣用相应溶剂浸提两次，
方法同上。合并滤液即为荸荠英粗提液。将粗提液于
低于 50℃的条件下浓缩。得棕色膏状物即为待测荸荠英
粗提物。
1.2 实验方法
1.2.1 指示菌的确定 -滤纸片法
参考张文治等[3 ,4 ]法。将菌悬液按一定比例加入到培
养基中，摇匀后倾注平皿。将滤纸片在一定浓度的待
测液中浸湿，取出晾干，隔一定距离平铺于含菌培养
皿中，在适宜的温度下培养一定时间(细菌 37℃，12h；
霉菌 28℃，48h；酵母菌 28℃，24h)后，测定抑菌圈
直径。以无待测样的试液作为空白。
1.2.2 荸荠英抑菌成分硅胶板层析方法
用铅笔在已活化的硅胶板下端 1cm处划一平行于底
边的细线并等距离标志点样点。点样采用 5μl 微量进样
器，点样直径小于 2 m m。展开采用立式玻璃展开槽。
先向展开室注入展开剂，静置 30min，使展开槽内部充
满饱和气体，之后将硅胶板迅速放入，尽量不破坏展
开槽内溶剂的饱和状态，进行线性上行展开。层析结
束时取出硅胶板，及时用铅笔标记溶剂前沿，于室温
下将溶剂自然挥发至干待检。
1.2.3 生物自显影方法
在无菌条件下将制好的枯草芽孢杆菌菌悬液(106～
107UCF，0.1ml)加入到培养基中(60ml)，摇匀后倾注平
皿，每个培养皿倒入培养基约 30ml。待培养基凝固后，
将已层析完并挥去展开剂的硅胶板贴于培养基上，盖好
平皿，静置一段时间使抑菌活性物质扩散到培养基中，
将硅胶板轻轻揭下，平皿置于培养箱中 37℃培养一定时
间即可观察分离状况。
1.2.4 染色
在培养后的平皿中加入 1%的碱性品红溶液(刚好布
满培养基表面即可)，染色 2min，倒掉碱性品红溶液，
用清水冲洗至洗出液无色为止。拍照，取滤纸(剪相应
形状)放于培养基表面，摊平(注意不能留有气泡)，待
充分接触后取出滤纸，则滤纸上印有抑菌圈，晾干，
描绘成图。
2 结果与讨论
2.1 指示菌的确定
从表 1 可知，在中性条件下，粗提物对所选细菌
的抑菌效果较好，且抑菌活性具有量效关系，特别是
对细菌中大肠杆菌、金色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的
抑菌效果最为显著，浓度为 3.13% 仍具有明显的抑菌
现象；对酵母和霉菌除假丝酵母外均不显示抑菌活
性；且对细菌的抑菌活性明显强于假丝酵母。由于本
研究预探讨生物自显影技术在荸荠英抑菌成分定性分析
中的应用，故从菌体数量的稳定性和菌种对人体的安
全性双重因素出发，选择以即能反应荸荠英抑菌活性
又相对安全的枯草芽孢杆菌作为下述研究的指示菌。
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2.2 点样量的确定
将荸荠英提取物乙酸乙酯部分配成200mg/ml丙酮溶
液作为试验样，点样量分别为 1、2、3、4μl，用乙
酸乙酯展开，用生物自显影测定分离效果。
实验菌种 50% 25% 12.5% 6.25% 3.13%
金色葡萄球菌 15.2 9.0 7.7 7.3 5.9
枯草芽孢杆菌 8.8 8.6 7.2 6.8 6.3
大肠杆菌 12.1 9.3 8.7 7.7 7.2
沙门氏菌 8.2 7.2 6.5 5.5 5.5
假丝酵母 7.0 5.5 5.5 5.5 5.5
啤酒酵母 5.5 5.5 5.5 5.5 5.5
米曲霉 5.5 5.5 5.5 5.5 5.5
黑曲霉 5.5 5.5 5.5 5.5 5.5
表1 荸荠英粗提物的抑菌状况
Table 1 Bacteriostasis table of puchiin extract
图1 点样量对生物自显影结果的影响
Fig.1 The effect of spotting amount on bioautography
由图 1可见，当点样量为 1～2μl 时，只出现单一
抑菌斑，点样量为 3～4μl 时，分离效果好，可分为
3个清晰的部分。
2.3 贴板时间的确定
将展开后的硅胶板贴于含菌的琼脂培养基上，贴板
时间分别为 5、10、15、20min，取下硅胶板，于 37℃
培养箱中培养，待出现抑菌斑时即可观察不同贴板时间
的分离状况。
对图 2进行分析可知， 当贴板时间为 10min时，所
得的抑菌斑色谱图最清晰。这是因为压板时间过短，硅
胶板上的抑菌成分来不及扩散，致使抑菌斑不显著；压
板时间过长，板上硅胶充分润湿，部分硅胶脱落，影
响生物自显影效果。
2.4 培养时间的确定
用 200mg/ml提取物丙酮溶液点样，点样量3μl，乙
酸乙酯展开，贴板 10min，37℃分别培养 10、15、20h，
观察抑菌斑直径的变化。
层析板经过不同培养时间后抑菌状况见图 3，分别
测量抑菌斑 C 的直径，见表 2。结果表明：当培养时
间为 10h即刚刚出现清晰的抑菌斑时，抑菌斑C直径最
大且提取物可以明显的分为 3 个部分。培养时间过长，
菌体生长，抑菌圈逐渐缩小，直至消失。
培养时间(h) 10 15 20
直径(mm) 10.04± 0.55 6.10± 0.74 无明显斑点
表2 不同培养时间下抑菌斑C的直径
Table 2 The diameter of bacteriostatic spot C on different
culturing time
2.5 生物自显影展开剂的选择
2.5.1 一元溶剂生物自显影现象比较
一元溶剂对荸荠英粗提物的分离效果见图 4所示。
低极性溶剂石油醚、氯仿不能把组分分开，活性斑点
只有一个且停留在原点上；中等极性有机溶剂乙酸乙
酯、正丁醇、异丙醇的分离效果较好，丙酮虽然也可
以得到 2 个抑菌斑，但二者相距较近，分离效果不明
显。强极性溶剂乙醇、甲醇只得到一个抑菌斑，这是
由于极性过强，对其中的成分有较强的拖动力，致使
抑菌斑集中。以上八种有机溶剂生物自显影的斑点数及
R f列于表 3。
2.5.2 二元溶剂生物自显影现象比较
根据一元溶剂的展开结果，进行二元溶剂的配比展
开实验，采用氯仿:甲醇 =8.5:1.5、9:1，氯仿:丙酮 =8:
2，氯仿:乙酸乙酯 =1:9，乙酸乙酯:异丙醇 =9:1硅胶板
图2 贴板时间对生物自显影结果的影响
Fig.2 The effect of pasting time on bioautography
图3 培养时间对生物自显影结果的影响
Fig.3 The effect of culturing time on bioautography
81※基础研究 食品科学 2005, Vol. 26, No. 7
溶剂 斑点数 Rf值
石油醚 1 0.00± 0.00
氯仿 1 0.00± 0.00
乙酸乙酯 0.51± 0.01，0.00± 0.00
丙酮 2 0.79± 0.02，0.51± 0.03
异丙醇 2 0.51± 0.01，0.10± 0.01
正丁醇 2 0.51± 0.03，0.09± 0.00
乙醇 1 0.35± 0.02
甲醇 1 0.44± 0.02
表3 一元溶剂生物自显影所得斑点数及Rf值
Table 3 The spots unmber and Rf of single-solvent
bioautography
层析生物自显影，结果见表 4。其中分离效果较好的溶
剂是氯仿:甲醇 =8.5:1.5和氯仿:甲醇 =9:1，分别将荸荠英
粗提物乙酸乙酯部分分为 6和 4个活性组分(见图 5)。
溶剂 比例 斑点数 R f值
氯仿:甲醇 8.5:1.5 6 0.97, 0.88, 0.74, 0.63, 0.22, 0.02
氯仿:甲醇 8:2 5 0.65, 0.57, 0.48, 0.33 0.10
氯仿:丙酮 7:3 2 0.38, 0.17
氯仿:乙酸乙酯 1:9 3 0.60, 0.39, 0.00
乙酸乙酯:异丙醇 9:1 2 0.75, 0.48
表4 二元溶剂生物自显影试验结果
Table 4 The result of duality-solvents bioautography
运用生物自显影技术对抑菌活性成分进行跟踪，通
过进一步的分离纯化，经结构签定初步确定其主要的抑
菌活性成分为一种甾醇类物质。对该物质进行小鼠表皮
及体内抑菌实验，均取得了明显的功效。
在生物自显影技术应用过程中，指示菌的选择非常
重要。荸荠英提取物对枯草芽孢杆菌的抑制效果良好，
并且枯草芽孢杆菌生长速度快，30℃培养 16～17h即可
观察结果，此外枯草芽孢杆菌对人体的危害也不大，因
此本研究采用枯草芽孢杆菌作为指示菌。
薄层分离是被分离物质即样品、吸附剂及展开剂共
同作用的结果，因此选择与样品及吸附剂相匹配的展开
剂是分离效果好坏的关键。展开剂的选择应尽可能从以
下几个方面考虑：①毒性尽可能小；②溶剂的粘度不宜
过高；③沸点适中。
本研究所用的荸荠英粗提物活性组分的定性方法，
只有活性组分才能产生抑菌斑，测定结果不受杂质的影
响，具有方法简单快速、灵敏度高、培养周期短、成
本低廉等优点。
3 结 论
以硅胶板层析为基础、以枯草芽孢杆菌为指示菌的
生物自显影法检测条件为，荸荠英粗品提取物浓度
200mg/ml，点样量为 3～4μl，贴板 10min，37℃培养，
10h即可得到清晰的抑菌斑色谱图。生物自显影展开剂
氯仿:甲醇 =8.5:1.5时展开效果最好，荸荠英粗提物可以
被分开为 6个活性组分，说明该提取物中至少存在 6种
成分具有抑菌活性。
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图4 一元溶剂生物自显影现象比较
Fig.4 Comparison between different single-solvents
图5 二元溶剂生物自显影现象比较
Fig.5 Comparison between different duality-solvents