全 文 ：广 西 植 物 Guihaia　Mar．２０１４,３４(２):２５６－２６２　　　　　　　　　　 http://journal．gxzw．gxib．cn　
DOI:１０．３９６９/j．issn．１０００Ｇ３１４２．２０１４．０２．０２２
胡廷章,杨俊年,陈再刚,等．水稻OsGSTLc启动子的分离和鉴定[J]．广西植物,２０１４,３４(２):２５６－２６２
HuTZ,YangJN,ChenZG,etal．IsolationandidentifyofthericeOsGSTLcpromoter[J]．Guihaia,２０１４,３４(２):２５６－２６２
水稻OsGSTLc启动子的分离和鉴定
胡廷章∗,杨俊年,陈再刚,吴应梅
(重庆三峡学院 生命科学与工程学院,重庆４０４１００)
摘　要:半定量RTＧPCR分析表明,OsGSTLc在水稻根中的表达受绿磺隆的诱导.从水稻基因组中分离到
的OsGSTLc读码框上游２２１７１bp序列,在起始密码ATG上游Ｇ８６bp处有CAATＧbox,但在CAATＧbox与
读码框之间没有典型的TATAＧbox.因此,OsGSTLc启动子是无TATA框启动子.将OsGSTLc启动子５′Ｇ
端系列缺失后,分别与GUS报告基因融合,获得GSTL２１７１::GUS、GSTL１７６１::GUS、GSTL９６２::GUS 和
GSTL５２５::GUS表达载体,利用农杆菌介导转化水稻,获得转基因水稻,均能启动下游GUS 报告基因的表
达.氯磺隆处理后,转入GSTL２１７１::GUS、GSTL１７６１::GUS 和GSTL９６２::GUS 的水稻植株根部的GUS
活性明显增加.氯磺隆诱导的应答元件在Ｇ９６２~Ｇ５２５bp的范围内.
关键词:OsGSTLc;诱导;缺失分析;启动子;水稻
中图分类号:Q７１　　文献标识码:A　　文章编号:１０００Ｇ３１４２(２０１４)０２Ｇ０２５６Ｇ０７
IsolationandidentifyofthericeOsGSTLcpromoter
HUTingＧZhang∗,YANGJunＧNian,CHENZaiＧGang,WUYingＧMei
(SchoolofLifeSciencesandEngineering,ChongqingThreeGorgesUniversity,Chongqing４０４１００,China)
Abstract:TheexpressionofOsGSTLcinricerootswasinducedbychlorsulfuronthroughsemiＧquantitativeRTＧPCR
analysisdemonstrated．A２１７１bpupstreamsequenceofthetranslationstartcodonATGofOsGSTLcgenewasisoＧ
latedfromthegenomicDNAofrice,whichcontainedaputativeCAATＧboxatpositionＧ８６bpupstreamofATG,but
therewasn’tTATAＧboxbetweentheCAATＧboxandATG．Therefore,OsGSTLcpromoterwasaTATAＧlessproＧ
moter．Todefinethecorepromotersequence,aseriesof５′truncationderivativesofGST２１７１werefusedtoaGUS
reportergenetoconstructGSTL２１７１::GUS,GSTL１７６１::GUS,GSTL９６２::GUSandGSTL５２５::GUS,respecＧ
tively．ThefourfusiongeneswereintroducedintoriceplantsbyAgrobacteriumＧmediatedtransformation,alpromotＧ
erfragmentswith５′ＧdeletiondrivedsuccessfulytheexpressionofGUSreportgene．Quantitativefluorescenceassays
showedthattheGUSactivitiesintherootsofGSTL２１７１::GUS,GSTL１７６１::GUSandGSTL９６２::GUStransgenＧ
icriceseedlingswereupregulatedbychlorsulfuron．ThetranscriptionalactivationelementofchlorsulfuronmaybeloＧ
catedbetweenpositionsＧ９６２andＧ５２５．
Keywords:OsGSTLc;induction;deletionanalysis;promoter;rice
　　谷胱甘肽转移酶(Glutathionetransferases,
GSTs;EC２．５．１．１８)在植物的初级代谢和次级代谢、
胁迫耐受和细胞信号转导中行使功能,影响植物的
生长发育.植物GST的主要功能在于解除外界毒
素以及内源有毒代谢物的侵害,能催化还原型谷胱
甘肽的疏基与多种亲电和亲脂底物的结合,生成水
收稿日期:２０１３Ｇ０７Ｇ０９　　修回日期:２０１３Ｇ１０Ｇ０８
基金项目:重庆市自然科学基金(cstc２０１１jA８００２７,cstc２０１２jA８０００９);重庆市教育委员会科学技术研究项目(KJ１２１１０６,KJ１３１１０１).
作者简介:胡廷章,博士,教授,主要从事生物化学与分子生物学研究,(EＧmail)tzhu２００２＠yahoo．com．cn.
∗通讯作者
溶性的产物,从而降低底物的毒性(Edwardsetal．,
２０００;Dixonetal．,２００２b;Moons,２００３).GSTF和
GSTU的主要功能是与包括杀虫剂、除草剂在内的
异生素结合,从而解除这些异生素毒性;GSTT主要
是作为谷胱甘肽过氧化酶,还原有机氢过氧化物;
DHAR催化脱氢抗坏血酸还原成抗坏血酸;GSTL
作为植物的抗氧化酶起作用(Dixonetal．,２００２a;
Edwardsetal．,２００５);有些GST在细胞的氧化还
原稳态和调节细胞程序衰老中起作用(Moons,
２００５);GST也作为细胞信号在胁迫耐受中起作用
(Loyaletal．,２０００).GSTZ具有依赖谷胱甘肽的
异构酶活性,催化顺丁烯二酸单酰乙酰乙酸异构化
成反丁烯二酸单酰乙酰乙酸(Dixonetal．,２０００).
GST是个多基因家族,自２０世纪７０年代从玉
米中克隆到能解除除草剂毒性的GST基因以来,许
多GST和与GST类似的序列已经从多种植物中得
到克隆(Shimabukuroetal．,１９７０).目前,至少从
１７种植物中分离到GST基因,己经发现拟南芥有
５３个GST基因,大豆有２５个GST基因,玉米有４２
个GST基因,水稻有７９个GST基因,毛果杨有８１
个GST基因(Chietal．,２０１１;Dixonetal．,２００２b;
McGonigleetal．,２０００;Soranzoetal．,２００４;WagＧ
neretal．,２００２).根据蛋白同源性和基因组织结
构,植 物 GST 分 为 φ(GSTF)、τ(GSTU)、ζ
(GSTZ)、θ(GSTT)、λ(GSTL)和脱氢抗坏血酸还原
酶(DHARs)、四氯对苯二酚脱卤素酶(TCHQD)和
微粒体谷胱甘肽转移酶(MicrosomalＧclassGSTs)
等８类(Mohsenzadeh等,２０１１).在研究水稻GST
家族基因功能的过程中,发现OsGSTLc基因在水
稻根中的表达受到除草剂氯磺隆的诱导.为了分析
OsGSTLc在水稻中的表达特性,研究OsGSTLc启
动子的功能,本实验从水稻基因组中分离到OsGＧ
STLc基因的启动子,并对该启动子进行了研究.
１　材料与方法
１．１材料
水稻“中华１１号”(Oryzasativacv．Zhonghua
１１)、农杆菌LBA４４０４、大肠杆菌TOP１０菌株和植
物转化载体pCAMBIA１３０１由重庆三峡学院生命
科学与工程学院实验室保藏.
１．２方法
１．２．１材料培养和处理　取水稻种子,用自来水浸泡
２d,种子发芽露白后,铺在纱布上;在自然条件下培
养１０d后,转入０．０２％的氯磺隆水溶液中培养.在
转入氯磺隆水溶液后的０、２、６、１０、２４和４８h分别
收集水稻幼苗的根和叶.
１．２．２RNA提取和半定量RTＧPCR分析　用Trizol
试剂分别提取水稻幼苗根和叶的总RNA,取１μg
RNA为模板,以olig(dT)１８为反转录引物进行反
转录,合成cDNA.半定量 RTＧPCR是以反转录产
物为模板,以引物OsGSTLcsf和 OsGSTLcsr(表
１)扩增 OsGSTLc基因片段,以引物 ACTIN１f和
ACTIN１r(表１)扩增持家基因ACTIN１片段为内
参(McElroy等,１９９０),扩增条件为９４℃变性３０s、
５８℃退火３０s、７２℃延伸３０s,进行２８个循环.
表１　PCR扩增引物序列
Table１　PrimersequencesusedforthePCRamplification
序号
Sequence
No．
引物名称
Nameof
theprimers
　序列
　Sequence
１
２
３
４
５
６
７
８
９
OsGSTLcsf
OsGSTLcsr
ACTIN１f
ACTIN１r
pGSTLcf１
pGSTLcf２
pGSTLcr
p１３０１f
p１３０１r
５′ＧCGTTCAACAAAGCATCGTACＧ３′
５′ＧGCAAAAACTGTGGGTCCTGTＧ３′
５′ＧTCCGTGACATCAAGGAAAAGＧ３′
５′ＧGATATCAACATCGCACTTCATGＧ３′
５′ＧCACCCTGCAGCCATTAGTGTGAGTGTＧ
TTCGGTGAＧ３′
５′ＧCACCCTGCAGGAAATCGGTAGCATCTＧ
CTTCAGGAＧ３′
５′ＧAACAAGCGGTTTATTCTTCTCCTCＧ３′
５′ＧCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCＧ３′
５′ＧCCTAACCAAGAAAATGAAGGAGAAＧ３′
１．２．３基因上游调控序列的分离　用植物DNA提取
试剂盒提取水稻总DNA,并以此为模板.根据OsGＧ
STLc读码框上游的DNA序列设计引物pGSTLcf１
和pGSTLcr,在正向引物５′Ｇ端引入了PstI酶切位
点,扩增片段长度为２２５４bp.将扩增到的DNA片
段克隆到pENTR/DＧTOPO载体上,构建的质粒命名
为pGSTLcＧTOPO,测序后,利用 PLACE(http://
www．dna．afrc．go．jp)和 PlantCARE(http://intra．
psb．ugent．be:８０８０/PlantCARE/)进行序列分析.
１．２．４植物表达载体的构建　通过PstI和NcoI酶切
位点将pGSTLcＧTOPO载体上的OsGSTLc读码框上
游的２１７１bp片段插入到pCAMBIA１３０１载体上,取
代GUS 基因前的３５S启动子,得到GSTL２１７１::
GUS 转 植 物 载 体;用 Hind Ⅲ 和 NcoⅠ酶 切
GSTL２１７１::GUS质粒,回收小的OsGSTLc启动子
片段,该片段的大小为１７６１bp.通过Hind Ⅲ和
NcoⅠ酶切位点克隆到pCAMBIA１３０１载体上,得
７５２２期　　　　　　　　　　　胡廷章等:水稻OsGSTLc启动子的分离和鉴定
到GSTL１７６１::GUS 载体;根据OsGSTLc启动子
序列设计引物pGSTLcf２(表１),用引物pGSTLc
f２和pGSTLcr以pGSTZ２ＧTOPO质粒为模板作
PCR,PCR产物通过PstⅠ和NcoI酶切位点克隆到
得到 pCAMBIA１３０１载体上,得到 GSTL９６２::
GUS 载体;用 XbaⅠ和 NcoⅠ酶切GSTL９６２::
GUS质粒,回收小的 OsGSTLc 启动子片段,用
XbaⅠ和NcoⅠ酶切位点克隆到pCAMBIA１３０１载
体上,得到GSTL５２５::GUS载体.
１．２．５植物转化和转基因植株的鉴定　采用冻融法
将植物转化载体 GSTL２１７１::GUS、GSTL１７６１::
GUS、GSTL９６２::GUS和GSTL５２５::GUS分别转
化农杆菌LBA４４０４(Hofgen等,１９８８),采用农杆菌
介导共培养法转化水稻,２５mg/L潮霉素筛选转基
因水稻(Hu,２００８;段承杰等,２０１２).按pCAMＧ
BIA１３０１载体GUS基因上游插入的启动子两侧的
载体序列设计引物p１３０１f和p１３０１r(表１),以转基
因水稻DNA为PCR模板进行PCR分析.
１．２．６ 转基因植株的 GUS活性定量测定　转
GSTL２１７１::GUS、GSTL１７６１::GUS、GSTL９６２::
GUS和GSTL５２５::GUS的水稻种子在水中培养,待
种子萌发出苗１０d,转入０．０２％氯磺隆溶液中培养,
分别在０、６、８、１０和１２h收取幼苗的根和叶.参考
Jefersonetal．(１９８７)方法进行GUS活性检测.
２　结果与分析
２．１OsGSTLc基因诱导表达
半定量 RTＧPCR分析表明,OsGSTLc在水稻
根中的本底表达量(诱导０h)非常低,经绿磺隆处
理２h后表达量开始升高,诱导６h时表达量达到
峰值,之后逐渐下降,到４８h时,OsGSTLc的表达
量逐渐回到接近诱导之前的水平(图１:a).而在水
稻的叶中OsGSTLc的表达不受绿磺隆影响,绿磺
隆处理后表达水平没有明显变化(图１:b).说明
OsGSTLc在水稻根中的表达受绿磺隆的诱导.
２．２OsGSTLc基因启动子的克隆
以水稻总 DNA为模板,由引物pGSTLcf和
pGSTLcr进行PCR扩增(表１),将扩增产物进行
琼脂糖凝胶电泳分析,得到约２２５０bp左右的条
带.回收PCR产物,并与pENTRTOPO载体的连
接、鉴定、测序.测序结果显示,扩增得到的片段包
含OsGSTLc读码框上游的２１７１bp序列.利用
图１　半定量RTＧPCR分析OsGSTLc的表达　a．根;b．叶
Fig．１　OsGSTLcgeneexpressionbysemiＧquantitative
RTＧPCRanalysis　a．roots;b．leaves
PLACE(http://www．dna．affrc．go．jp)和 Plant
CARE(http://intra．psb．ugent．be:８０８０/PlantＧ
CARE/)分析,发现在起始密码ATG上游Ｇ８６bp处
有推测的CAATＧbox存在,但在CAATＧbox与读
码框之间没有典型的TATAＧbox存在(图２).
２．３植物转化载体的构建
为研究OsGSTLc启动子的功能,对启动子的
５′Ｇ端侧翼序列进行系列缺失,从而得到２１７１、
１７６１、９６２和５２５bp的启动子片断(图２,图３).用
获得的这些启动子片段取代pCAMBIA１３０１载体
的GUS基因上游的３５S启动子,获得不同长度的
启动子与GUS融合的植物转化载体(图３).
２．４转基因水稻植株的获得
将 GSTL２１７１::GUS、GSTL１７６１::GUS、
GSTL９６２::GUS 和GSTL５２５::GUS 载体由农杆
菌AGL０介导转化中花１１号水稻,经潮霉素筛选,
获 得 GSTL２１７１::GUS、GSTL１７６１::GUS、
GSTL９６２::GUS 和GSTL５２５::GUS 转化的植株
都在５株以上.进行PCR鉴定表明,绝大部分转化
株都能扩增出特异条带,证明外源基因已经整合到
水稻基因组中(图４).
２．６OsGSTLc启动子对氯磺隆响应的转录调节
GUS活性分析表明,未经氯磺隆处理的转基因
幼苗中,转入GSTL５２５::GUS 的水稻幼苗根和叶
的GUS活性最高,GSTL９６２::GUS 的水稻幼苗根
和叶 的 GUS 活 性 最 低,GSTL１７６１::GUS 和
GSTL９６２::GUS的GUS活性无明显差异(图５).
在氯磺隆处理后,转入 GSTL２１７１::GUS、
GSTL１７６１::GUS和GSTL９６２::GUS 的水稻植株
根部的GUS活性得到明显增强,峰值大约在绿磺
８５２ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３４卷
图２　OsGSTLc启动子序列分析　下画线标出的是用于５′Ｇ端缺失的引物和酶切位点HindIII、XbaI、NcoI;阴影标出的是推测的
CAATＧbox;加粗的ATG是翻译的起始密码.
Fig．２　NucleotidesequenceoftheOsGSTLcpromoter　TheprimersandHindIII,XbaIandNcoIsiteusedfor５′ＧdeletionareunderＧ
lined;theputativeCAATＧboxisshadedgray;thetranslationstartcodonATGisblack．
隆处理后６h左右,GUS活性是未经处理的３~４
倍(图７),而叶中的GUS活性没有多大变化(图６).
在转入GSTL５２５::GUS 的水稻植株的根和叶,
GUS活性几乎不受绿磺隆的影响(图５).
３　结论与讨论
生物和非生物胁迫会诱导一些植物GST的表
达.如受炭疽病(Colletotrichumorbiculare)感染
的烟草,其中NbGSTU１和 NbGSTU３的表达得到
增强(Deanetal．,２００５).非生物因素如冷、热、重
金属离子、盐、PEG、H２０２、甲基紫精、脱落酸、水杨
酸、生长素、细胞分裂素可引起一些GST的响应,除
草剂和除草剂安全剂也会诱导一些GST表达(胡廷
章等,２００７).在一些情况下,GST因对一般的细胞
损伤或除草剂和化学毒素引起的氧化胁迫反应而受
到诱导(Urbaneketal．,２００５).玉米中的GST可
促使除草剂阿特津脱毒,就是因为除草剂形成的氧
９５２２期　　　　　　　　　　　胡廷章等:水稻OsGSTLc启动子的分离和鉴定
图３　OsGSTLc启动子与GUS融合的植物转化载体
Fig．３　Schematicdiagramofplantexpressioncassettes
图４　转基因水稻植株DNA的PCR检测　a．GSTL２１７１::GUS;b．GSTL１７６１::GUS;c．GSTL９６２::GUS;d．GSTL５２５::GUS．
M．DNAmarker;NT．非转基因植株(阴性对照);１~５．转基因植株;P．表达载体(阳性对照).
Fig．４　PCRanalysisoftransgenicrice　a．GSTL２１７１::GUS;b．GSTL１７６１::GUS;c．GSTL９６２::GUS;d．GSTL５２５::GUS．M．DNA
marker;NT．NonＧtransgenicrice;１－５．Independenttransgeniclines;P．Exptessionvector．
图５　转基因水稻幼苗的GUS活性分析　数据是３个转基因独立株系测得的平均值±SD;∗表示标记的氯磺隆处理与未处理水
稻的GUS活性达到P＜０．０５差异水平.
Fig．５　AnalysisofGUSactivityoftransgenicriceseedlings　TheaverageGUSactivityandstandarddeviationswereobtainedfromthree
independenttransgeniclines;∗denotediferencesbetweenmeanvaluesmeasuredintheindicatedriceseedlingstreatedbychlorsulfuroncomparedto
untreatedriceseedlingsareP＜０．０５．
胁迫能诱导 GST大量表达(Shimabukuroetal．,
１９７０),其它如磺酰脲类、异丙甲草胺、硫胺甲酸亚
砜、氯乙酰苯胺和联苯醚类等除草剂也可诱导GST
表达(胡廷章等,２００７).而在另一些情况下,GST
０６２ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３４卷
的诱导则是其对特异胁迫作用的响应,激发起植物
的防御反应,如经除草剂安全剂处理的禾谷类植物,
通过增加包括GST在内的解毒酶表达而增强其对
除草剂的耐受性(Daviesetal．,１９９９).OsGSTLc
在水稻根中的表达受绿磺隆的诱导,OsGSTLc很可
能在解除除草剂毒性方面发挥作用.
真核生物有３种RNA 聚合酶,每一种都有自
己特定的启动子类型.PolＧⅠ负责rRNA 转录,
PolＧⅡ负责tDNA和５SrDNA的转录,其启动子位
于转录的DNA序列之内,称为下游启动子.PolＧⅢ
负责编码蛋白质基因和部分snRNA 基因的转录.
PolＧⅡ启动子分为含有TATAbox的启动子(TAＧ
TApromoter)和不含有TATAbox的启动子(TAＧ
TAＧlesspromoter)两大类(左永春等,２００９).在
OsGSTLc启动子的CAATＧbox与读码框之间没有
典型的TATAＧbox存在,因此,OsGSTLc启动子是
无TATA框启动子.由于OsGSTLc基因编码的
是蛋白质,因此,PolＧⅢ启动子存在不含TATAbox
的启动子.绝大多数植物启动子正确表达需要
TATAbox,而在没有TATAbox的启动子中,在
调控基因表达的过程中,可能存在着某些替代机制,
涉及到某种蛋白质因子与启动子中的某些DNA序
列相互作用.如AC２转座酶基因启动子无TATA
box,TPASE抑制转座作用是通过与起始点上游
１００~１８０bp处结合而实现(Fridlenderetal．,
１９９６).
未经 氯 磺 隆 处 理 的 转 基 因 幼 苗 中,转 入
GSTL５２５::GUS 的水稻幼苗根和叶的 GUS活性
最高;当启动子的长度从５２５bp延长到９６２bp,转
基因水稻幼苗的根和叶的 GUS活性最低;而启动
子的长度再延长到１７６１bp,其 GUS活性有所升
高,但较GSTL５２５::GUS 的低得多;当启动子的长
度延长到２１７１bp时,转基因水道幼苗根和叶的
GUS活性没有多大变化,其GUS活性与１７６１bp
启动子的相似.这些结果说明在起始密码ATG上
游Ｇ１７６１~Ｇ１bp的范围存在完整的启动子;在Ｇ５２５
~Ｇ１bp和Ｇ１７６１~Ｇ９６２bp有增强基因表达的元件,
在Ｇ９６２~Ｇ５２５bp的范围内存在抑制基因表达的元
件;在Ｇ９６２~Ｇ５２５bp存在的抑制基因表达元件非常
强,其抑制能力远远超过了在Ｇ５２５~Ｇ１bp和Ｇ１７６１
~Ｇ９６２bp存在的增强基因表达元件的增强能力.
在绿磺隆处理后,转GSTL５２５::GUS 水稻植株的
根和叶中,GUS 活性几乎不受绿磺隆的影响;
GSTL２１７１:: GUS、 GSTL１７６１:: GUS 和
GSTL９６２::GUS 转基因水稻植株根部的 GUS活
性明显增强,其峰值大约在处理后６h;而叶中的
GUS活性没有多大变化.这说明在Ｇ９６２bp~Ｇ５２５
bp的范围内,存在绿磺隆诱导OsGSTLc基因在水
稻根表达的元件.结果与半定量RTＧPCR分析一
致,即OsGSTLc在水稻幼苗根中的表达受到氯磺
隆的诱导.
有关GST基因家族启动子的研究报道较少.
拟南芥GST６基因的表达受到生长素、水杨酸和H２
０２的诱导,其启动子具有１个ocs元件,OBF１能够
促进ocs 元件结合因子(OBF)与ocs 元件结合
(Chen等,１９９６).在转基因马铃薯中,玉米GSTＧ２７
启动子可以驱动 GUS报告基因的表达,安全剂
R３２９１４８(３Ｇ二氯乙酰基Ｇ２,２,５Ｇ三甲基Ｇ１,３Ｇ唑烷酮)
的诱导使叶中GUS报告基因的表达提高４０倍,而
在茎、根和块茎的表达是组成型的,不受诱导(RoＧ
bertsonetal．,２０００).
在氯磺隆处理后６hOsGSTLc基因大量表达,
说明该基因对氯磺隆处理的应答反应快.另外,该
启动子在受诱导后的表达水平不是很高,仅使基因
的表达水平提高了３~４倍.这些特点有利于该启
动子在实际生产中的应用.因为在一些转基因植物
中,外源基因的过度表达往往会破坏植物自身体内
的平衡,从而影响植物的正常生长发育.在研究和
生产中,用一个受氯磺隆诱导的中度表达的启动子
引入外源基因,则有利于解决外源基因在植物中过
度表达的问题,使外源基因在转基因植物的表达得
到很好控制.本研究为OsGSTLc启动子的应用和
OsGSTLc基因功能的深入研究奠定了基础.
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２６２ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３４卷