全 文 ：RAPD法研究孝感荸荠和野生荸荠的遗传差异性
曹姣 ,李建华 ,盛继群＊ 　(孝感学院生命科学技术学院 ,湖北省作物病害监测和安全控制重点实验室 ,湖北孝感 432000)
摘要　[目的]采用 RAPD法研究孝感荸荠和野生荸荠的遗传差异性。 [方法]利用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术 ,对地方栽培种孝
感荸荠、野生荸荠、蒲草和扁杆藨草的基因组DNA进行了遗传差异性分析。 [结果]共筛选出 841、842、807和 840 4个随机引物 ,其中
841随机引物的扩增产物多态性明显 ,获得清晰、重复性好的条带。聚类分析结果显示 ,栽培荸荠与野生荸荠的亲缘性相对于蒲草与扁
杆藨草而言较近。 [结论]为培植优质荸荠新品种提供了理论依据。
关键词　荸荠;RAPD;聚类分析;遗传差异性
中图分类号　Q949.71　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2010)36-20551-03
GeneticDiversitiesbetweenXiaoganWaterChestnutandWildChestnutwithRandomlyAmplifiedPolymorphicDNATechnology
CAOJiaoetal　(KeyLabofCropDiseaseMonitoring＆SafetyControlinHubeiProvinceofSchoolofLifeScienceandTechnologyofXi-
aoganUniversity, Xiaogan, Hubei432000)
Abstract　[Objective] TheaimwastostudythegeneticdiversitiesbetweenXiaoganwaterchestnutandwildchestnutwithrandomlyamplified
polymorphicDNA(RAPD)technology.[ Method] Geneticdiversitiesofthelocalcultivatedwaterchestnut, wildchestnut, Lepironiaarticulate
andScirpusplaniculmisFr.SchmidtwereanalyzedbyRAPDtechnology.[ Result] Amongthescreenedrandomprimers841, 842, 807and840,
thepolymorphismofamplificationproductof841wasevident, andtheobtainedbandsinelectrophoresiswereclearandshowedgoodrepeat-
ability.ClusteranalysisresultshowedthattheafinityofcultivatedwaterchestnutandwildwaterchestnutwasnearerthanthatbetweenLepiro-
niaarticulateandScirpusplaniculmisFr.Schmidt.[ Conclusion] Theresearchprovidestheoreticalbasisforcultivatinghigh-qualitynewvarie-
tiesofwaterchestnut.
Keywords　Waterchestnut;RAPD;Clusteranalysis;Geneticdiversities
基金项目　湖北省自然科学基金项目(2005ABA084);湖北省教育厅重
大项目(04Z002)。
作者简介　曹姣(1987-),女 ,湖北汉川人 , 硕士研究生 ,研究方向:分
子生物学。 ＊通讯作者 ,博士 ,教授 ,从事遗传与分子生物
学研究 , E-mail:jqsheng 215@126.com。
收稿日期　2010-08-30
　　荸荠作为一种水生经济作物 ,关于其组织培养技术 、优
质无公害栽培技术及其生物学形态特征的研究较多 ,而关于
荸荠及野生荸荠基因组的分子生物学特征及遗传差异性的
研究较少 。李曾用牛血清白蛋白改善荸荠基因组 DNA的随
机扩增多态性 DNA(RandomlyAmplifiedPolymorphicDNA,
RAPD),结果表明在 RAPD反应体系中 ,解除多酚化合物抑
制作用的最适牛血清白蛋白质量浓度是 0.4 μg/μl[ 1] 。用
RAPD技术鉴别了荸荠属中亲缘关系相近的 2个种:E.dulcis
和 E.phacelata,该试验是根据 3个 10碱基随机引物(SClO-
23、SC10-25和 AB01-18)获得的遗传距离值 ,并用 UPGMA聚
类方法构建了来自 8个样点的样本的分子系统树 [ 2] 。JIANG
等在荸荠基因组 DNA的提取及 RAPD反应体系的建立试验
中 ,对其 RAPD反应体系进行了优化 ,建立了荸荠 RAPD反
应体系(总体积为 25μl),其各成分的最佳浓度分别为:Mg2+
25.0mmoI/L, TaqDNA聚合酶 1.0 U, dNTPs0.2mmol/L,引
物 1.0 μmol/μl, DNA模板 1.5 ng/μl[ 3] 。基于此 ,笔者采用
RAPD法探讨了栽培荸荠和野生荸荠的遗传差异性 ,并检测
了种间亲缘关系 ,以期为培植优质荸荠新品种提供理论
依据。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　供试植物。 4种莎草科植物栽培型荸荠 、野生型荸
荠 、蒲草和扁杆藨草 ,均采自孝感地区农村 。采集的荸荠球
茎于沙土中 25 ℃培养 。
1.1.2　RAPD引物。用于试验的引物选自加拿大 BritishCo-
lumbia大学公布的关于植物 ISSR的 100条引物 ,由上海英俊
生物有限公司合成 ,随机筛选 8条引物 ,用 DNA提取质量最
好的样品对这 8条引物进行扩增 、筛选 ,选取出可重复性 、高
效性的 4条条带引物:U807、U840、U841和 U842,其相关引物
序列分别为(AG)8T、(GA)8YT、(GA)8YC和(GA)8 YG[ Y=
(C, T)] 。
1.1.3　试剂与仪器。 0.5 mol/L乙二胺四乙酸二钠(ED-
TA), 1.0mol/LTris-HCl, 2.5mol/LNaCl,氯仿 -异戊醇(24
∶1),苯酚 -氯仿 -异戊醇(25∶24∶1), l×TE缓冲液 , 5×TBE
液 , CTAB-free液 , 2×CTAB提取缓冲液 , 70%乙醇 , 1%溴化
乙锭(EB),以上试剂均由孝感学院生科院药库提供的相关
药品配制。 PTC-100 PCR仪 ,美国 MGREACHE公司生产;
FR-980凝胶成像系统 ,上海复日科技有限公司生产;DW-ML
超低温冷冻储存箱 ,中科美菱低温科技有限责任公司生产;
DYY-7C电泳仪和 DYY-Ⅲ电泳槽 ,北京六一仪器厂生产;
TGL-20M高速台式冷冻离心机 ,长沙湘仪离心机仪器有限公
司生产。
1.2　方法
1.2.1　基因组 DNA的提取。采用改良 CTAB法。将 4种莎
草科植物的叶状茎速冻研磨 ,各步骤添加相应试剂 ,经过冰
浴 ,离心 ,水浴 ,高速离心 ,漂洗风干 , TE溶解 ,于 -20 ℃冰箱
中保存备用 。
1.2.2　基因组 DNA的琼脂糖凝胶电泳检测。将各植物所提
取的 DNA用 0.7%琼脂糖(含少量 EB)凝胶电泳 ,缓冲液为
0.5×TBE,在 100V电压下电泳 1h,用凝胶成像系统拍照。
1.2.3　引物的筛选。引物筛选所用的反应体系为:10 ×缓
冲液(含 BSA)2.0 μl, dNTP2.0 μmol/L,引物 1.0 μmol/L,
MgCl2 2.0 mmol/L, TaqDNA聚合酶 1.0 U,模板 DNA50.0
ng。加样混匀离心 ,设定 PCR反应条件 ,进行 PCR反应。
PCR产物经制胶 、点样 、电泳后在紫外分析仪上检测 ,并在凝
胶成像仪上拍照 [ 4] 。
1.2.4　RAPD分析。统计扩增产物条带数 ,采用 SPSS18.0
安徽农业科学 , JournalofAnhuiAgri.Sci.2010, 38(36):20551-20553 责任编辑　乔利利　责任校对　李岩
软件计算遗传相似系数和遗传距离 ,建立聚类分析图。
2　结果与分析
2.1　4种莎草科植物基因组 DNA电泳结果 　用改良
CTAB法提取栽培荸荠 、野生荸荠 、蒲草和扁杆藨草基因组 ,
这 4种莎草科植物基因组 DNA纯度均较高 ,可用于 RAPD-
PCR试验(图 1)。引物 841、842、807、840分别扩增这 4种
莎草科植物的基因组 DNA(图 2),其中引物 841和 842得
到的条带较多 , 841条带更清晰(图 3)。加了牛血清蛋白
(BSA)的 PCR反应体系扩增出的 DNA条带较清晰 ,而未加
BSA的 PCR反应体系扩增出的 DNA条带几乎不可见 ,差异
非常明显(图 4)。
注:M分别是 1kbDNAMarker(左)、200bpDNAMarker(右);1 ～
4分别是栽培荸荠、野生荸荠、蒲草和扁杆藨草。
Note:M.1kbDNAMarker(left), 200bpDNAMarker(right);1-
4areculturedwaterchestnut, wildwaterchestnut, Lepironiaar-
ticulateandScirpusplaniculmis.
图 1　用改良 CTAB法提取 4种莎草科植物基因组电泳结果
Fig.1　ElectrophoregramoffourCyperaceaegenomeextracted
byCTABmethod
注:M是 200bpDNAMarker;1～ 4为 841引物、5～ 8为 842引物、9
～ 12为 807引物、13～ 16为 840引物分别扩增栽培荸荠、野生
荸荠、蒲草和扁杆藨草基因组 DNA得到的条带。
Note:M.200bpDNAMarker;1-4arebandsbyusing841primersto
amplifywaterchestnut, 5-8arebandsbyusing842primersto
amplifywildwaterchestnut, 9-12arebandsbyusing807prim-
erstoamplifyLepironiaarticulate, 13-16 arebandsbyusing
840primerstoamplifyScirpusplaniculmis.
图 2　RAPD反应体系中引物筛选的电泳结果
Fig.2　ElectrophoresisresultsofprimerselectinginRAPDsys-
tem
2.2　RAPD条带数据分析　根据图 3, RAPD扩增带的有 、
无分别用 “l”和 “0”记录 ,利用 SPSS18.0软件进行统计处
理 ,根据遗传距离采用聚类法进行聚类分析 。由图 5可知 ,
栽培荸荠和野生荸荠的亲缘性较近 ,蒲草和扁杆藨草的亲缘
性较近 ,且栽培荸荠和蒲草的亲缘性相对于扁杆藨草而言
更近。
3　结论与讨论
(1)RAPD技术在动物 [ 5] 、植物 [ 6-7] 、微生物 [ 8-9]等生命
注:M是 200bpDNAMarker;1～ 4分别为栽培荸荠、野生荸荠、蒲
草和扁杆藨草。
Note:M.200bpDNAMarker;1-4areculturedwaterchestnut, wild
waterchestnut, LepironiaarticulateandScirpusplaniculmisre-
spectively.
图 3　引物 841进行 4种莎草科植物 RAPD-PCR扩增结果
Fig.3　Primer841RAPD-PCR amplificationresultforfour
Cyperaceae
注:M是 200bpDNAMarker;1、3、5、7、9和 2、4、6、8、10分别是加
了和未加BSA的 PCR反应体系扩增栽培荸荠基因组 DNA得
到的条带。
Note:M.200bpDNAMarker;1, 3, 5, 7, 9and2, 4, 6, 8, 10arebands
withorwithoutBSAPCRsystemamplifyingwaterchestnut
DNA.
图 4　加和未加 BSA栽培荸荠基因组 DNARAPD电泳结果
Fig.4　WithorwithoutBSAculturingwaterchestnutgenome
DNARAPDelectrophoregram
注:1～ 4分别代表栽培荸荠、野生荸荠、蒲草和扁杆藨草。
Note:1-4standforculturedwaterchestnut, wildwaterchestnut, Lep-
ironiaarticulateandScirpusplaniculmisrespectively.
图 5　使用平均联结(组间)的聚类树状分析
Fig.5　Clusteringtreebyusingaveragelinkage(amonggroup)
科学领域被广泛应用。在 RAPD技术中 ,任意引物 DNA标
记对遗传指纹和促进基因定位克隆可能是非常有用的 [ 10] 。
20552 　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2010年
RAPD和 ISSR标记曾被用来分析中国南部的有扩散危害的
植物凤眼莲 6个群的基因结构 ,结果显示中国南部凤眼莲遗
传多样性非常低 ,所有的群很可能由相同的基因型构成 ,提
示了凤眼莲适应性强 、迅速蔓延的相关原因 [ 11] 。原生质体
的融合实现了性不兼容的两物种间单基因与多基因遗传性
状的转移 ,这种途径对土豆非常适合 ,且体细胞杂交已被引
进用到性不兼容性野生物种的抗病基因进入栽培型土豆基
因库之中 。为了便于识别早期的杂交融合 , RAPD技术被用
于揭示土豆种内与种间体细胞杂交的分子特征 [ 12] 。
(2)该研究采用 4个随机引物通过 RAPD法对莎草科的
栽培荸荠 、野生荸荠 、蒲草和扁杆藨草基因组 DNA扩增的条
带进行了分析 ,发现这 4种莎草科植物具有较高的遗传多样
性。其中栽培荸荠和野生荸荠的遗传差异性相对另 2种莎
草科植物而言不大 ,蒲草和扁杆藨草的亲缘性相对荸荠而言
较近。由于栽培荸荠和野生荸荠的亲缘性较近 ,因此在杂交
育种上的成功率较大。
(3)对于进一步深入研究而言 ,可用 RAPD来有效筛选
栽培品种与野生型品种的杂交后代。得到的后代需与栽培
品种进行多次回交 ,以保持栽培型品种的理想性状 ,同时淘
汰野生型品种的不良性状。最后选择最佳的配种组合 ,以获
得具优良性状的荸荠新品种。
(4)由于荸荠以球茎无性繁殖为主 ,因此荸荠的品种改
良可采用无性繁殖与有性杂交相结合的途径 ,将杂交优势加
以固定 ,选育出具有杂种优势的杂交种 ,其品质 、产量和抗逆
性得到提高的可能性较大。
参考文献
[ 1] 李梅.用牛血清白蛋白改善荸荠基因组DNA的 RAPD扩增 [ J] .湖北
农学院学报 , 1999, 19(3):284-285.
[ 2] LIMEI.Identificationoftwoclosely-relatedspeciesofeleocharis:EdulcisandEsphacelatausingRAPDanalysis[J].JournalofHubeiAgricultural
colege, 1998, 18(3):213-217.
[ 3] JIANGW, CHENLJ, LIYR, etal.ExtractionofgenomicDNAandestab-
lishmentofRAPDreactionsystemforwaterchestnut(Eleocharistuberose-
RoemetSchult)[ J].GuangxiAgnculturalScience, 2009, 40(3):229-
232.
[ 4] 曹后男,宗成文,赵成日,等.RAPD标记在桃品种鉴定中的应用[ J].延
边大学农学学报, 2003, 25(2):79-85.
[ 5] 姜振 ,蔡明文 ,徐世清 ,等.基于RAPD和SSR分子标记的家蚕部分实
用品种多态性及其亲缘关系分析 [ J] .蚕业科学 , 2010, 36(1):157-
164.
[ 6] SWAILEHKM, HUSSEINR, EZZUGHAYYARA.Evaluatingwastewater-
inducedplantgenotoxicityusingrandomlyamplifiedpolymorphicDNA
[J] .EnvironToxicol, 2008, 23(1):117-122.
[ 7] CHENKT, SUYC, LINJG, etal.IdentificationofAtractylodesplantsinChineseherbsandformulationsbyrandomamplifiedpolymorphicDNA
[J] .ActaPharmacolSin, 2001, 22(6):493-497.
[ 8] BELKUMA, PELT-VERKUILE, HAYSJP.Theapplicationofrandomly
amplifiedDNAanalysisinthemolecularepidemiologyofmicroorganisms
[J] .MethodsMolBiol, 2009, 551:37-47.
[ 9] BEESONKE, ERDNERDL, BAGWELLCE, etal.Diferentiationof
plasmidsinmarinediazotrophassemblagesdeterminedbyrandomlyampli-
fiedpolymorphicDNAanalysis[J] .Microbiology, 2002, 148(Pt1):179-
189.
[ 10] WALDRONJ,PEACECP,SEARLEIR,etal.RandomlyAmplifiedDNAFingerprinting:ACulminationofDNAMarkerTechnologiesBasedonAr-
bitrarily-PrimedPCRAmplification[ J].JBiomedBiotechnol, 2002, 2
(3):141-150.
[ 11] LIWG, WANGBR, WANGJB.Lackofgeneticvariationofaninvasive
clonalplantEichhorniacrasipesinChinarevealedbyRAPDandISSR
markers[J].AquaticBotany, 2006, 84(2):176-180.
[ 12] BAIRDE, COOPER-BLANDS,WAUGHR, etal.Molecularcharacterisa-
tionofinter-andintra-specificsomatichybridsofpotatousingrandomly
amplifiedpolymorphicDNA(RAPD)markers[J].MolGenGenet, 1992,
233(3):469-475.
[ 13] WANGSX, LIUY, GENGXL, etal.OptimizationofRAPDreactionsys-
temongenomicDNAofA-grocybechaxinguHuang[ J].Agricultural
Science＆Technology, 2008, 9(3):31-34.
[ 14] YUEQN, GEJ, WANGL, etal.Geneticdiversityinmaincultivarsof
saflowerinXinjianguighurautonomousregionbasedonRAPDanalysis
[J].AgriculturalScience＆Technology, 2008, 9(4):34-38.
[ 15] ZHANGJZ, XIANGZF, XIEHB.RAPDanalysisofMicropterussalmo-
idesandTilapianilotica[ J].AgriculturalScience＆Technology, 2009, 10(6):37-39.
(上接第 20550页)
[ 15] AGRAWALGK, IWAHASHIH, RAKWALR.RiceMAPKs[ J].Bio-
chemicalandBiophysicalResearchCommunications, 2003, 302(2):171-
180.
[ 16] MAJOULT, CHAHEDK,ZAMITIE, etal.Analysisbytwo-dimensional
electrophoresisoftheefectofsaltstressonthepolypeptidepaternsinrootsofasalt-tolerantandasalt-sensitivecultivarofwheat[ J].Electro-
phoresis, 2000, 21(12):2562-2565.
[ 17] OUERGHIZ,R MYR, OUELHAZIL,etal.Two-dimensionalelectropho-
resisofsolubleleafproteins, isolatedfromtwowheatspecies(Triticum
durumandTriticumaestivum)diferinginsensitivitytowardsNaCl[ J].
Electrophoresis, 2000, 21(12):2487-2491.
[ 18] MENGSC, ZHANGHY,LIUPY, etal.Efectsofultra-dryingtreat-
mentonlargeamountsoffourkindsofcropseeds[ J].AgriculturalSci-
ence＆Technology, 2009, 10(2):82-85, 89.
[ 19] 张雪梅 ,池利民.当前旱情下过冬作物的保护措施 [ J].畜牧与饲料科
学, 2009, 30(2):145.
[ 20] AIHJ, ZHANGX, LIUCY, etal.Analysisofheavymetalcontentinfood
cropsplantedalongtheShaanxiinnerMongoliaexpressway[ J].Agricul-
turalScience＆Technology, 2009, 10(3):108-111, 119.
[ 21] 张振云.作物酸害及防治技术探讨[ J].畜牧与饲料科学 , 2010, 31(3):
199.
[ 22] LIUH, WANGLK, XIONGDJ.Adaptiveevolutionoflargesubunitsof
RubisCOinmagnoliaphytacrops[J] .AgriculturalScience＆Technology,
2009, 10(4):8-11, 18.
[ 23] 张劲君,李荣 ,蔡继琨,等.EM粪肥对玉米等作物生长的影响试验
[ J].畜牧与饲料科学, 2006, 27(3):27-28.
2055338卷 36期　　　　　　　　　　　　　　　　曹姣等　RAPD法研究孝感荸荠和野生荸荠的遗传差异性