全 文 ：·基础研究 ·
木霉肽类代谢产物对豇豆
土著根瘤菌遗传性状的影响 ①
梁志怀 1, 3 , 申爱荣 4 , 魏　林 2, 3＊ , 罗赫荣 3
(1.湖南农业大学生物安全与技术学院 , 湖南 长沙 410128;2.中南林业科技大学 , 湖南 长沙 410004;
3.湖南植物保护研究所 , 湖南 长沙 410125;4.湖南林业科学院 , 湖南 长沙 410004)
摘　要:利用 RAPD与 ISSR分子标记检测手段 , 分析了哈茨木霉 T2-16肽类代谢产物处理豇豆土著根瘤菌 , 对
其遗传性状的影响 , 同时 , 比较了 RAPD和 ISSR两种不同分子标记在检测根瘤菌种间的遗传相似性以及遗传变
异性的分辨力。实验中 ,从 100条引物中筛选到具有多态性的 ISSR引物 5条 , 从 80条引物中筛选到具有多态
性的 RAPD引物 6条 ,用 5条 ISSR引物扩增出 54条带 , 多态性条带比率为 75.93 %;6条 RAPD引物扩增出 61
条带 , 多态性条带比率为 68.85 %。两种分子标记均能揭示出处理前后根瘤菌间的遗传差异 , 但 ISSR标记比
RAPD标记可检测到更大的遗传变异。根据两种标记的结果 , 对供试的根瘤菌进行聚类分析 , 结果表明 , 土著根
瘤菌经木霉肽类代谢产物处理后 , 与出发菌株相比 ,表现出一定程度的遗传分化和遗传差异性。
关键词:哈茨木霉;肽类物质;土著根瘤菌;遗传多样性
中图分类号:Q939.11 +4
文献标识码:A
文章编号:1007-7146(2009)02-0210-08
EfectsofPeptideMetabolicProductofTrichodermaharzianumon
GeneticDiversityofCowpeaIndigenousRhizobium
LIANGZhi-huai1, 3 , SHENAi-rong4 , WEILin2, 3＊ , LUOHe-rong3
(1.CollegeofBiologicalScienceandTechnology, HunanAgricultureUniversity, Changsha410128, Hunan, China;
2.CentralSouthUniversityofForestryandTechnology, Changsha410004, Hunan, China;
3.HunanPlantProtectionResearchInstitute, Changsha410125, Hunan, China;
4.HunanAcademyofForestrySciences, Changsha410004, Hunan, China)
Abstract:ThepeptidemetabolitesofTrichodermaharzianumwasobtained.Then, thecowpeaindigenousrhizobium
wastreatedwiththepeptidemetabolites.Thegeneticdiversityamongtheserhizobiumstainsweredeterminedbyrandom
amplifiedpolymorphicDNA(RAPD)andinter-simplesequencerepeat(ISSR)molecularmarkers.Atthesametime,
wecomparedtwodifferentmolecularmarkers, theRAPDandISSR, indetectionofrhizobiumspeciesandthegenetic
similarity.5 ISSRprimersand6 RAPDprimerswereselectedtoidentifywithpolymorphism.ForISSRanalysis, 54
bandswereproduced, inwhich41 bandswerepolymorphic.Percentageofpolymorphicbandswas75.93.ForRAPDa-
nalysis, intotal61 bandswereproduced, inwhich42 bandswerepolymorphic.Percentageofpolymorphicbandswas
68.85.Theresultsshowedthattwomolecularmarkerscouldbedetectedrevealingthegeneticdifferencesamongrhizobi-
umstains, andISSRcouldbeusedtodetectmoregeneticvariationthanRAPDmarkers.Accordingtotheresultsofthe
第 18卷第 2期
2009年 4月 　　　　　　　　　　
激　光　生　物　学　报
ACTA　LASER　BIOLOGY　SINICA　　　　　　　　　　　Vol.18 No.2Apr.2009
①收稿日期:2008-09-20;修回日期:2008-11-20
基金项目:湖南省科技攻关重点项目(2006NK2017);国家 “十一五”科技支撑计划项目(2006BAD17B08)
作者简介:梁志怀(1968—),男 ,博士研究生 , 主要从事农作物病害生物防治研究工作。 (电话)0731-4693299
＊通讯作者:(电话)0731-4693299;(电子邮件)weilincn@163.com
twomarkersontrialfortherhizobiumclusteranalysis, theresultsshowedthattheindigenousrhizobiumtreatedwithTri-
chodermapeptidemetabolites, comparedwiththeoriginalstrain, demonstratedacertaindegreeofgeneticdiferentiation
andgeneticdiference.
Keywords:Trichodermaharzianum;peptide;indigenousrhizobium;geneticdiversity
　　我们前期研究表明 ,哈茨木霉 T2-16发酵产物中
肽类物质可影响土著根瘤菌的表型性状 ,处理菌株
在碳源和氮源利用 、抗药性 、耐药性等表型性状方面
与出发菌株存在一定的差异 ,进而使土著根瘤菌与
寄主的亲和性 ,竞争结瘤能力及固氮活性都得以提
高 [ 1-2] 。根瘤菌结瘤 、固氮能力与根瘤菌的遗传特性
密不可分 ,因此 ,木霉对土著根瘤菌的这种表型的改
变 ,是否也为根瘤菌的遗传物质改变所引起的需要
进一步研究 。本文应用随机扩增 DNA片段多态性
(RAPD)和简单重复区间序列扩增多态性 (ISSR)两
种分子标记技术 ,就此进行了研究 。
1　实验材料
木霉菌及其肽类物质的制备:供试木霉菌株及
肽类代谢产物同参考文献 [ 1] 。
供试土著根瘤菌:获得及培养方法同参考文献
[ 2 ] 。
实验中所用的 100条 ISSR引物序列来自 Uni-
versityofBritishColumbia,由宝生物工程 (大连 )有限
公司合成 ;所用的 100条 RAPD引物序列来自 Operon
公司。
2　实验方法
2.1　供试土著根瘤菌的处理和培养
将供试豇豆根瘤菌的出发菌株培养在两种液体
培养基上:一为含 0.01 %哈茨木霉肽类代谢产物的
Y.E.M.液体培养基;一为不含该代谢产物的普通
Y.E.M.液体培养基 。将接种后的菌株置于 28 ℃恒
温摇床中培养 60 h,再分别将不同培养液中的菌株
在 Y.E.M.固体培养基上进行划线培养 ,挑取不同处
理根瘤菌单菌落进行纯化培养后作为种子菌供试。
2.2　供试土著根瘤菌基因组 DNA的提取及检测
具体操作参照文献 [ 3]的方法 ,提取的 DNA质
量和浓度采用琼脂糖凝胶电泳和 GeneQuant检测。
2.3　供试菌株 ISSR分析
以土著根瘤菌出发菌株的基因组 DNA和哈茨木
霉肽类物质处理的土著根瘤菌基因组 DNA为材料 ,
对试验所用的 100个 ISSR引物进行筛选 。 ISSR-
PCR扩增体系优化后总体积为 20 μL,其中包括:1 ×
PCR缓冲液 (Mg2+ free), MgCl2 1.5 mmol/L, dNTPs
各 0.1 mmol/L, Taq酶 1U(均购自 Takara公司 ),引
物 0.2 μmol/L,基因组 DNA50 ng,最后加 20 μL无
菌矿物油覆盖。
使用优化后的 PCR反应程序为 :95 ℃ 5 min;
94 ℃ 45 s, 55 ℃ 45 s, 72 ℃ 1 min, 40个循环;72 ℃
延伸 6 min, 4 ℃ 保存。 PCR反应在 GeneAmpPCR
System9600上进行。 PCR反应结束后 ,加入 1/6倍
体积的 6×loadingbufer(购于宝生物公司)混匀 ,扩
增产物用 1.5 %的琼脂糖凝胶电泳检测。
2.4　供试菌株 RAPD分析
分别以土著根瘤菌出发菌株 DNA与哈茨木霉肽
类物质处理的根瘤菌菌株的 DNA为模板进行引物
筛选。
PCR扩增体系总体积为 25 μL,其中包括 :1 ×
PCR缓冲液 (Mg2+ free), MgCl2 2.5 mmol/L, dNTPs
各 0.2 mmol/L, Taq酶 1 U(均购自大连宝生物工程
有限公司 ),引物 0.5 mol/L,基因组 DNA30 ng,分
装于 96孔 PCR板 (Costar),最后加矿物油 20 μL覆
盖 。
PCR反 应 程 序 为:95 ℃预 变 性 1 min;
94 ℃ 1 min, 38 ℃ 1 min, 72 ℃ 2 min, 40个循环;
94 ℃ 1 min, 37 ℃ 1 min, 72 ℃延伸 5 min;4 ℃下保
存 。 PCR反应在 GeneAmpPCRSystem9600上进行。
扩增产物的检测同 ISSR分析。
2.5　数据分析
将 ISSR和 RAPD电泳胶图进行人工读带 ,将所
观察的每一条清晰的谱带视为一个形态性状 ,作为 1
个位点 ,有此带赋值为 “1” ,无则记为 “0”。应用 UPG-
MA软件对其进行系统聚类分析 ,构建聚类图 ,比较哈
茨木霉肽类物质处理前后土著根瘤菌的遗传差异性。
3　结果与分析
3.1　哈茨木霉肽类代谢产物对土著根瘤菌遗传
性状的影响
3.1.1　RAPD分析　RAPD引物的筛选 　分别以
对照根瘤菌和经木霉菌肽类代谢产物处理的根瘤菌
总 DNA为模板 ,利用 RAPD-PCR,结合琼脂糖凝胶电
泳分离 、溴化乙锭染色对 100条 RAPD引物(分 5组 ,
211第 2期　　　　　　　　　　梁志怀等:木霉肽类代谢产物对豇豆土著根瘤菌遗传性状的影响　　　　　　　　　
每组 20条)进行筛选。
几乎所有引物均有扩增产物 ,但有些引物的扩
增产物区分不出对照菌株与处理菌株间的差异 ;有
些条带不清晰 ,很难分辨出菌株间的差异。最后在
供试的 100个 RAPD引物中筛选出多态性好的引物
20个 ,图 1为这 20个引物对哈茨木霉 T2-16菌株肽
类代谢产物处理过的土著根瘤菌 4-1菌株 DNA的扩
增结果。
图 1　根瘤菌 RAPD引物筛选(部分)
Fig.1　PrimerscreeningofrhizobiumRAPD
从初筛出的 20个引物中选择出 6个最清晰且多
态性高的引物进行标记分析。这 6个引物分别为 :
OPL04 GACTGCACAC, OPAQ16 CCCGGAAGAG, OP
AN15 TGATGCCGCT, OPAT10 ACCTCCGGTC, OP
P05 CCCCGGTAAC, OPAK14 CTGTCATGCC。它们
PCR扩增结果见表 1和图 2、3、4、5、6和 7。
PCR扩增结果　统计图 2-7中的条带数 ,可知这
6个 RAPD引物共扩增出 61条重复性高的清晰条
带 ,分子量从 100 ～ 1 000 bp。在所筛选出的 6个引
物所扩增出的 61条谱带中 ,多态性条带为 42条 ,平
均每条引物扩增 7.0个多态性条带 ,多态性条带比
率 (PPB)为 68.85 %(见表 1)。在图 2到图 7中 ,每
一个图谱都是每四个泳道一组(除 Marker外),每组
中 ,第一泳道为出发菌株 (对照菌株 ,记为 CK)单菌
落提取的 DNA扩增谱带 ,第 2-4泳道为相对应的经
木霉肽类代谢产物处理后的根瘤菌单菌落提取的
DNA扩增谱带(记为 T)。
比较对照与处理的谱带 ,结果表明两者间具有
差异 ,表明哈茨木霉肽类代谢产物处理土著根瘤菌
后 ,与出发菌株相比 ,表现出一定的遗传差异性 。而
所有经肽类代谢产物处理的菌株 DNA扩增谱带则
相似性很高。
3.1.2　ISSR分析　ISSR引物的筛选 　以原始根
瘤菌(对照)和经木霉 T2-16菌株肽类代谢产物处理
的根瘤菌总 DNA为材料对 100条 ISSR引物进行筛
选 。扩增产物用 1.5 %的琼脂糖凝胶(5 V/cm)电泳
检测 ,在 VDS上观测结果 ,条带清晰 、多态性好的引
物重复扩增 1次 。由此筛选出能扩增出有差异 、清
晰 、稳定带的引物 5个 ,分别为 XBP3:(CA)8T;XBP
10:(AC)8YT;XBP37:(ACC)5;XBP51:(CTAG)4;
XP28:(GTT)6。
PCR扩增结果　筛选出的 5个引物 PCR扩增结
果分别见图 8到图 12.各图谱也是以四个泳道为一
组 (Marker除外),每组中 ,第一泳道为出发菌株(对
照菌株 ,记为 CK)单菌落提取的 DNA扩增谱带 ,第
2-4泳道为相对应的经木霉肽类代谢产物处理后的
根瘤菌单菌落提取的 DNA扩增谱带 (记为 T)。 5个
引物所扩增出的 54条谱带中 ,多态性条带为 41条 ,
平均每条引物扩增 8.2个多态性条带 ,多态性条带
比率(PPB)为 75.93 %(见表 1)。
上:1:CK1;2-4:T1-1-T1-3;5:CK2;6-8:T2-1-T2-3;
9:CK3;10-12:T3-1-T3-3;13:CK4;14-16:T4-1-T4-3;
17:CK5;18-20:T5-1-T5-3;21:CK6;22-24:T6-1-T6-3;
下:1:CK
7
;2-4:T
7-1-T7-3;5:CK8;6-8:T8-1-T8-3;
9:CK9;10-12:T9-1-T9-3;13:CK10;14-16:T10-1-T10-3;
17:CK
11
;18-20:T
11-1-T11-3;21:CK12;22-24:T12-1-T12-3
图 2　AQ16引物 PCR扩增产物图
Fig.2　ResultofPCRamplificationusingprimerL04
212　　　　　　　　　　　　　　激　光　生　物　学　报　　　　　　　　　　　第 18卷
213第 2期　　　　　　　　　　梁志怀等:木霉肽类代谢产物对豇豆土著根瘤菌遗传性状的影响　　　　　　　　　
表 1　不同处理根瘤菌 ISSR和 RAPD标记的扩增结果
Tab.1　AmplificationofthedetectedofISSRandRAPDmarkersinrhizobium
多态性引物
Numberof
polymorphicprimers
多态性引物扩增
出的总条带数
TotalDNAbands
amplified
平均每条引物
扩增出的带数
Averagebands
ofeachprimer
多态性条带的总数
Totalpolymorphic
DNA
多态性条带占
总数的百分率(%)
Percentageof
polymorphicbands
ISSR 5 54 10.8 41 75.93
RAPD 6 61 10.2 42 68.85
上:1:CK1;2-4:T1-1-T1-3;5:CK2;6-8:T2-1-T2-3;
9:CK3;10-12:T3-1-T3-3;13:CK4;14-16:T4-1-T4-3;
17:CK5;18-20:T5-1-T5-3;21:CK6;22-24:T6-1-T6-3;
下:1:CK7;2-4:T7-1-T7-3;5:CK8;6-8:T8-1-T8-3;
9:CK9;10-12:T9-1-T9-3;
图 7　AK14引物 PCR扩增产物
Fig.7　ResultofPCRamplificationusingprimerAK14
　　在图 8-12中 ,标记 CK1 ～ CK9的泳道为对照菌
株单菌落提取的 DNA扩增谱带 ,每个对照菌株后 3
个均为相对应的被处理后的菌株单菌落提取的 DNA
扩增谱带(标记为 T1 -T9 的泳道)。图中 Marker分子
量为 100 bp。由图中可看出 ,经木霉 T2-16肽类代谢
产物处理后 ,供试菌株间出现了较明显的遗传差异
性 。
3.2　RAPD和 ISSR标记检测土著根瘤菌遗传多
态性比较
在所筛选的 RAPD和 ISSR引物所扩增的图谱
中 , ISSR分析中 XBP3引物扩增所用的根瘤菌模板
DNA与 RAPD分析中 AT10引物扩增所用的根瘤菌
模板 DNA为完全相同的一组材料 ,对它们的扩增结
果进行聚类分析 ,所得聚类图见图 13和图 14。比较
214　　　　　　　　　　　　　　激　光　生　物　学　报　　　　　　　　　　　第 18卷
两图可看出 ,用 RAPD标记的数据计算的 36个菌株
种内的遗传相似系数范围 (0.55 ～ 1.00),与用 ISSR
标记的数据计算的 36个菌株种内的遗传相似系数
范围(0.54 ～ 1.00)较一致 ,表明两种标记检测出的
遗传相似趋势相似 。但在 0.9 ～ 1.00这个遗传相似
系数范围内 , RAPD标记的各菌株被聚为五类 ,而 IS-
SR标记的各菌株被聚为十类。即 RAPD标记较 IS-
SR标记提高了供试材料间的遗传相似性 ,也即 ISSR
更能检测和发现供试根瘤菌种内的遗传差异性。例
如 , RAPD标记的 1号菌株对照与处理间的遗传相似
系数为 0.92,而 ISSR标记的 1号菌株对照与处理间
的遗传相似系数仅为 0.76;即使同为对照 , RAPD标
记的 3号和 4号供试菌株的对照菌株间的遗传相似
系数为 0.93,而 ISSR标记的两个菌株间的遗传相似
系数则为 0.78。
　　分析结果还发现 ,在 ISSR标记聚类中 ,多数供
图 12　XP28引物 PCR扩增产物
Fig.12　ResultofPCRamplificationusingprimerXP28
试菌株表现为不同对照菌株遗传相似系数较为接
近 ,被聚在相近的几类 ,如 CK1、CK2、CK3、CK6遗传
相似系数相近 , CK4、CK7、CK8、CK9遗传相似系数
相近;而所有被木霉肽类代谢产物处理的供试菌株
遗传相似系数较为接近 ,被聚在相近的几类 ,如 T1、
T4、T5和 T6, T2和 T3 , T7、T8和 T9均在遗传相似系
数在 90 %以上时聚为一类 ,与出发菌株(对照菌株 )
相似系数则相对较小 ;而 RAPD标记聚类中 ,多为作
为对照的出发菌株与相对应木霉肽类代谢产物处理
的菌株遗传相似系数较高 ,被先聚为一类 ,如 CK1与
T1、CK3与 T3、CK4与 T4、CK5与 T5、CK6与 T6等 ,
再与其它菌株聚为一类 ,这也表明 ISSR标记比
RAPD标记能更灵敏地反映出土著根瘤菌遗传性状
上的变异 ,检测出种内的遗传差异性。
4　讨论
木霉肽类代谢产物可对土著根瘤细菌遗传物质
产生影响 ,这对丰富根瘤菌固氮结瘤理论和拓宽木
霉菌应用范围 ,以及利用天然的生物源物质作为土
著根瘤细菌的诱变剂 ,选育出固氮活性更优良的土
著根瘤细菌具有重要作用。我们发现这一现象伊
始 ,认为木霉菌发酵产物能增强土著根瘤菌固氮活
性 ,是因为其对根瘤菌遗传物质转录水平上的影响 ,
一般不会影响到其遗传物质。但随后多次试验 ,结
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果表明该木霉肽可影响供试土著根瘤菌的遗传性
状 。究其原因 ,该木霉肽类物质是含有 α-氨基异丁
酸的肽醇类物质 ,具有水脂双亲特性 ,可穿过细胞
膜 ,进入拟核区 ,进而极可能对根瘤菌的 DNA产生
影响。例如日本的佐佐木康晴在申请的中国发明专
利 《植物活化剂及其制备方法 ,活化方法 、活性促进
剂及其使用方法 》(申请号为 00807600)的说明书中
说 , “木霉菌代谢产物中 ,存在着一种新型肽醇类物
216　　　　　　　　　　　　　　激　光　生　物　学　报　　　　　　　　　　　第 18卷
质 ,由植物的根吸收 ,到达茎叶 ,然后消失。推测在
最初被植物吸收的阶段 ,使植物的 DNA发生什么变
化或残留下来。不知为什么 ,一旦植物获得抗菌性 ,
不管其分化生成根 、茎等 ,抗菌性能够持续 ”。如果
佐佐木康晴先生推论成立的话 ,既然木霉菌对植物
这种高等真核生物的遗传物质能够有如此影响 ,那
么 ,对根瘤菌这种原核生物的 DNA存在较明显的影
响 ,就更为容易些 。
本文中所应用的 ISSR分子标记技术具有重复性
好 、稳定性高和多态性丰富等优点 ,目前该技术已广
泛应用于植物的遗传多样性和品种鉴定方面的研
究 ,在微生物的研究中主要是应用于大型真菌等真
核生物的遗传多样性的研究 [ 4-5] ,在根瘤菌等原核微
生物遗传变异方面的研究还鲜有报道 。而 RAPD具
有 DNA用量少 、快速 、高效和操作简单等特点 ,现已
有应用该技术进行根瘤菌遗传多样性研究的报
道 [ 6] 。目前 ,联合应用 ISSR和 RAPD技术对根瘤菌
种群进行鉴定也尚未见报道 。本研究综合了两种方
法的优点 ,以此研究木霉菌肽类代谢产物对豇豆土
著根瘤菌遗传性状的影响。试验结果表明 , ISSR较
RAPD更能检测和发现种内的遗传差异性 ,反映出
ISSR标记对揭示根瘤菌遗传多态性的效率和分辨力
的准确性和科学性比 RAPD高。显然 ,这与它们对
基因组 DNA进行扩增时引物结合位置不同有关 。
因为 ISSR的引物中包含有一定长度的重复序列 ,与
它结合的目标序列 (多为微卫星)在 DNA复制过程
中存在滑动和不均等交换等现象 ,使它们在不同个
体间的重复次数存在差异 ,更易于导致引物结合位
点和两结合位点间的片段长度产生变异。因此 ,与
RAPD分析比较 , ISSR对基因组 DNA所检测到遗传
多态性能力更高 。本文的结果也与该理论相吻合 ,
应用 ISSR标记获得了比 RAPD标记更多的多态性条
带和更高的多态比率 ,更合理地揭示了种内的遗传
差异性和遗传相似性;这些也与祁建民(用于黄麻属
(Corchorus)遗传多样性研究 )[ 7] 、潘大仁 (用于果蔗
种质资源的遗传多样性)等对真核生物遗传多样性
的研究结果相一致 [ 8] ,他们研究结果也均证实 , ISSR
标记对揭示种间遗传多态性的效率和分辨力的准确
性和科学性比 RAPD高 。本文的试验结果 ,为以 IS-
SR为主要检测方法 、RAPD为验证 ,研究根瘤菌等原
核生物属种间或种内的遗传相似性以及遗传变异性
的异同和分辨力 ,为有效利用 DNA标记技术评价根
瘤菌遗传资源多样性及遗传基础作了有效的探索。
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