全 文 ：第 30卷　第 2期 中 南 林 业 科 技 大 学 学 报 Vol. 30　 No. 2
　 2010年 2月 Journal of Central South University of Forestry& Technology Feb. 2010　
绵毛优若藜冷诱导 SSH文库构建研究
张党权 1 ,明付焕 1 ,江　平 2 ,樊绍刚 1 ,杨自辉 3 ,邓顺阳 1
( 1.中南林业科技大学 经济林育种与栽培国家林业局重点实验室 ,湖南 长沙 410004;
2.兰州大学 土木工程与力学学院 ,甘肃 兰州 730000; 3.甘肃省治沙研究所 甘肃省荒漠化防治重点实验室 ,甘肃 武威 , 733000)
摘　要: 　绵毛优若藜是我国近年成功引种的高抗逆性饲用及防风固沙植物。 以常温下的绵毛优若藜叶片和嫩枝为
对照组 ,冷胁迫诱导处理后的叶片和嫩枝为试验组 ,获得两者高质量 mRN A后反转录成 cDN A, Rsa I消化使其平末端
化 ,试验组 cDNA的 5’ 末端连接上 2个特异接头 ,然后分别与过量对照组 cDNA进行杂交 ,把两份杂交样品混合后 ,与
过量的新鲜变性的对照组 cDNA过夜杂交 ,杂交后的混合液稀释后进行第一轮抑制性 PCR以选择扩增特异表达的
cDN A,然后以第一轮 PCR产物为模板用巢式引物进行二次抑制性 PCR,获得的富集差异表达 cDNA即为绵毛优若藜
冷胁迫 SSH文库。将 SSH文库的 cDNA插入到载体中 ,共获得了 362个克隆 ,为后续绵毛优若藜的抗冻基因克隆与转
基因应用奠定了基础。
关键词: 　绵毛优若藜 ;抑制消减杂交文库 ;冷胁迫 ;抗冻基因 ; cDNA克隆
中图分类号: 　 S332. 5; Q756　　　　　文献标志码:　 A　　　　　文章编号: 1673-923X ( 2010) 02-0065-05
Construction of cold-stressed SSH library of Ceratoides lanata
and sequence analysis of its differentially expressed cDNA
ZHAN G Dang-quan1 , M ING Fu-h uan1 , JIAN G Ping2 , FANG Shao-gang1 , YAN G Zhi-hui3 , DENG Shun-yang1
( 1. The Key Lab of Non-wood Fo rest Products o f Sta te Fo r est ry Administ ration,
Central South Univ er sity o f Fo rest ry and Technolog y, Chang sha 410004, Hunan, China;
2. School of Civil Eng ineering and Mechanics, Lanzhou Univ ersity, Lanzhou 730000, Gansu, China;
3. The Key Lab of Dese rtifica tion Contro l, Gansu Desert Contro l Resea rch Institute, Wuw ei 733000, Gansu, China )
Abstract: As a high str ess r esistance psammophy te with the cha racteristic o f windbreak and sand fixa tion, Ceratoides
lanata had been successfully introduced into China in r ecent y ear s. The leaves and twigs of Ceratoides lanata in r oom
tempera ture w ere used a s the driv er and those tr ea ted by co ld st ress w ere used as tester. The teste r and driv er ds
cDN A we re pr epa red f rom their high qua lity m RN A which w ere purified from th eir to tal RNA. The tester and driv er
cDN A were sepa rately dig ested to obtain sho rte r, blunt-ended molecules by Ras I. Then tw o tester populations w ere
crea ted with differ ent adaptor s, w hile th e driv er cDN A has no adaptor s. Differ entially expressed genes w ere equalized
and enriched by two r ound subtra ctiv e hybridiza tions using excess driv er popula tion a s compared w ith tester
population. The diffe rentially expressed cDNAs were exponentially amplified by first round suppression PCR using
the diluted hybridiza tion product as templa te, and then the seconda ry PCR w as per formed using th e first PCR produc t
as templa te by nested primers to finally enrich the differentia lly expressed cDNAs, which consists o f the SSH libra ry
of Ceratoides lanata. These cDNAs w ere inser ted into v ecto rs and 362 cDN A clones were obtained. The r esult lay s a
founda tion fo r the cDN A cloning o f antifr eeze gene from Ceratoides lanata, a nd their tr ansgenic application.
Key words: Ceratoides lanata; SSH libra ry; cold stress; antifreeze gene; cDNA cloning
* 收稿日期: 2009-08-23
基金项目: 国家自然科学基金资助项目 ( 30700643) ;中南林业科技大学青年基金重点资助项目 ( 05007A)
作者简介: 张党权 ( 1976-) ,男 ,江西抚州人 ,博士 ,副教授 ,研究方向为植物分子生物学与基因工程 ; E-mail: zh angdang quan@ 163. com
DOI : 10. 14067 /j . cnki . 1673 -923x . 2010. 02. 005
　　低温是一种危害严重的自然灾害。植物的低温伤
害可分为冷害 (零上低温对植物的伤害 )和冻害 (零下
低温对植物的伤害 )两大类 ,但冻害所造成的危害要
严重得多 [1 ]。 我国每年因冻害造成的农作物、林木和
花卉等损失高达 200多亿元 ,全球的损失则达数百亿
美元之多 ,特别是 2008年南方冰灾给我国造成数千
亿的经济损失。因而 ,防御植物的低温冻害已是各国
政府和科技人员的重要任务。
植物冻害的机理是比较复杂的 ,一般认为植物抗
冻性能的提高与可溶性糖、膜磷脂、游离氨基酸、特别
是脯氨酸、脱落酸、膜脂肪酸的不饱和度的增加有一
定的关系 [2 ]。近年来采用基因工程技术研究某些重要
物质或新发现物质与植物抗冻性能的关系时 ,发现植
物的抗冻性能除了与自身的组织结构相关外 ,与其自
身表达的抗冻蛋白 ( Antif reeze Pro tein, AFP)有着
直接的联系 [3 ]。
抗冻蛋白自从被发现以来 ,引起了广大科学研究
者的极大兴趣。对植物抗寒基因工程而言 ,植物抗冻蛋
白的发现提供了一个全新的途径 [4 ]。抗冻蛋白是一类
能抑制冰晶生长的蛋白质 ,能在结冰或亚结冰条件下
保护生物体不受伤害。对植物抗冻蛋白的研究开展得
较晚 ,但进展却很迅速 ,如已从草本植物胡萝卜和黑麦
草中克隆了它们的编码基因 [5- 6 ] ,成为植物抗寒工程
中的亮点和突破口。但来源于草本植物的抗冻蛋白的
抗冻活性明显低于木本植物抗冻蛋白的活性 [7 ] ,如沙
冬青抗冻蛋白的活性分别高出胡萝卜抗冻蛋白和黑麦
草抗冻蛋白约 3倍和1倍以上 [ 8]。在应用抗冻蛋白基因
转化植物的研究中 ,我们发现转基因植株抗寒性能的
提高程度与转入的抗冻蛋白活性的高低成正比 [ 9- 10]。
因而 ,找到高活性抗冻蛋白并克隆其编码基因是植物
抗寒基因工程得以有效完成的重要前提之一。
绵毛优若藜 Ceratoides lanata属黎科驼绒黎属常
绿植物 ,原产美洲大陆 ,是重要的饲用及防风固沙植
物 ,是流沙上的先锋植物 [ 11]。近年来 ,我国已成功引入
了绵毛优若藜 ,并已经在西北、华北和东北地区进行了
推广栽培。绵毛优若藜作为一种高度抗逆性的常绿小
灌木 ,被称为“荒漠草原之星” ,在干旱沙区常作为冬季
牧场的主要牧草 ,因而也获得“冬季饲料”的称号 [ 12]。
绵毛优若藜在零下 35℃低温下能安全越冬 ,甚至在零
下 32℃、冻土层深达 1. 28 m的条件下仍能生长良好 ,
表明绵毛优若藜具有极强的抗冻性能 [13- 14 ] ;同时 ,绵
毛优若藜还具有很强的耐热、抗旱、耐盐性 ,以保证在
沙漠中的茁壮生长 [ 15- 16]。因而 ,如何挖掘利用绵毛优
若藜这一树种身上的宝贵基因 (如抗冻基因、耐热基
因、耐旱基因、耐盐碱基因等 )对于绵毛优若藜和其它
植物的遗传改良都具有极其重大的意义和作用 [17 ]。植
物抗逆性提高与改良一直是我国经济植物遗传改良的
重点 ,如果能将绵毛优若藜中的抗冻蛋白基因及其它
抗逆性基因分离克隆并转化至其它抗逆性低的经济作
物 ,提高这些植物的抗逆性特别是抗冻性能 ,将具有重
要的应用价值和理论意义。 绵毛优若藜是我国近年成
功引种的高抗冻性沙生植物 ,其抗冻基因的分离克隆
在国内外都没有进行过相关的研究 [ 18- 21]。基于此 ,本
研究以绵毛优若叶片与嫩枝为研究材料 ,构建了冷诱
导 的抑制 性消减杂 交 ( suppression subtractiv e
hybridiza tion, SSH)文库 ,并进行了 cDN A克隆与鉴
定 ,为后续克隆其抗冻基因打下基础。
1　材料与方法
1. 1　材　料
从甘肃省治沙研究所民勤沙生植物园采取绵毛
优若藜成熟种子 ,将其发芽盆栽后 ,于低温光照培养
箱中 ,每隔 2 h降温 5℃ ,直至零下 15℃ ,恒温处理
0. 5 h。分别采取室温下的绵毛优若藜叶片与嫩枝 (对
照组 )和经冷胁迫处理的绵毛优若藜叶片与嫩枝 (试
验组 ) ,洗净后于超低温冰箱中保存备用。
1. 2　方　法
1. 2. 1　总 RNA提取及 mRNA纯化
采用 To tal RN A Puri fica tion Ki t ( Invi t rogen,
USA)提取目的样品的总 RNA,取 1μL电泳检测完毕
后 , 采 用 mRNA Puri fica tion Ki t ( Amersham
Pharmacia Biotech, USA)纯化mRNA,并于零下75℃
保存备用。
1. 2. 2　抑制性消减杂交文库构建
按 照 SSH 试 剂 盒 ( PCR - Select cDN A
Subtraction Kit , Clontech, U SA)中的操作步骤进行
抑制性消减杂交文库的构建。
1. 2. 3　差异 cDN A片段的克隆与鉴定
将 SSH文库中的差异 cDN A片段与 T载体进行
体外连接 ,并转化大肠杆菌 ,在含有相应抗生素的培
养基上筛选重组子。提取阳性克隆的质粒 ,采用载体
上的一对特异引物进行 PCR扩增分析 ,以确定重组
子中插入片段的 DNA长度。
66 中　南　林　业　科　技　大　学　学　报 第 30卷
2　结果与分析
2. 1　绵毛优若藜的总 RNA提取及 cDN A合成
以常温下的绵毛优若藜叶片和嫩枝为对照组 ,冷
胁迫诱导处理后的叶片和嫩枝为试验组 ,分别提取两
者足量的总 RNA(见图 1) ,并将其纯化出高质量的
m RNA(见图 2) ,将其高质量反转录成 cDN A后 ,进行
Rsa I消化以产生短的平末端的 cDN A(见图 3)。
2. 2　冷胁迫绵毛优若藜 SSH文库构建及克隆鉴定
将 Rsa I消化后的 cDN A进行酚抽提和乙醇沉淀
后 , Rsa I消化的试验组 cDN A在其双链的 5′末端连接
上试剂盒提供的接头 1和接头 2,然后分别和过量的
对照组 cDN A进行消减杂交 ,把两份杂交样品混合
后 ,与过量的新鲜变性的对照组 cDN A过夜杂交 ,杂
交后的混合液稀释后进行两轮 PCR,第一轮用来选择
扩增特异表达的 cDN A,然后以第一轮 PCR产物为模
板用巢式引物进行二次 PCR,所获得的富集的差异表
达 cDN A即为绵毛优若藜冷胁迫 SSH文库 (见图 4)。
将 SSH文库的 cDN A克隆到 T载体中 ,共获得了
362个克隆 (见图 5)。 结果表明 ,所获得差异表达
cDN A片段大小在 200～ 700 bp之间 ,平均长度约为
410 bp。 后续的序列测定与分析正在进行中。
图 1　对照组 (左泳道 )与冷胁迫处理 (右泳道 )
的绵毛优若藜的总 RN A
Fig. 1　 The total RNA of driver ( lef t lane ) and cold-
stressed tester ( right lane) of Ceratoides lanata
　　泳道 M: DN A分子量标准 ;泳道 1: 冷诱导处理的
mRN A;泳道 2:对照组的 mRNA
Lane M: DNA marker; lane 1: m RN A of cold-ind uced
Tes ter; lane 2: mRN A of Driv er
图 2　冷诱导处理与对照组的绵毛优若藜的
mRN A纯化效果
Fig. 2　 The purif ied mRNA of driver and cold-
stressed tester of Ceratoides lanata
　泳道 M: DN A分子量标准 ;泳道 1- 2:冷胁迫处理的绵毛
优若藜的 cDN A(泳道 2)及 RsaI酶切产物 (泳道 1) ;泳道 3- 4:
对照组材料的 cDN A(泳道 4)及 RsaI酶切产物 (泳道 3)
Lane M: DN A marker; lane 1 - 2: cDNA of cold-
s t ress ed tes ter ( lane 1) of Cera toides lanata and i ts digested
p roduct w ith RsaI ( lane 2 ) ; lane 3 - 4: cDN A of cold-
s t ress ed driver ( lane 4) of Ceratoides lanata and i ts digested
p roduct w i th RsaI ( lane 3)
图 3　 cDN A合成与酶切的质量检测
Fig. 3　 Enzymatic digest ion of synthetic cDNA
67第 2期 张党权 ,等: 绵毛优若藜冷诱导 SSH文库构建研究
　　泳道 M: DN A分子量标准 ;泳道 1:正向消减杂交产物的
第一轮 PCR产物 ;泳道 2: 正向消减杂交产物的第二轮 PCR
产物 (以第一轮 PCR产物为模板 )
Lane M: DN A marker; l ane 1: th e fi rst supp ression
PCR result of forw ard subt ractiv e h ybridization p rod uct;
l an e 2: the fi rst su ppres sion PCR resul t of su bt ractive
h ybridization prod uct using
图 4　正向消减杂交产物的两轮抑制性 PCR扩增结果
Fig. 4　 The amplif ied result of forward subtract ive
hybridization product by two rounds
suppression PCR
　　泳道 M: DN A分子量标准 ;泳道 1～ 10: SSH文库插入片
段的长度
Lane M: DNA marker; lane 1～ 10: th e leng th of
cDN A inser ts of SSH lib rary
图 5　绵毛优若藜冷胁迫 SSH文库中 cDNA插
入片段的大小检测
Fig. 5　 The length of cDNA inserts of cold-stressed
SSH library of Ceratoides lanata
3　结论与讨论
经济作物的抗逆性提高与改良一直是我国经济
树种遗传改良的重点 [ 22- 25]。如果能将绵毛优若藜中
的抗冻蛋白基因及其它抗逆性基因分离克隆并转化
至其它抗逆性低的经济作物 ,提高这些植物的抗逆性
特别是抗冻性能 ,将具有极大的应用价值和理论意
义 [26- 28 ]。 本研究首次以冷诱导前后的高抗冻性常绿
灌木绵毛优若藜的叶片与嫩枝为材料 ,采用抑制消减
杂交 ( SSH)技术 ,成功地将绵毛优若藜冷诱导表达的
相关基因的 cDN A富集在几百个克隆中。
绵毛优若藜是我国近年成功引种的高抗冻性树
种 ,其抗冻基因的分离克隆在国内外都没有进行过相
关的研究。高抗冻性木本植物绵毛优若藜在零下 32℃、
冻土层深达 1. 28 m的条件下仍能生长良好 ,表明绵毛
优若藜存在着抗冻活性极强的内源抗冻蛋白 [18, 21 ]。本
项目的研究结果将为绵毛优若藜的高活性抗冻蛋白编
码基因的应用 (如转化不耐寒的经济树种、花卉和农作
物等 )奠定基础 ,同时为绵毛优若藜中的耐热基因、耐
旱基因、耐盐基因等的克隆提供了借鉴。
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[本文编校:邱德勇 ]
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[本文编校:邱德勇 ]
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