全 文 ：分子植物育种，2013年，第 11卷，第 2期，第 262-266页
Molecular Plant Breeding, 2013, Vol.11, No.2, 262-266
技术主题
Technology Feature
东方百合杂种后代试管苗叶片总 DNA提取方法的选择
胡凤荣 1,2* 国荣荣 2 王斐 2 王江勇 3
1北京林业大学,北京, 100083; 2南京林业大学,南京, 210037; 3山东省果树研究所,泰安, 271000
*通讯作者, hufengrong2003@sina,com
摘 要 以东方百合‘Sorbonne’בFrancia’的杂种后代试管苗叶片为材料，采用 CTAB-高盐法、简易 CTAB
法、CTAB-硅珠法和SDS-CTAB法等 4种 DNA提取方法，比较 DNA耗时、纯度、得率、浓度和质量等指标，
以期为东方百合‘Sorbonne’בFrancia’杂种群体大量杂种后代试管苗叶片总 DNA的提取筛选适宜方法。结
果表明，除 CTAB-硅珠法未获得DNA，其余 3种方法均获得条带清晰、完整性好的 DNA。在耗时方面，
CTAB- 硅珠法<简易 CTAB 法
为 57.01 μg/g。综合比较，采用简易 CTAB法进行杂种群体大量试管苗叶片总 DNA提取效果更佳。
关键词 东方百合,杂种后代,试管苗叶片,基因组 DNA,提取方法
Choosing Suitable Method to Extract Genomic DNA from the Leaves of
In-tube Seedling of the Hybrid Offspring of Oriental Lily
Hu Fengrong 1,2* Guo Rongrong 2 Wang Fei 2 Wang Jiangyong 3
1 Beijing Forestry University, Beijing, 100083; 2 Nanjing Forestry University, Nanjing, 210037; 3 Fruit Tree Research Institute of Shandong Province,
Taian, 271000
* Corresponding author, hufengrong2003@sina,com
DOI: 10.3969/mpb.011.000262
Abstract In order to screen the ideal method to extract genomic DNA from the Leaves of in-tube seedling of
oriental lily, the hybrids offspring derived from the cross of Sorbonne × Francia were used as the experimental
materials in this study. We compared the DAN quality and extracting efficiency of the employed DNA extraction
methods, such as SDS-CTAB, Simple and ease CTAB, CTAB-high salt precipitation and CTAB-silica purifi-
cation, in the facets of the purity, yield, concentration, and time consuming to choosing the ideal DNA extraction
method. Three methods can be used to extract DNA with good banding profiles and Integrity except CTAB-silica
purification missing DNA. The orders of the time consuming were from more to less following as CTAB-silica
purification, Simple and ease CTAB, CTAB-high salt precipitation and SDS-CTAB. In the term of DNA purity,
the simple CTAB method got the highest DNA purity than that of the SDS-CTAB and CTAB-high salt
precipitation, which the extracted DNA with the excellent quality with OD260/OD280, 1.98, OD260/OD230, 2.01; while
the concentration of the extracted DNA reached 190.01 ng/μL as well as 57.01 μg/g of the DNA yield. Above all,
Simple and ease CTAB is the most suitable way to extract a great quantity of genomic DNA from the leaves of
in-tube seedling of the hybrid offspring of oriental lily.
Keywords Oriental lily, Hybrid offspring, The leaves of in-tube seedling, Genomic DNA, Extraction method
收稿日期：2012-11-05 接受日期：2012-11-14 网络出版日期：2012-12-28
URL: http://5th.sophiapublisher.com/abstract-1377-mpbopa
基金项目：本研究由江苏省高校优势学科建设工程项目资助
百合 (Lilium spp.)是百合科 (Liliaceae)百合属 (Lilium)多年生球根花卉，除传统药用、食用及提取香
精外，其花姿优美、清香晶莹、气度不凡的特性使其
成为世界上最受欢迎的鲜切花之一，近几年栽培面
积逐年增大，而东方百合(Lilium orienta)因其花色
艳丽、芳香馥郁备受消费者青睐(屈云慧等, 2004)，
‘Sorbonne’和‘Francia’是东方百合中著名的鲜切花
品种(刘湘丹等, 2007)。
经离体和活体检测发现东方百合‘Sorbonne’对
百合灰霉菌表现为高度抗病，而‘Francia’表现为高
度感病 (朱丽梅等 , 2010)。以‘Sorbonne’为母本，
‘Francia’为父本进行东方百合抗灰霉病育种，共获
得 767个杂种后代试管苗。为采用分子标记方法鉴
定杂种的真实性，并开展东方百合灰霉病遗传规律
研究，需要为杂种群体大量杂种后代基因组 DNA的
提取选择适宜的方法。
自 Marmu建立用十二烷基磺酸钠(SDS)和氯仿
从细胞中分离提取 DNA样品的经典方法以来，研究
者一直探索制备高纯度、高完整性 DNA制品的最佳
方案(Steiner et al., 1995; 李维平等, 2002;应天玉等,
2003; 文传浩等, 2000, 云南大学学报(自然科学版),
22(5): 392-393)。百合由于多糖等次生代谢物质含量
较高，其 DNA提取和纯化难度较大，掌握最适的
DNA提取方法是进行百合分子生物学研究的基础。
本研究以东方百合‘Sorbonne’בFrancia’杂种
后代试管苗叶片为 DNA提取材料，采用 SDS-CTAB
法、简易 CTAB法、CTAB-高盐法、CTAB-硅珠法
等 4 种方法，提取杂种后代试管苗叶片的基因组
DNA，并对所提取 DNA的耗时、纯度、得率、浓度和
质量等指标进行对比，以筛选百合基因组 DNA提取
的适宜方法，为‘Sorbonne’בFrancia’杂种群体大量
杂种后代试管苗叶片基因组 DNA提取奠定基础。
1结果与分析
1.1 4种方法提取百合总 DNA的比较
采用 SDS-CTAB法、简易 CTAB法、CTAB-高
盐法、CTAB-硅珠法等4种方法提取百合杂种后代
试管苗叶片的基因组 DNA，除 CTAB-硅珠法无法得
到 DNA外，其余 3种方法均获得 DNA，SDS-CTAB
法耗时最多，平均耗时为 4.4 h，简易 CTAB 法耗时
最少，为 3.1 h。
紫外分光光度计进行 DNA纯度、浓度检测，结
果显示，不同方法提取的杂种后代试管苗叶片总
DNA在得率和质量上存在差异(表 1)。在总 DNA得
率上，简易 CTAB法最高，其次是 CTAB-高盐法，
SDS-CTAB 法得率最低。当 OD260/OD280 的数值在
1.8~2.0时，表示基本没有蛋白质、RNA的污染(吴丽
圆, 2004;胡凤荣等, 2011)。简易 CTAB 法、CTAB-
高盐法提取的 DNA在检查时，OD260/OD280均在 2.0
左右，纯度较高，SDS-CTAB法提取的 DNA纯度较
低，有一定 RNA、蛋白质或是其它有机物质污染。当
OD260/OD230的数值处于 2.0左右时，表明小分子、盐
离子和色素等杂质含量较少(桂腾琴等, 2008;张惠云
等, 2009;胡凤荣等, 2011)，由表 1可知，简易 CTAB
法杂质较少，纯度最高，CTAB-高盐法纯度最低，有
严重的盐离子等杂质的混入。
4种提取方法中，简易 CTAB法提取的DNA产量
最多，其浓度为 190.04 ng/μL，得率为 57.01μg/g；SDS-
CTAB法提取 DNA的量最少，其浓度为 76.7 ng/μL，
得率为 23.02 μg/g。
1.2 DNA质量的凝胶电泳检测
用 CTAB-高盐法、简易 CTAB法、SDS-CTAB
法及 CTAB-硅珠法等4种方法提取杂种后代试管
苗叶片 DNA，0.8%琼脂糖凝胶电泳进行完整性检测
(图 1)。结果显示，没有检测到 DNA 条带的只有
CTAB-硅珠法，其余3种方法获得的 DNA条带均
无明显的拖尾现象，完整性好。4种方法在去除蛋白
质、多糖、酚类化合物等次生代谢物的效果上存在差
异。A1、A3 的点样孔存在不同程度的光亮，表明
SDS-CTAB法所提取总 DNA样品中含有多糖、蛋白
质等次生代谢物，这些次生代谢物质会与 DNA形成
复合物，使部分 DNA电泳速度减慢或无法离开点样
孔(詹亚光和曾凡锁, 2005)。从电泳结果观察 DNA纯
度，简易 CTAB法和 CTAB-高盐法对于去除蛋白
质、多糖、酚类化合物等次生代谢物效果较好。综合
图 1 4种方法提取 DNA电泳结果
注: A: SDS-CTAB 法; B: 简易 CTAB 法; C: CTAB- 高盐法;
D: CTAB-硅珠法
Figure 1 Electrophoresis result of the extracted DNAs by four
methods
Note: A: SDS-CTAB; B: Simple and ease CTAB; C: CTAB-high
salt precipitation; D: CTAB-silica purification
东方百合杂种后代试管苗叶片总 DNA提取方法的选择
Method to Extract Genomic DNA from the Leaves of In-tube Seedling of the Hybrid Offspring of Oriental Lily 263
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
表 1 4种方法提取百合的 DNA纯度,得率,浓度及耗时
Table 1 Purity, yield, concentration, and time consuming for the lily DNA extraction by four methods
方法
Methods
SDS-CTAB
简易 CTAB
Simple and ease CTAB
CTAB-高盐
CTAB-high salt precipitation
CTAB-硅珠
CTAB-silica purification
OD260/OD280
1.66
1.89
1.90
-
OD260/OD230
2.07
2.01
1.64
-
浓度(ng/μL)
Concentration (ng/μL)
76.72
190.04
189.31
-
得率(μg/g)
Yield (μg/g)
23.02
57.01
56.79
-
耗时(h)
Time comsuming (h)
4.4
3.1
4.0
1.7
比较，简易 CTAB法要比 CTAB-高盐法步骤简单、
节省时间，因此效果更佳。
为检验简易 CTAB法的优越性，提取 16个杂种
后代试管苗叶片的 DNA进行琼脂糖凝胶电泳(图2)。
结果显示，16个样品 DNA均条带清晰，点样孔干
净，且无拖尾现象，说明 DNA完整性好、质量高，可
用于进一步研究。
2讨论
由于植物组织中许多次生代谢物质，如多糖、脂
类、酚类物质随个体的生长发育而不断成熟并增多，
选择幼嫩叶片可以减少色素、酚类等物质，从而提高
DNA的纯度，并且嫩叶也易于研磨，避免褐变。选取
东方百合杂种试管苗叶片作为提取材料，能够获得
高质量的基因组 DNA。而高效、高纯度的 DNA分离
方法是扩增检测成功的关键(邓明文, 2008; Gluiiano
et al., 2002;胡建平和吴琦, 2008)，且提取过程中蛋白
质、盐离子及酚类等物质会影响多种酶的活性，对后
续操作会造成较为严重的不利影响，因此需要对
DNA进行分离、纯化。采用 SDS-CTAB法提取东方
百合杂种试管苗叶片 DNA的操作步骤繁琐，由于氯
仿：异戊醇(24:1)抽提次数少，提取的 DNA存在较多
蛋白质、RNA及其它有机物质的污染；若用此法提
取 DNA，在纯化时则需要增加氯仿：异戊醇(24:1)抽
提的次数，以去除蛋白质、RNA及其它有机物质的
污染，提高 DNA质量。CTAB-高盐法提取的DNA
图 2简易 CTAB法提取部分样品 DNA电泳图
Figure 2 Electrophoresis of parts of DNA samples extracted by
simple and ease CTAB method
检测出严重的盐离子等杂质污染，可能是由于 NaCl
浓度过大或-20℃沉淀时间过长，导致盐离子等杂质
难以去除，因此为提高此法所提取 DNA的质量，应
缩短低温沉淀时间或增加 DNA的洗涤次数，消除盐
离子等杂质污染。简易 CTAB法提取的 DNA不存在
蛋白质、盐离子及酚类等物质的污染，但是存在很少
量 RNA污染，为获得高效、高纯度的 DNA，需对提
取产物采用 RNA酶进行消化，以解除 RNA的干扰。
此法纯化所需时间最少，适于大量样品的 DNA提
取。DNA纯度、得率及耗时是衡量 DNA提取优劣的
重要标志。本研究利用 4种方法提取杂种试管苗叶
片 DNA时，CTAB-硅珠法未获得DNA，可能是低
温状态下硅珠漂洗液处于过饱和状态，使提取难度
增大，同时与材料本身 DNA含量低且步骤较多、损
耗严重有关(胡凤荣等, 2011)。简易 CTAB法提取的
DNA 纯度较高，OD260/OD280 为 1.98，OD260/OD230 为
2.01，浓度为 190.01 ng/μL，得率为 57.01 μg/g，耗时
3 h左右，介于 CTAB-硅珠法和SDS-CTAB法之间。
由于简易 CTAB法提取的基因组 DNA杂质含量少、
纯度较高，且操作简单、方便，耗时较少，可作为东方百
合杂种群体大量杂种后代试管苗叶片总 DNA提取的
首选方法，为进一步开展百合的分子生物学研究奠定
物质基础。采用简易 CTAB 法提取了‘Sorbonne’×
‘Francia’杂种群体中 273个杂种后代试管苗叶片的
基因组 DNA，利用 ISSR分子标记方法进行了杂种真
实性鉴定，获得了 251个真实杂种，真实杂种率为
91.94%。选取部分真实杂种叶片离体接种百合灰霉
菌，进行灰霉病抗性检测，获得了良好的检测结果。
3材料与方法
3.1材料与试剂
以东方百合‘Sorbonne’בFrancia’的杂种后代
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东方百合杂种后代试管苗叶片总 DNA提取方法的选择
Method to Extract Genomic DNA from the Leaves of In-tube Seedling of the Hybrid Offspring of Oriental Lily
试管苗叶片为材料，用 70%酒精对叶片表面消毒，于
4月 14日采集分装于自封袋，液氮速冻后，存放于
-70℃冰箱备用。
试验所用试剂及药品有 CTAB (十六烷基三甲基
溴化铵)、EDTA-Na2 (乙二胺四乙酸二钠)、GusCN (硫
氰酸胍)、PVP (聚乙烯吡咯烷酮)、SDS (十二烷基磺
酸钠)、Tris (三羟基氨基甲烷)、Tris平衡酚、β-巯基乙
醇、琼脂糖、盐酸、乙酸钾、乙酸钠、冰乙酸、氯化钠、
氢氧化钠、异丙醇、异戊醇、无水乙醇、三氯甲烷、硅
珠粉、goldview、DNA Ladder、液氮等。试剂参照邓明
文(2008)的方法进行配制。
3.2总 DNA提取
总 DNA提取方法参考邓明文(2008)提取岷江
百合总 DNA的方法，并根据本研究的实际情况略
有改进。
3.3总 DNA质量与纯度检测
移液枪抽取 1 μL DNA样品，以 TE为空白液调
零，取 1 μL DNA样品用 Thermo公司生产的紫外分
光光度计检验，计算 OD260/OD280比值、OD260/OD230比
值、DNA得率，DNA得率=DNA浓度×总样品体积 /
样品鲜重。
取 5 μL总 DNA溶液在 0.8%琼脂糖凝胶上电
泳后，Gold view染色，用 BioRad凝胶成像系统拍照，
检测提取的DNA质量。
作者贡献
国荣荣是本实验研究的主要完成人；王斐和王
江勇完成数据分析；国荣荣和王斐完成论文初稿的
写作；第一作者兼通讯作者胡凤荣是项目的构思者
及负责人，指导实验设计、数据分析、论文写作，确定
修改及定稿。全体作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由江苏省高校优势学科建设工程项目资助。
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