全 文 ：第４１卷　第６期
２０１３年６月
西北农林科技大学学报（自然科学版）
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ　Ａ＆Ｆ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔ．Ｓｃｉ．Ｅｄ．）
Ｖｏｌ．４１ Ｎｏ．６
Ｊｕｎ．２０１３
网络出版时间：２０１３－０５－３１　１９：５９
网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／６１．１３９０．Ｓ．２０１３０５３１．１９５９．０１９．ｈｔｍｌ
葡萄风信子体细胞胚再生体系的建立及
抗生素敏感性试验
　［收稿日期］　２０１２－０９－２７
　［基金项目］　西安园林观赏花卉示范园建设子项目（ＮＣ１００３１（２））
　［作者简介］　杨凤美（１９８９－），女，湖北十堰人，在读硕士，主要从事花卉生理与生物技术研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｆｍ＿０６１＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
　［通信作者］　王　飞（１９５４－），女，河南孟津人，教授，博士生导师，主要从事果树及花卉生理与生物技术育种研究。
Ｅ－ｍａｉｌ：ｘｎｗａｎｇｆｅｉ５２１＠１２６．ｃｏｍ
杨凤美ａ，王　飞ｂ，张　雯ｂ，酒立君ａ，罗　静ａ，吴　楠ａ，吴　恒ａ
（西北农林科技大学ａ林学院，ｂ园艺学院，陕西 杨凌７１２１００）
［摘　要］　 【目的】建立葡萄风信子体细胞胚再生体系，通过外部形态判断愈伤组织的类型，并探索胚性愈伤组
织对头孢霉素和潮霉素的敏感性。【方法】以多年生葡萄风信子‘蓝穗’的盛花期叶片为试验材料，通过正交试验筛选
胚性愈伤组织诱导时适宜的植物生长调节剂质量浓度及配比；石蜡切片法观察不同愈伤组织内部的细胞结构，诱导
具有胚性的愈伤组织形成体细胞胚，进而获得再生植株；在培养基中加入头孢霉素或潮霉素，观察２种抗生素对胚性
愈伤组织生长和体细胞胚发生的影响。【结果】葡萄风信子胚性愈伤组织诱导的适宜培养基为 ＭＳ＋０．５ｍｇ／Ｌ　２，４－
Ｄ＋０．１ｍｇ／Ｌ　ＴＤＺ，在该培养基上诱导率高达１００％。石蜡切片观察发现，外观质地紧密、节状或块状的愈伤组织为
胚性愈伤组织。胚性愈伤组织在不含任何激素的 ＭＳ培养基上可诱导形成体细胞胚，在光照条件下体细胞胚伸长并
生根，最后形成成熟小鳞茎。头孢霉素质量浓度超过５００ｍｇ／Ｌ时，葡萄风信子胚性愈伤组织的生长和体细胞胚的发
生受到强烈抑制；引起胚性愈伤组织褐变的潮霉素临界质量浓度为９０ｍｇ／Ｌ。【结论】建立了葡萄风信子体细胞胚再
生体系，９０ｍｇ／Ｌ潮霉素可作为区分转化与非转化葡萄风信子胚性愈伤组织的有效选择压。
［关键词］　葡萄风信子；胚性愈伤组织；体细胞胚发生；抗生素敏感性
［中图分类号］　Ｓ６６３．１０３．６；Ｑ９４３．１ ［文献标志码］　Ａ ［文章编号］　１６７１－９３８７（２０１３）０６－０１０９－０８
Ｐｌａｎｔ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　ｓｏｍａｔｉｃ　ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｉｎ　Ｍｕｓｃａｒｉ　ａｒｍｅｎｉａｃｕｍ
Ｂｌｕｅ　Ｓｐｉｋｅ　ａｎｄ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｔｅｓｔ
ＹＡＮＧ　Ｆｅｎｇ－ｍｅｉ　ａ，ＷＡＮＧ　Ｆｅｉ　ｂ，ＺＨＡＮＧ　Ｗｅｎｂ，ＪＩＵ　Ｌｉ－ｊｕｎａ，
ＬＵＯ　Ｊｉｎｇａ，ＷＵ　Ｎａｎａ，ＷＵ　Ｈｅｎｇａ
（ａＣｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ，ｂ　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ　Ａ＆Ｆ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａｎｇｌｉｎｇ，Ｓｈａａｎｘｉ　７１２１００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ】Ｔｈｅ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｗａｓ　ｔｏ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈ　ｔｈｅ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｏｆ　Ｍｕｓｃａｒｉ　ａｒｍｅｎｉａｃｕｍ
ｆｒｏｍ　ｓｏｍａｔｉｃ　ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ，ｉｄｅｎｔｉｆｙ　ｔｈｅ　ｔｙｐｅｓ　ｏｆ　ｃａｌｕｓ　ｂｙ　ａｐｐｅａｒａｎｃｅｓ，ａｎｄ　ｓｔｕｄｙ　ｔｈｅ　ｓｅｎｓｉｂｉｌｉｔｉｅｓ　ｏｆ　ｅｍ－
ｂｒｙｏｇｅｎｉｃ　ｃａｌｕｓ　ｔｏ　ｃｅｆｏｔａｘｉｍｅ　ａｎｄ　ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ．【Ｍｅｔｈｏｄ】Ｌｅａｖｅｓ　ｏｆ　Ｍ．ａｒｍｅｎｉａｃｕｍ ‘Ｂｌｕｅ　ｓｐｉｋｅ’ｗｅｒｅ
ｕｓｅｄ　ａｓ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｍａｔｅｒｉａｌ，ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍａｌ　ｐｌａｎｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ　ｃａｌｕｓ　ｉｎ－
ｄｕｃｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｓｃｒｅｅｎｅｄ　ｗｉｔｈ　ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｄｅｓｉｇｎ　ｔｅｓｔ．Ｔｈｅ　ｉｎｎｅｒ　ｃｅｌｕｌａｒ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ　ｏｆ　ｖａｒｉｏｕｓ　ｃａｌｕｓｅｓ　ｗｅｒｅ　ｏｂ－
ｓｅｒｖｅｄ　ｂｙ　ｐａｒａｆｆｉｎ　ｍｅｔｈｏｄ．Ｓｏｍａｔｉｃ　ｅｍｂｒｙｏｓ　ｗｅｒｅ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｆｒｏｍ　ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ　ｃａｌｕｓ，ａｎｄ　ｐｌａｎｔｌｅｔｓ　ｄｅｒｉｖｅｄ
ｆｒｏｍ　ｓｏｍａｔｉｃ　ｅｍｂｒｙｏｓ　ｗｅｒｅ　ａｃｈｉｅｖｅｄ．Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ　ｃａｌｕｓ　ａｎｄ　ｓｏｍａｔｉｃ　ｅｍｂｒｙｏｓ　ｗｅｒｅ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｉｎ　ｍｅｄｉｕｍ
ｗｉｔｈ　ｃｅｆｏｔａｘｉｍｅ　ｏｒ　ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｃｅｆｏｔａｘｉｍｅ　ｏｒ　ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ　ｏｎ　ｔｈｅｍ　ｗａｓ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ．【Ｒｅｓｕｌｔ】
Ｔｈｅ　ｂｅｓｔ　ｍｅｄｉｕｍ　ｔｏ　ｉｎｄｕｃｅ　ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ　ｃａｌｕｓ　ｗａｓ　ＭＳ＋０．５ｍｇ／Ｌ　２，４－Ｄ＋０．１ｍｇ／Ｌ　ＴＤＺ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｉｎｄｕｃ－
DOI:10.13207/j.cnki.jnwafu.2013.06.023
ｔｉｏｎ　ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ　ｗａｓ　１００％．Ｉｔ　ｗａｓ　ｖｅｒｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ｐａｒａｆｆｉｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ｔｈａｔ　ｃａｌｕｓ　ｗｉｔｈ　ａ　ｃｌｏｓｅ　ｔｅｘｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｎｏｄｕｌａｒ
ａｐｐｅａｒａｎｃｅ　ｗａｓ　ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ　ｃａｌｕｓ．Ｓｏｍａｔｉｃ　ｅｍｂｒｙｏｓ　ｗｅｒｅ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｆｒｏｍ　ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ　ｃａｌｕｓ　ａｎｄ　ｃｏｎｖｅｒｔｅｄ
ｔｏ　ｐｌａｎｔｌｅｔｓ，ｒｏｏｔｅｄ　ａｎｄ　ｍａｔｕｒｅ　ｂｕｌｂｓ　ｆｏｒｍｅｄ　ｏｎ　ＰＧＲ－Ｆｒｅｅ　ＭＳ　ｍｅｄｉｕｍ．Ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ　ｃａｌｕｓ　ａｎｄ
ｓｏｍａｔｉｃ　ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｗｅｒｅ　ｓｔｒｏｎｇｌｙ　ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｍｏｒｅ　ｔｈａｎ　５００ｍｇ／Ｌ　ｃｅｆｏｔａｘｉｍｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｍｅｄｉｕｍ．Ｔｈｅ
ｃｒｉｔｉｃａｌ　ｍａｓｓ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｔｏ　ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ　ｗａｓ　９０ｍｇ／Ｌ．【Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ】Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｉｎ　Ｍ．ａｒｍｅｎｉａ－
ｃｕｍｆｒｏｍ　ｓｏｍａｔｉｃ　ｅｍｂｒｙｏｇｎｅｓｉｓ　ｗａｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ，ａｎｄ　ｇｅｎｅｔｉｃａｌｙ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ　ｃａｌｕｓ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ
ｓｃｒｅｅｎｅｄ　ｗｉｔｈ　９０ｍｇ／Ｌ　ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｍｕｓｃａｒｉ　ａｒｍｅｎｉａｃｕｍ；ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ　ｃａｌｕｓ；ｓｏｍａｔｉｃ　ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ；ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｔｏ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ
　　葡萄风信子（Ｍｕｓｃａｒｉ）为多年生草本球根花卉，
花期早，开放时间长，花形优美，具有较高的观赏价
值，是良好的林下地被花卉。目前，国外关于葡萄风
信子的报道主要集中在器官发生［１］、体细胞胚发
生［１－４］、基因转化［５－６］和抗生素敏感性［７］等方面。国
内有关的报道相对较少，何旭东［８］通过诱导获得了
葡萄风信子ｃｏｍｏｓｕｍ品种的体细胞胚；在组织培养
和转基因方面已有葡萄风信子Ｂｏｔｒｙｏｉｄｅｓ　Ｍｉｌ 品
种‘紫葡萄’（Ｃａｎｔａｔ）再生体系［９］及其基因转化受体
系统建立［１０］的研究报道，并已成功获得了葡萄风信
子Ｄｅｌｉｌａ基因转化植株［１１］。
葡萄风信子花色比较单一，无法满足人们对其
花色多样性的要求。通过转基因技术进行基因改良
可获得葡萄风信子新品种，而高效稳定且再生能力
强的植物受体系统是实现基因转化的前提。胚性愈
伤组织受体系统具有易接受外源ＤＮＡ、转化率高、
繁殖量大、遗传稳定性高等优点，是一种理想的遗传
转化受体系统。为此，本研究以葡萄风信子‘蓝穗’
（Ｍ．ａｒｍｅｎｉａｃｕｍ ‘Ｂｌｕｅ　Ｓｐｉｋｅ’）叶片为试验材料，采
用正交试验优化胚性愈伤组织诱导培养基，通过石
蜡切片确定胚性愈伤组织的特点，并对胚性愈伤组
织和体细胞胚进行抗生素敏感性试验，旨在为建立
葡萄风信子胚性愈伤组织受体系统提供依据，进而
为葡萄风信子基因转化研究奠定基础。
１　材料与方法
１．１　材　料
从西安植物园采集多年生盛花期葡萄风信子
‘蓝穗’的叶片，以叶片中部作为试验材料。
１．２　方　法
１．２．１　愈伤组织的诱导　以２，４－Ｄ（Ａ）、６－ＢＡ（Ｂ）
和ＴＤＺ（Ｃ）作为参选因素，每个因素设３个水平：Ａ
（０．２，０．５，１．０ｍｇ／Ｌ），Ｂ（０，０．１，０．５ｍｇ／Ｌ）和Ｃ（０，
０．１，０．５ｍｇ／Ｌ），共设计 Ｍ１～Ｍ９共９个不同的因
素水平组合，进行葡萄风信子胚性愈伤组织诱导条
件筛选的正交试验（表１）。同时，设计２个不含
２，４－Ｄ的对照处理，分别为：Ｍ１０．０．１ｍｇ／Ｌ　６－ＢＡ＋
０．１ｍｇ／Ｌ　ＴＤＺ；Ｍ１１．０．５ｍｇ／Ｌ　６－ＢＡ＋０．５ｍｇ／Ｌ
ＴＤＺ。
表１ 葡萄风信子胚性愈伤组织诱导条件筛选的正交试验方案
Ｔａｂｌｅ　１　Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｔｅｓｔ　ｐｌａｎ　ｏｆ　ｍｅｄｉｕｍ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｅｍｂｒｙｏ－
　ｇｅｎｉｃ　ｃａｌｕｓ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍ．ａｒｍｅｎｉａｃｕｍ‘Ｂｌｕｅ　Ｓｐｉｋｅ’ ｍｇ／Ｌ
水平
Ｌｅｖｅｌ
因素Ｆａｃｔｏｒ
Ａ
２，４－Ｄ
Ｂ
６－ＢＡ
Ｃ
ＴＤＺ
１　 ０．２　 ０　 ０
２　 ０．５　 ０．１　 ０．１
３　 １．０　 ０．５　 ０．５
　　无菌条件下，将葡萄风信子叶片切成长１．５～
２．０ｃｍ的小段，背面朝下接种在含不同质量浓度
２，４－Ｄ，６－ＢＡ和ＴＤＺ的 ＭＳ培养基上，每瓶接种３～
４块，每种培养基接种１０瓶。于（２５±１）℃下遮光
培养，３０ｄ后将长出的愈伤组织切成１ｃｍ３ 左右的
小块进行继代培养，每３０ｄ继代１次。
１．２．２　胚性愈伤组织的鉴定　以葡萄风信子叶片
为外植体诱导培养６０ｄ后，将获得的不同形态愈伤
组织在Ｏｌｙｍｐｕｓ体视显微镜下观察并拍照；然后用
ＦＡＡ固定液固定，石蜡切片法切片，纵切切片厚度
８～１０μｍ，番红固绿染色，加拿大树胶封片，在 Ｏ－
ｌｙｍｐｕｓ光学显微镜下观察并拍照。通过对比不同
形态愈伤组织的外部形态和内部细胞结构，获得根
据外观判断愈伤组织有无胚性的依据。然后根据此
依据，统计并计算胚性愈伤组织诱导率：
胚性愈伤组织诱导率＝诱导获得的胚性愈伤组
织数／接种的外植体数×１００％。
１．２．３　体细胞胚诱导和植株再生　将诱导培养６０
ｄ后获得的胚性愈伤组织，转接至体细胞胚诱导培
养基，即不含植物生长调节剂（ＰＧＲ－Ｆｒｅｅ）的 ＭＳ培
养基中，于（２５±１）℃遮光条件下诱导培养；３０ｄ后
产生体细胞胚，然后将其转移至光下，在光照强度为
３　０００ｌｘ、光照时间为８ｈ／１６ｈ（光／暗）条件下促使
０１１ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第４１卷
体细胞胚萌发、伸长、生根，最后可发育成为完整植
株。
１．２．４　抗生素筛选和敏感性试验　以 ＭＳ为基本
培养基，加入６种不同质量浓度（０，１００，２００，３００，
４００，５００和６００ｍｇ／Ｌ）的头孢霉素组成抑菌培养
基；或加入８种不同质量浓度（０，１５，３０，４５，６０，７５，
９０和１０５ｍｇ／Ｌ）的潮霉素组成筛选培养基。选取
诱导培养６０ｄ后获得的胚性愈伤组织为试验材料，
无菌条件下将胚性愈伤组织切成１ｃｍ３ 左右的小
块，接种于抑菌培养基和筛选培养基中，每个质量浓
度接种１０瓶，每瓶接种胚性愈伤组织５块，３０ｄ后
观察２种抗生素对胚性愈伤组织生长和体细胞胚发
生的影响，并分别统计能够增殖的胚性愈伤组织数、
褐变的胚性愈伤组织数和诱导出体细胞胚的胚性愈
伤组织数，以筛选胚性愈伤组织对头孢霉素和潮霉
素的耐受临界质量浓度，并计算增殖率、褐变率和体
细胞胚诱导率。
增殖率＝增殖的胚性愈伤组织数／接种的胚性
愈伤组织数×１００％；
褐变率＝褐变的胚性愈伤组织数／接种的胚性
愈伤组织数×１００％；
体细胞胚诱导率＝诱导出体细胞胚的胚性愈伤
组织数／接种的胚性愈伤组织数×１００％。
１．２．５　数据统计与分析　应用 Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ　Ｏｆｆｉｃｅ
Ｅｘｃｅｌ对增殖率、褐变率和体细胞胚诱导率进行统
计与分析，并应用ＳＰＳＳ　１２．０软件对胚性愈伤组织
诱导率进行Ｄｕｎｃａｎ’ｓ检验。
２　结果与分析
２．１　植物生长调节剂对胚性愈伤组织诱导的影响
葡萄风信子胚性愈伤组织诱导条件优化的正交
试验结果如表２所示。由表２的平均值Ｋ 可知，胚
性愈伤组织诱导中植物生长调节剂的最优组合为
Ａ２Ｂ３Ｃ２，即 ２，４－Ｄ 为 ０．５ ｍｇ／Ｌ，６－ＢＡ 为 ０．５
ｍｇ／Ｌ，ＴＤＺ为０．１ｍｇ／Ｌ。由组合间新复极差检验
和多重比较可知，在９个处理和２个对照中，以第４
个组合即Ａ２Ｂ１Ｃ２ 最理想，其胚性愈伤组织诱导率
最高 （１００％），高 于 单 因 素 分 析 得 到 的 结 果
（９４．３４％）。造成这种差异的原因可能是各因素间
存在互作，且这种互作是一种正效应。综上所述，
０．５ｍｇ／Ｌ　２，４－Ｄ＋０．１ｍｇ／Ｌ　ＴＤＺ为葡萄风信子胚
性愈伤组织诱导的最优培养基。
表２　葡萄风信子胚性愈伤组织诱导条件优化的正交试验结果
Ｔａｂｌｅ　２　Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｔｅｓｔ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｆｏｒ　ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ　ｃａｌｕｓ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍ．ａｒｍｅｎｉａｃｕｍ ‘Ｂｌｕｅ　Ｓｐｉｋｅ’
试验编号
Ｃｏｄｅ
因素水平Ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ｆａｃｔｏｒｓ
Ａ　 Ｂ　 Ｃ
胚性愈伤组织诱导率／％
Ａｖｅｒａｇｅ　ｃａｌｕｓ
ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｒａｔｅ
Ｄｕｎｃａｎ
α＝０．０５ α＝０．０１
Ｍ１　 １　 １　 １　 ７７．２７±９．００ ｃ ＡＢＣ
Ｍ２　 １　 ２　 ２　 ９５．０６±３．２７ ａｂ　 Ａ
Ｍ３　 １　 ３　 ３　 ９５．０６±３．２７ ａｂ　 Ａ
Ｍ４　 ２　 １　 ２　 １００．００±０．００ ａ Ａ
Ｍ５　 ２　 ２　 ３　 ９０．４９±４．６１ ａｂｃ　 Ａ
Ｍ６　 ２　 ３　 １　 ９２．５４±３．４４ ａｂｃ　 Ａ
Ｍ７　 ３　 １　 ３　 ５５．４１±１．２４ ｄ ＣＤ
Ｍ８　 ３　 ２　 １　 ３１．７１±７．５３ ｅ Ｅ
Ｍ９　 ３　 ３　 ２　 ７９．６３±６．６８ ｂｃ　 ＡＢ
Ｍ１０　 ０　 ２　 ２　 ５１．０６±１．７８ ｄ ＤＥ
Ｍ１１　 ０　 ３　 ３　 ６０．０７±７．９４ ｄ ＢＣＤ
Ｋ１ ８９．１３　 ７７．５６　 ６７．１７
Ｋ２ ９４．３４　 ７２．４２　 ９１．５６
Ｋ３ ５５．５８　 ８９．０８　 ８０．３２
极差 Ｒａｎｇｅ　 ３８．７６　 １６．６６　 ２４．３９
　　注：Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３分别表示水平１，２，３的平均值。ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ表示显著水平（Ｐ＜０．０５）；Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ表示极显著水平（Ｐ＜０．０１）；表３同。
Ｎｏｔｅ：Ｋ１，Ｋ２，Ｋ３ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ　ｔｈｅ　ａｖｅｒａｇｅ　ｏｆ　ｌｅｖｅｌ　１，２，３，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｅ　ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ａｔ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　５％（Ｐ＜０．０５）；Ａ，
Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ　ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ａｔ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　１％ （Ｐ＜０．０１）；ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｆｏｒ　Ｔａｂｌｅ　３．
　　比较处理 Ｍ２和对照 Ｍ１０以及处理 Ｍ３和对
照 Ｍ１１（表２）可知，用不含２，４－Ｄ的培养基依然能
够诱导出胚性愈伤组织，但诱导率远低于含有２，４－
Ｄ的处理。说明２，４－Ｄ不是诱导葡萄风信子胚性愈
伤组织必需的植物生长调节剂，但却有助于提高诱
导率。
对葡萄风信子胚性愈伤组织诱导条件优化试验
结果的单因素新复极差检验和多重比较分析如表３
所示，对比Ａ、Ｂ和Ｃ的Ｆ值可知，３种植物生长调
节剂对胚性愈伤组织诱导率的影响由大到小为Ａ＞
１１１第６期 杨凤美，等：葡萄风信子体细胞胚再生体系的建立及抗生素敏感性试验
Ｃ＞Ｂ，即２，４－Ｄ＞ＴＤＺ＞６－ＢＡ，且三者之间的差异 达到了极显著水平。
表３　葡萄风信子胚性愈伤组织诱导条件优化试验的单因素新复极差测验和多重比较
Ｔａｂｌｅ　３　Ｔｈｅ　ｎｅｗ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｒａｎｇｅ　ｔｅｓｔ　ｏｆ　ｓｉｎｇｌｅ　ｆａｃｔｏｒ　ａｎｄ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ
因素
Ｆａｃｔｏｒ
Ｆ值
Ｆ－ｖａｌｕｅ
水平
Ｌｅｖｅｌ
胚性愈伤组织平均诱导率／％
Ａｖｅｒａｇｅ　ｃａｌｕｓ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｒａｔｅ
Ｄｕｎｃａｎ
α＝０．０５ α＝０．０１
１　 ８９．００ ａ Ａ
Ａ　 ４８．７４４＊＊ ２　 ９４．３３ ａ Ａ
３　 ５５．５６ ｂ Ｂ
１　 ７７．４４ ｂ ＡＢ
Ｂ　 ８．１６０＊＊ ２　 ７２．３３ ｂ Ｂ
３　 ８９．１１ ａ Ａ
１　 ６７．１１ ｃ Ｂ
Ｃ　 １６．５１１＊＊ ２　 ９１．５６ ａ Ａ
３　 ８０．２２ ｂ Ａ
　　注：＊＊表示极显著水平（Ｐ＜０．０１）。
Ｎｏｔｅ：＊＊ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ａｔ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　１％ （Ｐ＜０．０１）．
２．２　葡萄风信子胚性愈伤组织的鉴定
将葡萄风信子叶片诱导培养６０ｄ后，共观察到
６种不同形态的愈伤组织（图１Ａ－Ｆ），分别记为
Ⅰ－Ⅵ型。
图１　葡萄风信子６种不同形态愈伤组织及体细胞胚发生的观察（１０×）
Ａ．Ⅰ型愈伤组织；Ｂ．Ⅱ型愈伤组织；Ｃ．Ⅲ型愈伤组织；Ｄ．Ⅳ型愈伤组织；Ｅ．Ⅴ型愈伤组织；Ｆ．Ⅵ型愈伤组织
Ｆｉｇ．１Ｓｉｘ　ｃａｌｕｓ　ｔｙｐｅｓ　ｏｆ　Ｍ．ａｒｍｅｎｉａｃｕｍａｎｄ　ｓｏｍａｔｉｃ　ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ
Ａ．Ｃａｌｕｓ　ｏｆ　ｔｙｐｅⅠ；Ｂ．Ｃａｌｕｓ　ｏｆ　ｔｙｐｅⅡ；Ｃ．Ｃａｌｕｓ　ｏｆ　ｔｙｐｅⅢ；Ｄ．Ｃａｌｕｓ　ｏｆ　ｔｙｐｅⅣ；Ｅ．Ｃａｌｕｓ　ｏｆ　ｔｙｐｅⅤ；Ｆ．Ｃａｌｕｓ　ｏｆ　ｔｙｐｅⅥ
　　Ⅰ型愈伤组织（图１Ａ）呈淡黄色紧实小节状，
表面凹凸，发生量大，愈伤组织上着生体细胞胚；大
多数愈伤组织细胞小且排列紧密，细胞壁厚，胞质浓
厚，细胞核大且位于细胞中央，为胚性细胞；转入
ＰＧＲ－Ｆｒｅｅ　ＭＳ培养基中后能产生大量体细胞胚。
Ⅱ型愈伤组织（图１Ｂ）呈淡黄色紧实大节状，
表面光滑，发生量较大，愈伤组织上未着生体细胞
胚；部分愈伤组织细胞为胚性细胞；转入ＰＧＲ－Ｆｒｅｅ
ＭＳ培养基中后能逐渐产生大量体细胞胚。
Ⅲ型愈伤组织（图１Ｃ）呈黄色紧实小节状，表
面凹凸且有少量绒毛，发生量少，愈伤组织上着生极
少量体细胞胚；部分愈伤组织细胞为胚性细胞，且在
愈伤组织内部开始形成体细胞胚；转入ＰＧＲ－Ｆｒｅｅ
ＭＳ培养基中后能产生大量体细胞胚。
Ⅳ型愈伤组织（图１Ｄ）呈黄色或褐色较紧实块
状，表面布满白色绒毛，发生量少，愈伤组织上着生
少量体细胞胚；部分愈伤组织细胞为胚性细胞；转入
ＰＧＲ－Ｆｒｅｅ　ＭＳ培养基中后能产生部分体细胞胚。
Ⅴ型愈伤组织（图１Ｅ）呈黄色紧实块状，发生
量极少，愈伤组织上着生极少量透明的体细胞胚；多
２１１ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第４１卷
数愈伤组织细胞为胚性细胞；转入ＰＧＲ－Ｆｒｅｅ　ＭＳ培
养基中后能产生部分体细胞胚。
Ⅵ型愈伤组织（图１Ｆ）呈黄色松散状，发生量
较大，愈伤组织上无体细胞胚着生；全部愈伤组织细
胞大，形状不规则，细胞核小且偏向细胞一侧，为非
胚性细胞；转入ＰＧＲ－Ｆｒｅｅ　ＭＳ培养基中后不能产生
体细胞胚，但能产生白色具绒毛的根。
由图２Ａ－Ｅ可知，Ⅰ－Ⅴ型愈伤组织内部均
含有胚性细胞，这些胚性细胞在愈伤组织的外层或
内部增殖形成胚性细胞团，胚性细胞团分化形成球
形胚（图２Ｇ－Ｈ），球形胚发育成为偏梨形胚（图２
Ｉ）和棒状胚（图２Ｊ）。将这些愈伤组织转接至ＰＧＲ－
Ｆｒｅｅ　ＭＳ培养基中均能诱导形成体细胞胚。Ⅵ型愈
伤组织（图２Ｆ）内部不含有胚性细胞，因而不能形
成体细胞胚。由此可知，６种愈伤组织中，除Ⅵ型
外，其他５种愈伤组织均具有胚性。
图２　葡萄风信子６种不同愈伤组织及体细胞胚发生过程的组织细胞学观察
Ａ．Ⅰ型愈伤组织（４００×）；Ｂ．Ⅱ型愈伤组织（４００×）；Ｃ．Ⅲ型愈伤组织（４００×）；Ｄ．Ⅳ型愈伤组织（４００×）；
Ｅ．Ⅴ型愈伤组织（４００×）；Ｆ．Ⅵ型愈伤组织（４００×）；Ｇ．起源于愈伤组织外部的球形胚（１００×）；
Ｈ．起源于愈伤组织内部的球形胚（１００×）；Ｉ．偏梨形胚（２００×）；Ｊ．棒状胚（１００×）
Ｆｉｇ．２　 Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ　ｏｆ　ｓｉｘ　ｔｙｐｅｓ　ｏｆ　ｃａｌｕｓ　ａｎｄ　ｓｏｍａｔｉｃ　ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｉｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｓｔａｇｅｓ
Ａ．Ｃａｌｕｓ　ｏｆ　ｔｙｐｅⅠ（４００×）；Ｂ．Ｃａｌｕｓ　ｏｆ　ｔｙｐｅⅡ（４００×）；Ｃ．Ｃａｌｕｓ　ｏｆ　ｔｙｐｅⅢ（４００×）；Ｄ．Ｃａｌｕｓ　ｏｆ　ｔｙｐｅⅣ（４００×）；Ｅ．Ｃａｌｕｓ　ｏｆ　ｔｙｐｅⅤ（４００×）；
Ｆ．Ｃａｌｕｓ　ｏｆ　ｔｙｐｅⅥ（４００×）；Ｇ．Ｇｌｏｂｕｌａｒ　ｅｍｂｒｙｏ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｓｕｒｆａｃｅ　ｏｆ　ｃａｌｕｓ（１００×）；Ｈ．Ｇｌｏｂｕｌａｒ　ｅｍｂｒｙｏ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｏｆ　ｃａｌｕｓ（１００×）；
Ｉ．Ｐａｒｔｉａｌ　ｐｅａｒ－ｓｈａｐｅｄ　ｅｍｂｒｙｏ（２００×）；Ｊ．Ｓｔｉｃｋ　ｅｍｂｒｙｏ（１００×）
２．３　葡萄风信子体细胞胚的诱导、萌发及植株再生
　　将诱导培养６０ｄ形成的葡萄风信子胚性愈伤
组织转接至ＰＧＲ－Ｆｒｅｅ　ＭＳ培养基上，于遮光条件下
诱导，３０ｄ后可以获得体细胞胚（图３Ａ）；葡萄风信
子体细胞胚经历球形胚（图２Ｇ－Ｈ）、偏梨形胚（图
２Ｉ）和棒状胚（图２Ｊ）３个阶段后转至光下，１０ｄ后
可萌发伸长成为无根幼苗（图３Ｂ）；将这些幼苗与
愈伤组织分离后培养于ＰＧＲ－Ｆｒｅｅ　ＭＳ培养基中，３０
ｄ后幼苗逐渐生长出根，８０ｄ后形成小鳞茎（图３
Ｃ），１２０ｄ后长成完整植株（图３Ｄ）。
图３　葡萄风信子体细胞胚的再生过程
Ａ．胚性愈伤组织上着生大量体细胞胚（１５×）；Ｂ．体细胞胚发育成苗；Ｃ．通过体细胞胚发生形成的具有成熟
小鳞茎的植株（８×）；Ｄ．成簇由体细胞胚发育得到的植株
Ｆｉｇ．３Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍ．ａｒｍｅｎｉａｃｕｍｆｒｏｍ　ｓｏｍａｔｉｃ　ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ
Ａ．Ｓｏｍａｔｉｃ　ｅｍｂｒｙｏｓ　ｏｎ　ｃａｌｕｓ（１５×）；Ｂ．Ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ　ｆｒｏｍ　ｓｏｍａｔｉｃ　ｅｍｂｒｙｏｓ；
Ｃ．Ｐｌａｎｔｌｅｔｓ　ｗｉｔｈ　ｍａｔｕｒｅ　ｂｕｌｂｓ　ｆｒｏｍ　ｓｏｍａｔｉｃ　ｅｍｂｒｙｏｓ（８×）；Ｄ．Ｐｌａｎｔｓ　ｆｒｏｍ　ｓｏｍａｔｉｃ　ｅｍｂｒｙｏｓ　ｉｎ　ｃｌｕｓｔｅｒ
３１１第６期 杨凤美，等：葡萄风信子体细胞胚再生体系的建立及抗生素敏感性试验
２．４　葡萄风信子胚性愈伤组织对抗生素的敏感性
　　从表４可知，在头孢霉素质量浓度为０～６００
ｍｇ／Ｌ时，随着其质量浓度的增加，葡萄风信子胚性
愈伤组织增殖率逐渐下降，体细胞胚诱导率也随之
呈缓慢下降趋势，至６００ｍｇ／Ｌ时，胚性愈伤组织增
殖率和体胚诱导率均降低为０。综上可知，头孢霉
素对葡萄风信子胚性愈伤组织生长具有一定的抑制
作用，当其质量浓度超过５００ｍｇ／Ｌ时，葡萄风信子
胚性愈伤组织生长和体细胞胚发生均受到强烈抑
制。
表４　不同质量浓度头孢霉素对葡萄风信子胚性愈伤组织增殖及体细胞胚发生的影响
Ｔａｂｌｅ　４Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｃｅｆｏｔａｘｉｍｅ　ｏｎ　ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ　ｃａｌｕｓ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｓｏｍａｔｉｃ　ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｍ．ａｒｍｅｎｉａｃｕｍ
头孢霉素质量
浓度／（ｍｇ·Ｌ－１）
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
接种的胚性
愈伤组织数
Ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ　ＥＣ
胚性愈伤组织增殖
Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＥＣ
增殖数
Ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ
ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ　ＥＣ
增殖率／％
Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ
ｒａｔｅ
体细胞胚诱导
Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＳＭ　ｆｒｏｍ　ＥＣ
诱导数
Ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ　ＥＣ
ｉｎｄｕｃｅｄ　ＳＭ
诱导率％
ＳＭ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ
ｒａｔｅ
０　 ５０　 ５０　 １００　 ５０　 １００
１００　 ５０　 ５０　 １００　 ４１　 ８２
２００　 ５０　 ４２　 ８４　 ３８　 ７６
３００　 ５０　 ４０　 ８０　 ３４　 ６８
４００　 ５０　 ３７　 ７４　 ２３　 ４６
５００　 ５０　 ２８　 ５６　 １７　 ３４
６００　 ５０　 ０　 ０　 ０　 ０
　　注：ＥＣ和ＳＭ分别表示胚性愈伤组织和体细胞胚发生；表５同。
Ｎｏｔｅ：ＥＣ　ａｎｄ　ＳＭ　ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ　ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ　ｃａｌｕｓ　ａｎｄ　ｓｏｍａｔｉｃ　ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｆｏｒ　Ｔａｂｌｅ　５．
　　从表５可知，随着潮霉素质量浓度的增加，葡萄
风信子胚性愈伤组织褐变率逐渐增加，体细胞胚诱
导率随之下降。３０ｄ后，在潮霉素质量浓度为４５
ｍｇ／Ｌ的 ＭＳ培养基中，愈伤组织褐变率为５４％，体
细胞胚诱导率为０；在潮霉素质量浓度为９０和１０５
ｍｇ／Ｌ的 ＭＳ培养基中，胚性愈伤组织褐变率为
１００％。由此可知，９０ｍｇ／Ｌ潮霉素可作为区分转化
与非转化葡萄风信子胚性愈伤的有效选择压。
表５　不同质量浓度潮霉素对葡萄风信子胚性愈伤组织生长及体细胞胚发生的影响
Ｔａｂｌｅ　５　 Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ　ｏｎ　ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ　ｃａｌｕｓ　ｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄ　ｓｏｍａｔｉｃ　ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｍ．ａｒｍｅｎｉａｃｕｍ
潮霉素质量
浓度／（ｍｇ·Ｌ－１）
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
接种的胚性
愈伤组织数
Ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ　ＥＣ
胚性愈伤组织褐变
Ｂｒｏｗｎｉｎｇ　ｏｆ　ＥＣ
褐变数
Ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ　ｂｒｏｗｎｉｎｇ
ＥＣ
褐变率／％
Ｂｒｏｗｎｉｎｇ
ｒａｔｅ
体细胞胚诱导
Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＳＭ　ｆｒｏｍ　ＥＣ
诱导数
Ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ　ＥＣ
ｉｎｄｕｃｅｄ　ＳＭ
诱导率／％
ＳＭ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ
ｒａｔｅ
０　 ５０　 ０　 ０　 ５０　 １００
１５　 ５０　 ０　 ０　 ３４　 ６８
３０　 ５０　 １１　 ２２　 １３　 ２６
４５　 ５０　 ２７　 ５４　 ０　 ０
６０　 ５０　 ３５　 ７０　 ０　 ０
７５　 ５０　 ４３　 ８６　 ０　 ０
９０　 ５０　 ５０　 １００　 ０　 ０
１０５　 ５０　 ５０　 １００　 ０　 ０
　　不同质量浓度头孢霉素和潮霉素对葡萄风信子
胚性愈伤组织生长和体细胞胚发生的抑制作用观察
结果如图４所示。图４表明，未加抗生素的胚性愈
伤组织（图４Ａ）培养３０ｄ后均能够产生体细胞胚
（图４Ｂ），而随着培养基中头孢霉素质量浓度的增
加，能够诱导出体细胞胚的愈伤组织逐渐减少（图４
Ｃ－Ｇ），当其质量浓度为６００ｍｇ／Ｌ时，培养３０ｄ后
胚性愈伤组织出现褐变现象，所有胚性愈伤组织均
不能产生体细胞胚（图４Ｈ）。同样，随着潮霉素质
量浓度的增加，能够产生体细胞胚的胚性愈伤组织
逐渐减少（图４Ｉ－Ｊ），当其质量浓度达到或超过４５
ｍｇ／Ｌ时，所有胚性愈伤组织均不能产生体细胞胚
（图４Ｋ－Ｏ）；此外，随着潮霉素质量浓度的增加，胚
性愈伤组织的褐变现象逐渐变得严重（图４Ｋ－
Ｍ），当其质量浓度达到或超过９０ｍｇ／Ｌ时，培养３０
ｄ后的胚性愈伤组织全部褐变死亡（图４Ｎ－Ｏ）。
４１１ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第４１卷
图４　葡萄风信子胚性愈伤组织对抗生素的敏感性试验
Ａ．０ｄ未加抗生素的胚性愈伤组织；Ｂ．３０ｄ后未加抗生素的胚性愈伤组织和体细胞胚；Ｃ－Ｈ．３０ｄ后１００，２００，
３００，４００，５００，６００ｍｇ／Ｌ头孢霉素中的胚性愈伤组织和体细胞胚；Ｉ－Ｏ．３０ｄ后
１５，３０，４５，６０，７５，９０，１０５ｍｇ／Ｌ潮霉素中的胚性愈伤组织和体细胞胚
Ｆｉｇ．４Ｔｈｅ　ｓｅｎｓｉｂｉｌｉｔｙ　ｔｅｓｔ　ｏｆ　ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ　ｃａｌｕｓ　ｏｆ　Ｍ．ａｒｍｅｎｉａｃｕｍｔｏ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ
Ａ．Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ　ｃａｌｕｓ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　１ｓｔ　ｄａｙ；Ｂ．Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ　ｃａｌｕｓ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　３０ｔｈ　ｄａｙ；
Ｃ－Ｈ．Ｃｅｆｏｔａｘｉｍｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　１００，２００，３００，４００，５００ａｎｄ　６００ｍｇ／Ｌ；
Ｉ－Ｏ．Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　１５，３０，４５，６０，７５，９０ａｎｄ　１０５ｍｇ／Ｌ
３　讨　论
许多研究表明，添加适当比例的生长素和细胞
分裂素能促进体细胞胚的形成和发育，其中２，４－Ｄ
是诱导体细胞胚发生的重要生长素［１２］，特别是单子
叶植物［１３］。由本试验可知，葡萄风信子‘蓝穗’是一
个特例，在无２，４－Ｄ时依然能够诱导出胚性愈伤组
织。本试验使用的细胞分裂素有６－ＢＡ 和 ＴＤＺ，
ＴＤＺ对大多数植物的体细胞胚发生有促进作用，如
烟草、花生、天竺葵等，而且ＴＤＺ对体细胞胚的诱导
率常高于其他植物生长调节物质［１４］。本试验表明，
ＴＤＺ与２，４－Ｄ配合使用，可使葡萄风信子‘蓝穗’胚
性愈伤组织的诱导率高达１００％。
对体细胞胚发生的细胞生物学研究，主要通过
石蜡切片技术观察体细胞胚的发育过程来实现［１５］。
本研究发现，非胚性愈伤组织和胚性愈伤组织差异
较大，胚性愈伤组织质地紧密或较紧密，而非胚性的
Ⅵ型愈伤组织质地较疏松，从而推断质地紧密或疏
松可以作为判断愈伤组织有无胚性的标准。
许胜等［１０］以 Ｍ．ｂｏｔｒｙｏｉｄｅｓ　Ｍｉｌ 叶片为外植
体，建立了稳定的葡萄风信子基因转化受体系统；筛
选卡那霉素的临界质量浓度为６０ｍｇ／Ｌ，羧苄青霉
素的适宜质量浓度为３００ｍｇ／Ｌ。但Ｓｕｚｕｋｉ等［７］发
现，Ｍ．ａｒｍｅｎｉａｃｕｍ胚性愈伤组织和体细胞胚对卡
那霉素不敏感，羧苄青霉素对胚性愈伤组织和体细
胞胚的生长均有促进作用，２００～５００ｍｇ／Ｌ头孢霉
素对葡萄风信子胚性愈伤组织增殖和体细胞胚发生
均有一定促进作用。本试验发现，２００～５００ｍｇ／Ｌ
头孢霉素对葡萄风信子‘蓝穗’的胚性愈伤组织增殖
和体细胞胚发生具有轻微的抑制作用；当头孢霉素
质量浓度达到６００ｍｇ／Ｌ时，抑制作用十分强烈，愈
伤组织不再增殖，且在培养３０ｄ后出现褐变现象。
本研究中，葡萄风信子胚性愈伤组织对潮霉素的临
界耐受质量浓度为９０ｍｇ／Ｌ，高于Ｓｕｚｕｋｉ等［７］报道
的７５ｍｇ／Ｌ。推测其原因，可能是所用植物材料品
种不同所致，Ｓｕｚｕｋｉ等［７］以Ｍ．ａｒｍｅｎｉｃａｃｕｍＬｅｉｃｈ－
ｔｌ．ｅｘ　Ｂａｋ．为试验材料，而本试验使用的是 Ｍ．ａｒ－
ｍｅｎｉｃａｃｕｍ ‘Ｂｌｕｅ　Ｓｐｉｋｅ’。此外，还有可能是由于愈
伤组织的形态和质地存在差异所致，Ｓｕｚｕｋｉ等［７］认
为白色易脆的愈伤为胚性愈伤组织，而本试验发现，
质地紧密的愈伤组织为胚性愈伤组织。
４　结　论
１）诱导葡萄风信子‘蓝穗’胚性愈伤组织的适宜
培养基为 ＭＳ＋０．５ｍｇ／Ｌ　２，４－Ｄ＋０．１ｍｇ／Ｌ　ＴＤＺ，
在该培养基上诱导率高达１００％。
５１１第６期 杨凤美，等：葡萄风信子体细胞胚再生体系的建立及抗生素敏感性试验
２）外观质地紧密、节状或块状的愈伤组织为胚
性愈伤组织。
３）胚性愈伤组织在不含任何激素的 ＭＳ培养基
上培养３０ｄ后可以形成体细胞胚，光照条件下体细
胞胚伸长并生根，最后形成成熟的小鳞茎。
４）在葡萄风信子‘蓝穗’胚性愈伤组织的遗传转
化中，以头孢霉素为抑菌剂时，其质量浓度最高为
５００ｍｇ／Ｌ。‘蓝穗’胚性愈伤组织对潮霉素的临界
耐受质量浓度为９０ｍｇ／Ｌ。
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Ｃｈｅｎ　Ｙ　Ｆ，Ｚｈａｎｇ　Ｃ　Ｒ，Ｈｕａｎｇ　Ｘ，ｅｔ　ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ＴＤＺ　ｏｎ　ｓｏ－
ｍａｔｉｃ　ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｏｆ　ｐｌａｎｔ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　Ｃｏｍｍｕｎｉ－
ｃａｔｉｏｎｓ，２００６，４２（１）：１２７－１３３．（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ）
［１５］　陈金慧，施季森，诸葛强，等．植物体细胞胚胎发生机理的研究
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Ｃｈｅｎ　Ｊ　Ｈ，Ｓｈｉ　Ｊ　Ｓ，Ｚｈｕｇｅ　Ｑ，ｅｔ　ａｌ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ
ｏｆ　ｓｏｍａｔｉｃ　ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｏｆ　ｐｌａｎｔｓ　ａｎｄ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｔｒｅｎｄｓ［Ｊ］．
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｎａｎｊｉｎｇ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｅｄｉ－
ｔｉｏｎ，２００３，２７（１）：７５－８０．（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ）
６１１ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第４１卷