全 文 ：ISSN 1000-0054
CN 11-2223 /N
　 清华大学学报 (自然科学版 )
J Tsingh ua Univ ( Sci & Tech ) ,
2004年 第 44卷 第 12期
2004, Vo l. 44, No. 12
3 /31
1592-1595　
用扣除杂交法分离藏红花苷合成相关基因的克隆
佘卫炜 , 　郭志刚 , 　刘瑞芝
(清华大学 化学工程系 ,北京 100084)
收稿日期: 2004-01-12
作者简介: 佘卫炜 ( 1978-) ,女 (土家 ) , 湖南 , 硕士研究生。
通讯联系人: 郭志刚 ,副教授 ,
E-mai l: g uozhig@ mail. tsinghua. ed u. cn
摘　要: 对藏红花苷合成的相关基因进行了初步分离与克
隆实验研究 ,旨在分离与藏红花苷合成相关的特异性表达的
cDN A克隆 ,为进一步从分子水平上研究藏红花素的合成机
理奠定基础。 实验采用经添加诱导子和合成前体、处于藏红
花苷合成状态下的藏红花细胞和未添加诱导子和合成前体、
处于生长状态的对照藏红花细胞为材料 ,采用扣除杂交法成
功地分离到 6条与藏红花苷合成相关的特异性表达的 cDN A
克隆。结果表明: 其中一条与胡杨中由高盐环境引起的差异
表达的一条 mRNA的序列有较高的同源性。
关键词: 植物基因工程 ; cDNA克隆 ; 扣除杂交 ; 藏红花苷
合成
中图分类号: Q 943. 2 文献标识码: A
文章编号: 1000-0054( 2004) 12-1592-04
Separation of gene clones related to
crocin synthesis using subtractive
hybridization
SHEWeiwei , GUO Zhigang , LIURuizhi
( Department of Chemical Eng ineering, Tsinghua University,
Beijing 100084, China)
Abs tract: Th e crocin s ynthesi s mechanism w as inv es tigated at th e
molecular level by s tud ying the genes related to crocin syn th es es.
Genes con trolling th e translation of some k ey enzymes related to
crocin syn thesis are ex pres sed selectiv ely du ring the syn thesis of
crocin. Saf f ron (crocus sativus L. ) cel ls begin to syn thesi ze crocin
wh en combined wi th elici to rs and caro tenoid precu rs ors. Subt ract ive
hybridi zation w as used to compare th e gene expression of naturally
growing s af f ron cel ls during crocin s ynthesis. Six cDN A clon es
di f feren tially ex press ed d uring crocin s ynthesis w ere i solated.
Sequence analysi s and databas e s earch es reveal that one of th e six
cDNA clones show s h igh h omology to the populus eu ph ratica mRN A
di f feren tially expressed d uring salt st res s.
Key words: plant gene engineeing; cDN A clone; subt ract ive
h ybridi zat ion; crocin s ynth esi s
藏红花的雌蕊柱头中含有的藏红花苷类化合物
具有较强的抗癌活性 ,有可能被开发成新一代抗癌
药物。由于藏红花产量极低 ,并难于实现大面积栽
培 ,因此筛选到能快速生长且能合成藏红花素类物
质的高产细胞株系 ,并利用植物细胞培养技术生产
藏红花的有效活性成分 ,是解决藏红花供不应求的
有效方法之一。 本实验室研究出了固液两步培养法
生产藏红花苷的模式 [1 ]。在藏红花苷合成阶段 ,通过
添加诱导子激活藏红花苷类化合物合成相关基因的
表达 ,同时添加合成藏红花苷的前体物质 ,利用细胞
的生物转化功能合成藏红花苷 ,显著提高了细胞内
藏红花苷的含量 [2 ]。
高等植物一般具有 105个功能性基因。在某一
时间内 ,单细胞或植物体中仅有约 15%的基因得到
表达 ,也就是说将产生约 15 000种 mRNA。正是由
于植物基因的选择性表达 ,使得植物的各种生命活
动得以实现 [3 ]。在藏红花苷的合成反应过程中 ,一些
起关键作用的酶发生了变化 [4, 5 ] ,这是由于控制这些
酶合成的基因的表达发生了变化。 本实验即是通过
对正常生长的细胞添加诱导子 ,促使其合成藏红花
苷 ,然后利用正常生长细胞和合成藏红花苷细胞的
基因表达差异 ,分离合成藏红花苷的相关基因。
扣除杂交法的本质在于去除那些普遍共同存在
的或是非诱导产生的正常表达的 m RNA序列 ,从而
使欲分离的目的基因 mRNA序列得到有效的富集 ,
并同时提高了分离的敏感性 [6 ]。 该方法的假阳性表
达率低 ,且研究对象是两个对应的细胞群 [7 ]。扣除杂
交法的这些特点符合本实验的要求。
本文采用了扣除杂交方法来实现藏红花苷合成
相关基因的分离。
DOI : 10. 16511 /j . cnki . qhdxxb. 2004. 12. 003
1　材料与方法
1. 1　细胞培养
将藏红花细胞继代培养 (固体培养 ) 20 d后 ,转
入藏红花苷合成培养基 (液体悬浮培养 ) ,在 200mL
三角瓶中加入 50mL合成培养液 ,然后接种 10g (鲜
重 )细胞 ,在 25℃、 避光和 120 r /min的摇床上培养 ,
然后在第 8 d收获细胞 ,经真空冷冻干燥后 ,低温保
存备用。
1. 2　总 RNA的提取和残存 DNA的去除
抽提处理细胞和对照细胞的总 RNA分别作为
检测样本和参照样本。总 RNA提取采用一步法 [ 8]
( T rizo l试剂 , GIBCO /BRL公司生产 )。实验中所用
仪器均经过 DEPC水、焙烤处理以除去 RNase。取约
50μg的总 RNA于 0. 5m L的离心管中 ,加入 10μL
质量浓度为 40μg /m L的 DNase A( Promega公司生
产 )于 35μL反应体系中 37℃温育 30min, 经酚、氯
仿抽提后 ,用乙醇沉淀总 RNA。测定 RNA 260、
280 nm波长的吸光度 ,并经甲醛变性电泳检测其完
整性。
1. 3　扣除杂交
将处理细胞的 mRNA反转录成 cDN A。 mRNA
的 反 转 录 采 用 Reverse Transcription Sy stem
( Promega公司生产 )。 以鉴定完好的处理细胞的总
RNA 1μg为模板 ,在 AMV反转录酶的作用下合成
cDN A第一链。处理细胞总 RNA在反转录之前在 70
℃下保温 10min之后简短离心 ,置于冰上。反应体系
为 20μL, 在 42℃下温育 1 h, 然后在 95℃持续 5min
终止反应。
对照细胞 mRNA与处理细胞 cDN A的杂交。加
入 50μg对照细胞总 RNA于上述合成的 cDN A中 ,
用 6μL水溶解后 ,再加入 5×杂交缓冲液 2μL和 1%
SDS 2μL。煮沸 5min后 ,在 70℃下温育 20 h左右。
用羟基磷灰石分离单链 cDN A[ 9]。平衡装柱液
为 10 mmol /L 磷酸 钠 缓冲 液 ; 在 60℃下 用
0. 15mol /L的单链缓冲液温育分离柱 5min后收集
样品 ,重复操作两次。
单链 cDN A的脱盐: 用 AK TA Explorer 100仪
器 ( America公司生产 )脱盐 ,使用的柱子是经过 TE
buffer平衡的 Sephadex G-25小柱。于 0℃以 2倍体
积进行乙醇沉淀 ,以回收 cDN A。
1. 4　目的序列的 PCR扩增
同聚物加尾采用 DNA3′末端转移酶 ( Promega
公司生产 ) ,在上述扣除 cDN A3′末端加上同聚物
dCT P。在 20μL的反应体系中 ,扣除 cDN A 2 pmol,
末端转移酶 15～ 30 u, d CTP 50 pmo l, 5×缓冲液
4μL。
取上述加尾过的扣除 cDN A 2μL用于 PCR反
应。 上游引物为: 5′CCG CGC GGC TAT TT T
T TT TT; 下游引物为 12条锚定引物: 5′GAA
T TC ATG GGG GGG GMN, 其中 M是 A、 T、 C
中的任一种 , N是 A、 T、 C、 G的任一种 ,共 12种组
合。将参加 PCR反应的扣除 cDN A分为 12管 ,每一
管的引物分别是上游引物和 12条下游引物中的一
种配对进行 PCR反应。在 20μL PCR反应体系中 ,扣
除 cDN A 2 μL, 10 mmol /L dN T P 0. 4 μL,
25μmol /L的引物各 0. 4μL, Taq酶 ( Invit rog en公
司生产 ) 1 u, 10×缓冲液 0. 4μL。 扩增条件为
GeneAmp PCR system 2400( Perkin Elmer公司生
产 )上 94℃持续 4 min预变性 ; 94℃持续 1 min,
60℃持续 1min, 72℃持续 3min, 30个循环 ; 最后
在 72℃下反应 10min。每管取 2μL PCR产物加缓冲
液于 0. 7%的琼脂糖电泳分离 ,经溴化乙锭染色 ,以
ImageM aster V DS仪器 ( Pharmacia Bio tech公司生
产 )在紫外下检测电泳结果。
1. 5　序列测定及同源性分析
测序引物为本实验提供的引物 ,送大连宝生物
工程有限公司测序。 获得的序列通过 internet进入
NCBI基因序列库 ,申请获得基因登录号 ,并利用
BLAST对库中的所有序列进行同源性比较。
2　结果与讨论
2. 1　总 RNA质量的分析
使用 Trizol试剂提取藏红花处理细胞和正常细
胞的总 RNA的 A260 /A280的值为 1. 87, 证明 RNA的
纯度已达到要求。在 RNA的提取过程中 ,所用初始
材料是冷冻干燥后的新鲜细胞。 结果表明 ,不用液
氮 ,直接研磨成粉状 ,提取的效果也很好 ,这与传统
的采用液氮研磨的方法比较起来省时省力。 用酚和
氯仿重复提取一次可以提高 RNA的纯度。甲醛变性
电泳结果见图 1。
1593佘卫炜 , 等: 　用扣除杂交法分离藏红花苷合成相关基因的克隆
图 1　总 RNA的甲醛变性凝胶电泳
　　从图 1可以看出 ,每一泳道上的 28 s、 18 s、 5 s
rRN A的带型均清晰完整 ,且 28s的亮度约为 18s的
两倍。结果表明实验中获得的 RNA在纯度和完整性
方面均符合要求 ,可以顺利进行后续的反转录及
PCR工作。
2. 2　扣除 cDNA的 PCR扩增
本文作者在设计扣除 cDN A PCR扩增引物时
在扣除 cDN A 3′末端增加同聚物 ,并设计了 12种不
同的下游锚定引物 (分别为第 1～ 12号引物 ) ,分别
和上游引物配对 ,对相同的末端加尾过的 12份扣除
cDN A进行 PCR扩增。如图 2所示 ,第 1～ 12泳道分
别为 12种锚定引物与上游引物配对 ,对扣除的
cDN A进行 PCR扩增。可以看出: 第 2、 4、 6、 9、 11
泳道扩增得到了特异性产物。第 13泳道为 DNA
Marker 2000。
图 2　扣除 cDNA PCR扩增产物的凝胶电泳
在 12管扣除 cDN A的 PCR产物当中 ,有 5管扩
增得到特异性条带 ,这些有效的下游引物为: 5′
GAA T TC ATG GGG GGG GAT 3′; 5′GAA T TC
ATG GGG GGG GAC 3′; 5′GAA T TC ATG GGG
GGG GTG 3′; 5′GAA TTC ATG GGG GGG GCA
3′; 5′GAA T TC ATG GGG GGG GCG 3′。剩余 7
管没有得到特异性条带。甲醛变性电泳结果见图 2,
可以看到 ,第 2、 第 9和第 11泳道扩增各得到 1条特
异性条带 ; 第 4和第 6泳道扩增各得到两条特异性
条带。其中第 6泳道有一条带不很明显。根据相关软
件计算 ,各泳道的条带大小如下: 第 2泳道约 750
bp, 第 4泳道分别约为 1. 2 kbp和 900 bp, 第 6泳道
分别约为 1. 6kbp和 800 bp,第 9泳道约为 1. 2 kbp,
第 11泳道约为 500 bp。
2. 3　扣除 cDNA的序列分析
用刀片将上述特异性条带从凝胶上切割下来以
后纯化 ,并以此为模板以对应引物进行 PCR扩增。
这些特异性条带重复 PCR扩增的结果具有比较好
的重复性。其中图 2的第 4号引物扩增产物中 ,长度
约 1. 2 kb的特异性扩增条带重复性最好 ,如图 2、 3
所示。将图 3中第 1泳道里的目的条带切割纯化 ,送
大连宝生物工程有限公司进行测序。
图 3　 4号引物扩增产物 1. 2kbp条带
PCR扩增产物的凝胶电泳
由于 PCR产物测序的固有弊端 ,测序未能得到
全长。得到的序列是中间的 532 bp的序列。该序列
申请 Gene Bank的基因登陆号为 AY623084。将该
基因通过 inter net与 N CBI中的基因进行比较 ,结果
发现 ,胡杨中由高盐环境引起的差异表达的一条
mRNA( AF315118)反转录的 cDN A序列中的一部
分 ,即 37～ 541 bp之间的碱基序列与该扣除 cDN A
中的 507个碱基有 96%的同源性 ,如图 4。该 mRNA
的长度与该扣除 cDN A的长度相似。
先前的研究表明 ,藏红花苷是在特定的生长发
1594 清 华 大 学 学 报 (自 然 科 学 版 ) 2004, 44( 12)
育阶段合成的一种特殊的次生代谢产物 ,在正常细
胞中不会大量合成 ,只是在开花阶段才会大量产生。
不能排除藏红花在开花阶段必须合成一些化合物在
引诱昆虫协助其授粉的同时还必须抵抗昆虫给自己
造成的创伤以及微生物的感染。藏红花苷的合成可
能与环境胁迫有关。
图 4　扣除 cDNA AY623084与胡杨 mRNA AF315118 cDNA碱基序列的比较
3　结　论
本研究用扣除杂交的方法成功地从藏红花培养
细胞中分离到几条与藏红花苷合成相关的特异表达
的 cDN A克隆。其中一条与胡杨中由高盐环境引起
的差异性表达的一条 mRNA的 cDN A序列有较高
( 96% )的同源性 ,分析藏红花苷的合成可能与环境
胁迫有关。此外 ,从藏红花苷的合成途径分析 ,合成
藏红花苷的相关基因不止一个。在本研究中 ,共获得
了 6条特异性表达 cDN A的条带。 作者将通过进一
步研究 ,并对其进行全基因序列分析 ,并通过它们在
藏红花苷合成过程中作用而鉴定其功能。 由于这些
特异性表达的 cDN A克隆与藏红花苷的合成密切相
关 ,因此其中一定包括藏红花苷合成最关键的编码
基因。
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