全 文 ：第 41卷　第4 期 厦门大学学报(自然科学版) Vol.41　No.4
　2002年 7 月 Journal of Xiamen University (Natural Science) Jul.2002　
文章编号:0438-0479(2002)04-0476-05
甜菊钙调蛋白基因的克隆及结构分析
收稿日期:2001-11-26
基金项目:国家自然科学基金重大项目资助(19890300)
作者简介:熊玲媛(1974-),女 ,博士研究生.
＊通讯作者:Corresponding author
熊玲媛 ,徐金森 ,陈睦传＊
(厦门大学生命科学院 细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室 , 福建 厦门 361005)
摘要:钙调蛋白(Calmodulin)是生物细胞内一种重要的调控蛋白 , 通过其与靶酶的相互作用控制细胞正常的生长发
育及细胞对外界环境变化的反应.我们从甜菊顶芽和花芽中提取总 RNA , 逆转录合成 cDNA第一链 , 以此为模板 , 参
考GenBank上已发表植物的钙调蛋白基因序列合成 5 端和 3 端引物 , 利用多聚酶链式反应(PCR)扩增并克隆得到了
甜菊钙调蛋白基因的两个异型基因.序列分析表明 ,它们均由 450 个核苷酸组成 , 编码 148 个氨基酸.在核苷酸序列
上与迄今已知的多种植物钙调蛋白基因均有很高的同源性 , 同源率在 83%以上 , 编码的氨基酸序列同源性更高 , 同
源率高达 95%以上.这两个基因之间存在差异 ,其核苷酸序列同源率为 85%, 编码区的氨基酸序列的同源率为 99%,
仅在第 122个氨基酸由ALA 代替了VAL.
关键词:甜菊;钙调蛋白基因;cDNA克隆;聚合酶链式反应(PCR)
中图分类号:Q 291 文献标识码:A　　　　　　　　　　　　　　　
　　甜菊(Stevioside rebaudiana Bertoni)是一种新型
糖源作物 ,其糖苷具有高甜度 、低热能 、易溶解 、耐
热 、稳定等特点 ,已作为糖精和部分蔗糖的替代品 ,
广泛用于食品 、医药等行业.但是由于甜菊是自交不
亲 、异花授粉作物 ,极易杂交导致品质退化 ,自 70年
代引种至今 ,我国甜菊品种严重退化 ,糖苷含量 、口
感均远远低于日本品种 ,因此 ,培育抗逆 、高产 、优
质 、高糖苷含量的新品种 ,了解控制甜菊糖苷合成相
关酶的表达及活性成为目前亟待解决的问题.钙调
蛋白是一种具有较高分子稳定性 、耐热 、小分子的酸
性蛋白质(等电点 3.9 ～ 4.3),是细胞第二信使系统
的重要成分 ,在 Ca2+信号系统传导中起着关键的作
用 ,它通过和Ca2+的结合而激活一系列的靶酶和非
酶蛋白质 ,从而调控生理代谢及基因表达 ,控制细胞
正常的生长和发育.大量研究表明其参与了酶活性
调节 、细胞分裂与分化 、细胞骨架与细胞运动 、细胞
分泌和渗透调节 、光合作用 、孢子萌发 、种子萌发 、花
粉萌发 、激素反应 、核内酶系统及基因表达等众多生
命活动过程[ 1] .分离甜菊钙调蛋白基因对于揭示其
在甜菊生殖和生长发育过程中的作用机理 ,对于了
解钙信使系统在甜菊糖苷合成相关酶活性调节过程
中的作用 ,以进一步改良甜菊品种 ,人工控制甜菊糖
苷合成过程 ,具有重要意义.
1　材料和方法
1.1　材料和试剂
供试验甜菊(Stevia rebaudiana Bertoni)品种为
“云宾” ,由中国科学院作物品种资源研究所提供.转
化受体菌E.coli DH5α由本实验室保存.RNA抽提试
剂 TRIZOL、限制性内切酶及 PCR扩增试剂盒购自上
海生物工程公司 ,引物由上海生物工程公司合成;凝
胶回收试剂盒为上海华舜生物工程有限公司产品;
cDNA合成试剂盒 ,克隆载体 PMD 18-T Vector 及连
接试剂为 TaKaRa Biotech 公司产品.其它有关试剂
和药品均为分析纯.
1.2　甜菊总 RNA 的提取
所有器皿都经 0.1%DEPC处理.取甜菊顶芽和
花芽共 100 mg 混合 ,加液氮研磨成粉状 ,加 1 mL
TRIZOL试剂匀浆 ,用氯仿和酚/氯仿分别抽提一次 ,
上清用异丙醇沉淀后 ,用 75%的乙醇洗盐 ,干燥后
溶于 40 μL无 RNA酶的无菌水中-70 ℃保存.取 10
μL 进行甲醛变性电泳检查.
1.3　cDNA第一链的合成
参考 TaKaRa Biotech公司 cDNA试剂盒上的方
法 ,以甜菊总 RNA 为模板 ,Oligo dT 为引物 ,在逆转
录酶的作用下合成 cDNA 的第一链 , -20 ℃保存备
用.
1.4　PCR体外扩增
引物根据 GenBank 上已发表植物的 CaM cDNA
翻译起始密码子和终止密码子附近高度保守的碱基
序列设计合成 ,序列为:
5′端 引 物:5 -GCGC GAATTC GGCATGGCG-
GATCCGCTCACCGACGA -3
3′端 引 物:5 -GGCC GGATCC TCCCTAGGC-
CATCATGACCTTGAC-3′
(引物中划线部分分别是引入的 EcoRI 和
BamHI限制性酶切位点).以合成的 cDNA 第一链为
模板进行 PCR扩增 ,反应条件为:94 ℃变性 45 s ,55
℃退火60 s ,72 ℃延伸 60 s ,共 35个循环 ,扩增后于
72 ℃保温 10 min ,最后于 4 ℃保存.
1.5　PCR扩增产物的克隆
PCR扩增产物经 1.2%琼脂糖凝胶电泳 , 用胶
回收试剂盒回收后 ,与克隆载体 PMD 18-T Vector 连
接.按 sambrook 的方法制备大肠杆菌 DH5α感受态
细胞 ,将5μL连接产物加入到40μL DH5α感受态细
胞中 ,冰上放置 30 min , 42 ℃热激 90 s , 再冰浴 2
min ,加入 LB培养基 360 μL ,于 37 ℃下振荡 1 h ,涂
于含5μg/μL氨卞青霉素和20μg/mL X-gal的 LB培
养基上 ,37 ℃培养过夜.
1.6　重组子克隆的筛选鉴定
在选择培养基上挑取白色菌落 ,用碱裂解法少
量提取质粒 DNA 并做 PCR 、限制性内切酶 BamHI
酶切鉴定.选择插入外源片段的重组子进行测序 ,并
用 Blast软件进行同源序列比较和分析.
2　结果与分析
2.1　钙调蛋白基因的 PCR扩增
以逆转录合成的 cDNA 第一链为模板 ,经 35个
循环的 PCR扩增后得到的 DNA片段 ,经 1.0%琼脂
糖凝胶电泳 ,结果表明 PCR产物长约 0.45 kb(图
1).初步认为这条带可能是甜菊钙调蛋白基因片段.
2.2　PCR扩增产物的克隆和重组子的鉴定
将扩增得到的 0.45 kb DNA片段经胶回收 ,与
PMD 18-T Vector 连接后 ,转化大肠杆菌 DH5α感受
态细胞 ,筛选出一批抗氨苄青霉素的菌落 ,对其中
12个白色菌落进行质粒 DNA 提取 ,做 PCR和酶切
分析.由于PCR扩增的两端引物中都存在 BamHI酶
切位点GGATCC ,所以使用 BamHI 酶切可以鉴定重
组质粒中的插入片段.结果筛选到10个插入片段为
0.45 kb左右的重组子(图 1),选取其中 4个做测序和
　图 1　PCR扩增产物电泳图
A.甜菊总 RNA 的 RT-PCR 产物;B.λDNA/HindⅢ
marker
　Fig.1　Agarose gel electrophoresis of PCR product
图 2　酶切的重组质粒电泳图
C.DNA marker DL 2 , 000 +15 , 000;D.PLC-1/
BamHI;E.PLC-2/ BamHI;F.甜菊总 RNA 的 RT-
PCR产物
Fig.2　Agarose gel electrophoresis of PLC-1 and PLC-2
·477·第 4期　　　　　　　　　　　　　　熊玲媛等:甜菊钙调蛋白基因的克隆及结构分析
序列分析.结果表明 4个克隆中两个克隆插入片段
两两相同 , 将这两个不同插入片段分别命名为
RCaM-1 、RCaM-2 , 其对应的重组质粒分别命名为
PLC-1 、PLC-2.
2.3　PCR扩增片段的序列分析
DNA序列测定结果表明 , RCaM-1 、RCaM-2 由
450个核苷酸组成 ,编码 148个氨基酸 ,两个序列编
码区在核苷酸序列上与迄今已知的多种植物调蛋白
基因均有很高的同源性 ,其中与玉米[ 2] 、豌豆[ 3] 、水
稻[ 4] 、马铃薯[ 5] 、大麦[ 6] 、甘蔗[ 7] 、辣椒[ 8]等植物的钙
调蛋白基因的同源率在 83%～ 86%之间 ,编码的氨
基酸序列同源性更高 , 同源率高达 95%～ 98%.
RcaM-1 、RcaM-2之间存在差异 ,其核苷酸序列同源
率为85%,编码区的氨基酸序列的同源率为 99%,
　图 3　甜菊钙调蛋白基因 RCaM-1 、RCaM-2的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列之间的比较
下划线部分为 PCR引物 , 1 , 2 , 3 , 4分别表示 RCaM-1 核苷酸序列 、RCaM-2 核苷酸序列 、 RCaM-2 对应的氨基酸序列 、
RCaM-1对应的氨基酸序列.“ +”表示与前一项相同的核苷酸和氨基酸
　Fig.3　Comparison of nucleotide sequence and derived amino acid sequence of Rebaudiana calmodulin gene RCaM-1 、RCaM-2
·478· 厦门大学学报(自然科学版)　　　　　　　　　　　　　　　　　2002年
　图 4　甜菊钙调蛋白 RcaM-2 4 个结构域之间的同源性
(方框内示相同序列)
　Fig.4　The homology between the 4 domains of CaM from RcaM-2
(The sequences in the frame represent identical ones)
仅在第122 个氨基酸由ALA代替了VAL.
3　讨　论
钙调蛋白有一系列重要的生理功能 ,因而其在
结构上也极其保守 ,本文以甜菊为材料 ,通过 PCR
扩增所得的钙调蛋白基因与其它已知的相应序列有
很高的同源性 ,进一步证明了这一点.
钙调蛋白分子与钙离子结合后被激活 ,再通过
与靶酶结合激活其后的一系列生理生化反应而起到
信号传递的作用.钙调蛋白分子有 4个钙离子结合
域 ,分别位于第 8 ～ 40氨基酸 ,44 ～ 76 氨基酸 ,81 ～
113氨基酸 , 117 ～ 148 氨基酸之间.这 4 个结构域
中 , Ⅰ/ Ⅲ 、Ⅱ/Ⅳ之间存在很高的同源率.Yagi认为 ,
N结构域(Ⅰ , Ⅱ)对钙离子浓度变化起反应 ,C 结构
域(Ⅲ , Ⅳ)参与和靶蛋白的结合 ,只有完整的钙调蛋
白分子 ,才能表达生理功能[ 9] .甜菊钙调蛋白的 4个
结构域中 , Ⅰ/ Ⅲ 、Ⅱ/ Ⅳ之间亦存在很高的同源率
(图 4),并且其存在同源性的氨基酸与光敏核不育
水稻完全一致 ,充分体现了其在进化过程中的高度
保守性和重要性.
近年在多种植物中发现了在基因结构上存在差
异的异型(isoform)CaM DNA 克隆.大麦钙调蛋白
CaM-2同CaM-1之间存在 76%同源性[ 10] .拟南芥中
多拷贝的CaM基因ACaM-1 ,ACaM-2和ACaM-3在核
苷酸序列上同源性大约为 86%.ACaM-2 和 ACaM-3
编码相同的蛋白质 ,这个蛋白和 ACaM-1所编码的
蛋白在 Ca2+结合区域之外的 4个保守位置上存在
区别[ 11] .本论文利用多聚酶链式反应(PCR)扩增并
克隆得到的两个异型 CaM 基因在核苷酸序列上存
在 15%差异 ,其所编码的蛋白质中有一个差异氨基
酸(第 122位),存在于第Ⅳ结构域上.对于这两个基
因所编码的蛋白质在甜菊防御反应信号传递及细胞
生长和发育调控过程中的生理作用的异同 ,还有待
实验的进一步证明.
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Cloning and Structurl Analysis of Calmodulin Gene
from Stevia rebaudiana Bertoni
XIONG Ling-yuan , XU Jin-sen , CHEN Mu-chuan
(School of Life Science , the Key Laboratory of Education Ministry for Cell Biology and
Tumor Cell Engineering , Xiamen Univ., Xiamen 361005 , China)
Abstract:Calmodulin is a calcium binding protein that modulates the activity of diverse group of proteins including
some protein kinase , adenylate cyclases and ATPase.Here we used totle RNA of Stevia rebaudiana Bertoni as the tem-
plate for PCR.The PCR primers were designed and synthesized according to the 5 -ahd 3 -terminal oligonucleotide se-
quences of Calmodulin genes of plants from GenBank.The recombinant clones were obtained on selected medium.The re-
sults of DNA sequences analysis show that two calmodulin isoforms of Stevia rebaudiana Bertoni consist of 450 nucletides
and encode 148 amino acids.They share more than 83% homologies for nucleotide sequences and 95% for encoding
amino acid sequences as compared with those of calmodulin genes of other plants.The two isoform genes share 85%and
99%homologies for nucleotide sequences and encoding amino acid sequences.
Key words:Stevia rebaudiana Bertoni;calmodulin gene;cDNA clone;polymerase chain reaction(PCR)
·480· 厦门大学学报(自然科学版)　　　　　　　　　　　　　　　　　2002年