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浙江红山茶花粉萌发与贮藏特性研究



全 文 :西北林学院学报 2016,31(1):103~106
Journal of Northwest Forestry University
  doi:10.3969/j.issn.1001-7461.2016.01.19
浙江红山茶花粉萌发与贮藏特性研究
 收稿日期:2015-02-28 修回日期:2015-04-24
 基金项目:浙江省自然科学基金项目:浙江红山茶濒危机制的研究(LY13C160009)。
 作者简介:叶 欣,女,硕士,研究方向:浙江红山茶发育。E-mail:344109286@qq.com
*通信作者:谢 云,女,副教授,博士,研究方向:山茶种质资源的开发与利用。E-mail:xieyun@zafu.edu.cn
叶 欣1,谢 云2*,茹华莎1
(1.浙江农林大学 风景园林与建筑学院,浙江 临安311300;2.浙江农林大学 天目学院,浙江 诸暨311800)
摘 要:以浙江红山茶(Camellia chekiangoleosa)的花粉为材料,采用花粉离体培养法,研究不同
浓度蔗糖、硼酸所组成的液体培养基对浙江红山茶花粉萌发的影响,筛选出花粉最适离体培养基,
同时探讨了不同储藏条件对花粉活力的影响。结果表明:浙江红山茶在150g·L-1蔗糖+0.1g·
L-1硼酸的液体培养基条件下萌发率最高(88.36%),且在4℃低温条件下密封保存有利于浙江红
山茶新鲜花粉活力的保持,花粉生活力可以维持60d左右。
关键词:浙江红山茶;花粉;萌发;贮藏
中图分类号:S685.14   文献标志码:A   文章编号:1001-7461(2016)01-0103-04
Polen Germination and Storage of Camellia chekiangoleosa
YE Xin1,XIE Yun2*,RU Hua-sha1
(1.School of Landscape Architecture,Zhejiang A&F University,Lin’an,Zhejiang311300,China;
2.Tianmu College of Zhejiang A&F University,Zhuji,Zhejiang311800,China)
Abstract:Effects of the media with different concentrations of sucrose,boron on polen vitality of Camellia
chekiangoleosa were examined in vitro to select the optimal medium.Influences of different storage condi-
tions on polen vitality were also studied.It was found that the optimum medium was sucrose 150g·L-1+
H3BO30.1g·L-1,in which the rate of germination was 88.36%,and the polens of C.chekiangoleosa Hu
sealed under 4℃ was beneficial to maintain the polen vitality.
Key words:Camellia chekiangoleosa;polen;germination;storage
  浙江红山茶(Camellia chekiangoleosa)属于山
茶科(Theaceae)山茶属(Camellia),是我国山茶属
中的特有种。20世纪50年代中期最早在浙江发
现[1]。浙江红山茶蕴藏着许多抗性基因和优良品质
基因,是山茶和油茶品种改良、育种的重要基因
源[2]。但是现存浙江红山茶(C.chekiangoleosa)资
源破坏严重,野生资源已处于濒危状态[3],被浙江省
列为渐危种和省级珍稀濒危植物[4]。迄今为止,关
于浙江红山茶花粉的研究主要集中在花粉形态方
面[5],国内外尚未见浙江红山茶花粉离体培养和储
藏特性方面的研究报道。因此,本研究通过不同浓
度蔗糖、硼酸所组成的液体培养基对浙江红山茶花
粉萌发的影响,筛选出最适合浙江红山茶花粉萌发
的培养基。并且通过不同贮藏方法对浙江红山茶花
粉进行贮藏试验,探讨出最适合浙江红山茶花粉的
贮藏条件,为浙江红山茶的人工授粉、花粉贮藏、生
殖生物学等研究提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
2013年12月8日9:00,随机选取浙江农林大
学苗圃地内盛花期浙江红山茶,采集花药即将开裂
的花朵,用镊子采集花药于硫酸纸上,放于实验室通
风光照处让其自然散粉,等花药散粉后及时将花粉
收集到10mL离心管内用于花粉培养基选择及花
粉贮藏试验。
1.2 试验方法
1.2.1 花粉离体萌发法  采用液体培养法,液体
培养基主要成分为 H3BO3 和蔗糖。蔗糖设置5个
梯度,分别为0、50、100、150、200g·L-1;硼酸设置
5个质量浓度梯度,分别为0、0.05、0.1、0.15、0.2g
·L-1。
将双凹载玻片置于铺有2张湿润滤纸的培养皿
中,然后用吸管吸取少量培养液滴于载玻片凹处,培
养基表面要厚薄均衡,接近圆形,接着用干净毛刷沾
取少许花粉均匀撒于培养基表面,最后将培养皿置
于温度为25℃、湿度为75%的恒温箱中培养,4h后
取出,以花粉管萌发的长度超过花粉粒直径作为花
粉萌发标准,在 Axio Imager 2显微镜下观察并统
计花粉的萌发率。每个处理取3个视野,每个视野
统计100粒花粉。取其平均值作为该处理的花粉萌
发率。计算公式为:花粉萌发率/%=(已萌发花粉
数/花粉粒总数)×100
1.2.2 花粉的贮藏 以上述自然阴干的花粉作为
试验材料,均匀分成4份装入10mL的离心管内密
封保存,并置于常温25℃、低温4℃、低温-18℃和
超低温-78℃共4种不同条件下贮藏。每隔0、6、
12、18、24、30、36、42、48、54、64、74d取出一部分花
粉,从离体萌发法中筛选出最优方法测定其萌发率。
试验操作步骤、培养条件及统计方法同上述离体培
养法。
1.3 数据处理
采用SPSS19.0分析软件和 Microsoft Excel
2007对结果数据进行分析,百分率需经过平方根反
正弦转换后再分析。
2 结果与分析
2.1 蔗糖和硼酸单因素对浙江红山茶花粉萌发的
影响
2.1.1 蔗糖单因素对浙江红山茶花粉萌发率的影
响 不同质量浓度的蔗糖对浙江红山茶花粉萌发的
影响见图1,采用不同浓度的蔗糖培养基,花粉萌发
率呈显著性差异。在无蔗糖的培养基中,虽然花粉
有萌发,但是萌发率较低。随着蔗糖质量浓度的升
高,花粉的萌发率呈现先高后低的趋势,萌发率均显
著高于对照,蔗糖对花粉萌发起到明显的促进作用。
蔗糖浓度为150g·L-1的时候,花粉萌发率最高,
平均为31%,当蔗糖浓度>150g·L-1时,发生质
壁分离,花粉失去活力,萌发率降低。当花粉浓度为
200g·L-1时,花粉萌发率最低,平均为18%。因
此,适宜的蔗糖浓度为150g·L-1。
图1 不同质量浓度的蔗糖对浙江红山茶花粉萌发的影响
Fig.1 Effects of different sucrose concentrations on
C.chekiangoleosapolen germination
2.1.2 硼酸单因素对浙江红山茶花粉萌发率的影
响 不同质量浓度的硼酸对浙江红山茶花粉萌发的
影响见图2,硼酸对花粉萌发率具有较大的影响。
硼酸浓度在0~0.1g·L-1之间时,随着硼酸浓度
的升高,花粉萌发率显著升高。在硼酸浓度为0.1g
·L-1时,花粉萌发率最高,平均为37%,与其他处
理间差异性显著。但是当硼酸浓度在0.1~0.2g·
L-1之间时,随着硼酸浓度的升高花粉萌发率显著
下降,但均高于对照。当硼酸浓度为0.2g·L-1
时,花粉萌发率最低,平均萌发率为15%。
图2 不同质量浓度的硼酸对浙江红山茶花粉萌发的影响
Fig.2 Effects of different boric acid concentrations on
C.chekiangoleosapolen germination
2.2 多因素组合对浙江红山茶花粉萌发率的影响
从表1可以看出,在不同组合条件下,浙江红山
茶花粉均能萌发。蔗糖各种浓度下以150g·L-1
萌发率最高,硼酸各种浓度下以0.1g·L-1萌发率
最高。且试验结果表明,处理10萌发率最高,平均
萌发率为88.36%。处理4的萌发率最低,平均萌
发率为31.46%。虽然处理11的萌发率较高,平均
为80.43%,但可能因硼酸浓度较高,导致花粉管生
长不良(图3A)。综合试验结果表明 ,以150g·
L-1蔗糖+0.1g·L-1硼酸为浙江红山茶花粉离体
萌发最佳培养基组合。在此培养基下,浙江红山茶
花粉管的萌发情况较好(图3B)。
401 西北林学院学报 31卷 
A.萌发生长状况不良的花粉×10;B.萌发生长状况良好的花粉(×10)
A.The polen germinated at bad situation;B.The polen germinated at normal situation
图3 花粉离体萌发情况(×10)
Fig.3 Germination of polen in vitro(×10)
表1 不同因素对浙江红山茶花粉萌发的影响
Table 1 Polen germination of Camellia chekiangoleosa
in different media
处理
蔗糖
/%
H3BO3
/(g·L-1)
萌发率/%
重复1 重复2 重复3 均值
1  50  0.05  43.45  40.47  38.51  40.81b
2  50  0.1  71.22  73.24  72.94  72.47ab
3  50  0.15  47.92  49.38  47.78  48.36ab
4  50  0.2  31.02  33.1  30.25  31.46bc
5  100  0.05  70.61  71.11  72.5  71.41ab
6  100  0.1  80.56  82.57  83.16  82.10a
7  100  0.15  75.48  76.79  72.76  75.01ab
8  100  0.2  55.19  55.49  54.47  55.05ac
9  150  0.05  75.51  76.21  74.34  75.35ab
10  150  0.1  88.11  89  87.98  88.36a
11  150  0.15  79.82  80.1  81.36  80.43ab
12  150  0.2  45.69  44.57  43.97  44.74ac
13  200  0.05  51.1  50.82  53.53  51.82b
14  200  0.1  55.54  57.25  53.33  55.37ab
15  200  0.15  52.03  54.54  57.82  54.80ab
16  200  0.2  32.55  38  34.82  35.12bc
R  3  3
MS  17.45  15.85
F  763.76  693.75
注:不同小写字母表示在p<5%水平上有显著差异。
2.3 不同储藏条件对浙江红山茶花粉活力的影响
采用4种不同的储藏方法对浙江红山茶花粉进
行储藏试验,用上述花粉离体培养法得出的最佳离
体培养基检测花粉的生活力。由表2可以看出,随
着储藏时间的延长,浙江红山茶花粉生活力呈现下
降趋势,且储藏时间和储藏温度均对浙江红山茶花
粉活力产生显著影响(p<0.01)。
室温储藏的浙江红山茶花粉生活力只能维持
12~18d左右,说明浙江红山茶花粉在室温的条件
下生活力快速降低,可能是花粉由于外界温度高而
使内部呼吸强度增大,最后导致营养枯竭而失活,而
且室温内的相对湿度太低也会导致花粉代谢受到抑
制而失去生活力。因此室温条件并不满足浙江红山
茶花粉的储藏和后期利用的需要。
表2 不同储藏条件下浙江红山茶花粉的萌发率
Table 2 Polen germination of C.chekiangoleosa
under different storage conditions %
储藏
时间/d
4℃储藏
新鲜花粉
-18℃储藏
新鲜花粉
-78℃储藏
新鲜花粉
室温储藏
新鲜花粉
0  95.4aA  95.4aA  95.4aA  95.4aA
2  92.93abA  84.51bB  76.01bC  38.51bD
6  89.94cA  60.75cB  53.59cB  10.89cC
12  83.37dA  47.82dB  20.19dC  2.23dD
18  55.4eA  24.02eB  14.12eC  0dD
24  50.15efA  12.15fB  8.62fC  0dD
30  44.79gfA  6.08gB  0gC  0dC
36  38.12gA  0hB  0gB —
42  30.83hA  0hB  0gB —
48  27.59h 0h — —
54  11.38i — — —
64  7.02i — — —
注:小写字母表示相同花粉和相同储藏温度处理条件下不同储藏时
间对浙江红山茶花粉生活力影响的多重比较。大写字母表示相同储
藏时间和相同花粉处理条件下不同储藏温度对浙江红山茶生活力影
响的多重比较。
在-18℃和-78℃的储藏条件下,浙江红山茶
花粉生活力随着时间的延长而下降,而且下降速率
较快。在相同的储藏时间下,-18℃储藏条件下的
花粉生活力高于-78℃储藏条件下的花粉生活力。
花粉储藏2d时,-18℃储藏条件下的花粉生活力
为84.51%,而-78℃储藏条件下的花粉生活力为
76.01%;花粉储藏30d时,-18℃储藏条件下的花
粉生活力为6.08%,而-78℃储藏条件下的花粉生
活力已下降为0。由此可以看出,超低温并不适合
浙江红山茶新鲜花粉的长期储藏。可能是由于新鲜
501第1期 叶 欣 等:浙江红山茶花粉萌发与贮藏特性研究
花粉含水量较高,在放入低温的环境当中,花粉细胞
内的水分容易结冰,导致冰冻伤害,从而影响了花粉
的活力保持。
由表2可以看出,4℃储藏条件下可以延长浙江
红山茶花粉储藏时间。浙江红山茶花粉的生活力随
着储藏时间的延长而呈下降趋势,相比其他处理,下
降速度缓慢。且储藏时间相同的情况下,花粉生活力
都显著高于其他处理(p<0.01)。花粉储藏12d时,
活力仍高达83.37%;12d后花粉生活力的下降速度
加快,储藏24d时花粉生活力为50.15%;之后花粉
的生活力急剧下降,储藏64d时,花粉的生活力下降
为7.02%。相比-18℃、-78℃和室温储藏,4℃储藏
条件更适合浙江红山茶新鲜花粉的短期储藏。
3 结论与讨论
很多研究表明离体萌发法对所有花粉均适宜,
大多数植物都采用离体萌发法来测定花粉的活力和
萌发特性,如矮牡丹[6]、火焰无核葡萄[7]、杜鹃红山
茶[8]、广玉兰[9]、景宁木兰[10]等。花粉的离体萌发
受多重因素的影响,其中蔗糖和硼酸是影响花粉萌
发的最重要因素。一般认为,蔗糖既可以维持细胞
的渗透压,也可以为花粉萌发提供养分,硼酸既可以
促进细胞对糖的吸收、转化和代谢,也可以促进果胶
糖的合成[11]。但是当培养基中的蔗糖的浓度高于
细胞内部渗透压时,细胞会发生质壁分离现象,而导
致花粉死亡[12]。本试验证明了这一点,在单因素试
验过程中,蔗糖浓度在0~150g·L-1之间,硼酸浓
度在0~0.1g·L-1之间时,随着浓度的增加,萌发
率显著上升。而高于适宜的浓度时,会抑制花粉的
萌发。
花粉的生活力受自身遗传特性和外界因素的影
响,不同的物种新鲜花粉的生活力不同。一般来说,
花粉生活力均会随着储藏时间的延长而下降,不同
的储藏条件和不同的花粉处理方法在保持花粉生活
力方面会有所不同[13-15]。本试验通过不同温度条件
下对浙江红山茶新鲜花粉进行储藏,结果表明:超低
温并不适合浙江红山茶花粉的贮藏,相比室温条件
和-78℃、-18℃,在4℃储藏条件下,浙江红山茶
花粉生活力维持时间较长,更适合浙江红山茶新鲜
花粉的短期储藏。原因可能是新采集的花粉往往水
分含量较高,花粉潮湿结块,在冷冻过程中容易结成
冰晶,使细胞膜受损导致生活力丧失,不适合超低温
储藏,比如百合品种‘Brunelo’花粉、地被菊花粉、
红恺木花粉等[16]。此结果也与邹峰[17]等报道的油
茶花粉4℃储藏特性研究相一致,4℃冷藏有利于保
持油茶花粉活力。从目前的结果来看,浙江红山茶
花粉的含水量可能是影响花粉储藏成功与否的关键
因素,与张亚利[18]等关于花粉超低温保存研究进展
中的结论相一致。
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(下转第129页)
601 西北林学院学报 31卷 
唐棣中得出的结论相似。尹鹏先[9]等在前期研究中
发现适合东亚唐棣的增殖培养基为 MS+6-BA 3.0
mg·L-1+NAA 0.1mg·L-1,但在研究过程中进
而发现在继代培养达6~8代以上时,组培苗表现出
生长退化、质量不高等性状,难用于炼苗移栽等工厂
化生产,这很可能是由于高浓度的6-BA在继代培
养的过程中不断在植物体中积累形成的,因此,非常
有必要探索出新的激素组合。与尹鹏先[9]等在前期
研究中相比,加入IBA 激素之后增殖系数达到
5.71,健康指数达到2.90,茎干粗壮,叶片舒展与任
继文[15]等的研究相似。与之前东亚唐棣组织培养
体系的增值系数与生长状况相比有了很大的提高。
并且在经过若干次继代培养之后没有出现生长退
化、衰弱等现象,完成了组培苗继代培养的复壮。
高质量的东亚唐棣组培苗对其炼苗移栽的成活
率有着重要影响。通过本次试验,培育出了增殖系
数较高、生长健康的无菌试管苗,这将为东亚唐棣工
厂化育苗生产提供技术支撑。但是研究中发现,随
着培养时间继续增长,组培苗增殖出的数量会越来
越多,由于受到空间和营养的限制,苗之间的竞争也
会增强,叶片和茎的生长量都会受到限制,因此,非
常有必要根据组培苗的生长情况及实地更换培养
基,已达到最好的培养效果。
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