全 文 ：西北林学院学报 2008 , 23(5):65 ～ 69
Journal o f No r thw est Fo restry Univer sity
东南石栎 ISSR-PCR反应体系的优化
①刘丽丽1 , 2 , 　金则新2 ＊ , 　李建辉2 , 　李钧敏2
(1.北京林业大学自然保护区学院 ,北京 100083;2.台州学院 生态研究所 ,浙江临海 317000)
摘　要:为了利用 ISS R分子标记进行东南石栎(Li thocarpus har landi i)种群遗传多样性分析 ,获
得重复性和可靠性较高的 ISSR带谱 ,有必要对其影响因素进行优化。以东南石栎基因组 DNA 为
研究对象 ,测试东南石栎 ISSR扩增的最适退火温度 ,并采用单因素试验 ,对影响 PCR扩增效果的
一些因素 ,如 Mg2+浓度 、4×dN TP 浓度 、模板 DNA 用量 、引物用量 、BSA 浓度 、Taq DNA 聚合酶
用量等 6个因素进行筛选和优化 ,最终确立了可用于东南石栎 ISS R-PCR分析的最适宜的 PCR反
应条件:10 μL PCR反应体积中 ,1×T aq酶配套缓冲液(200 mmo l·L -1 Tris-HCl ,pH 值 8.8 ,100
mmo l·L -1 KC l , 1%T ri ton X-100), 0.5U Taq DNA 聚合酶 ,2.25 mmol ·L-1 MgCl2 , 0.5 mmo l
·L-1 4×dNT P ,6pmo l引物 ,2 mg ·mL-1 BSA ,10 ng 模板 DNA 。在此最适条件下 ,比较了降落
PCR的扩增结果与最适退火温度条件下的 PCR扩增结果的差异 ,确定了最适的 ISSR扩增程序:
94℃预变性 5 min ,94℃变性 1 min , 57℃退火 1 min(每个循环降低 0.5℃), 72℃延伸 1.5 min ,共
10个循环;94℃变性 1 min , 52℃退火 1 min ,72℃延伸 1.5 min ,共 25个循环;72℃延伸 5 min 。以
此条件采用 12个引物对千岛湖的东南石栎居群进行扩增 ,共扩增出 174个 DNA 片段 ,多态位点
百分率为 81.61%,种群内遗传多样性处于较高水平 。
关键词:东南石栎;ISSR;优化;遗传多样性
中图分类号:S792.180.4　　　文献标识码:A　　　文章编号:1001-7461(2008)05-0065-05
Optimization of ISSR-PCR Reaction Sys tem of Lithocarpus har landii
LIU Li-l i1 , 2 , 　JIN Ze-xin2＊ , 　LI Jian-hui2 , 　LI Jun-min2
(1.Co llege o f Natura l Reserves , B ei j ing Forestr y Univer sity , B ei j ing 100083 , Ch ina;
2.I nsti tu te o f E colog y , Taizhou Universi ty , Linh ai , Zhej iang 317000 , China)
Abstract:In order to establish the best ISS R-PCR reaction sy stem of Li thocarpus harlandi i .The annealing
temperature w ere determined , factors af fecting the PCR amplifica tion we re selected and optim ized , such as
Mg
2+
concentration , dN TP concentrat ion , DNA template s dosage , primer do sage , BSA concentrat ion ,
and T aq DNA po lymerase do sage w ere selected and optimized.T he results show ed that the optimal ISSR
reaction sy stem for L .harlandi i was as fo llow s:1×Taq po lymerase buf fer (200 mmol ·L -1 Tris-HC l ,
pH8.8 , 100 mmol · L-1 KCl and 1% Triton X-100), 0.5U Taq DNA polyme rase , 2.25 mmo l · L-1
MgCl2 , 0.5 mmo l·L-1 4×dN TP , 2 mg ·mL-1 BSA , 10 ng DNA template , 6pmol primer in to tal 10 μL
reaction volume.The ISSR amplification results using touchdown o r universal prog ram were compared and
the sui table ISSR amplif icat ion procedure w as determined:predenaturation at 94℃ fo r 5 m in ,denaturation
at 94℃ for 1 min , annealing a t 57℃ fo r 1 min(decrease 0.5℃every cycle), elongation at 72℃for 1.5 min ,
to tal 10 cycles;then denaturation at 94℃ fo r 1 min , annealing at 52℃for 1 min , elongation at 72℃ for 1.5
min , total 25 cycles;final elongation at 72℃ fo r 5 min.12 random primers w ere selected in the ISSR ampli-
①　收稿日期:2007-12-07　修回日期:2007-12-27
　基金项目:浙江省自然科学基金项目(Y505331);浙江省科研计划资助项目(20040287)。
　作者简介:刘丽丽 ,女 ,硕士研究生 ,主要从事植物生态学研究。＊通讯作者:金则新 ,男 ,教授 ,主要从事植物生态学研究。 E-mail:jzx@t zc.edu.cn
f icat ion of Qiandaohu popula tion of L .harlandi i and 142 repetit ive loci w ere produced.The percentage of
po lymo rphic loci w as 81.61% indicating the relatively high genetic diversi ty w ithin Qiandaohu population
of L .harlandi .
Key words:Lithocarpus harlandi i ;ISS R;optimizat ion;genetic dive rsity
　　东南石栎(Lithocarpus harland ii)隶属壳斗科
(Fagaceae)石栎属(Li thocarpus),是我国亚热带常
绿阔叶林主要建群种之一[ 1] 。目前对东南石栎的研
究仅见于光合生理生态特性[ 2]以及不同演替系列群
落中遗传多样性的 RAPD分析[ 3] ,但利用 ISS R研
究东南石栎种群遗传多样性迄今未见报道。
简单重复序列区间(inter-simple seuquence re-
peat , ISSR)是一种建立在 PCR反应基础上的 DNA
分子标记技术 ,由 Zietkiewicz[ 4] 等于 1994年创建 ,
它结合了 SSR 和 RAPD 的优点 ,具有 RAPD 操作
简单 ,所需 DNA量少 ,不需预知研究对象的基因组
序列等优点。同时 , ISS R引物序列较长 ,具有高重
复性和稳定性 ,可用于辨别相关物种的基因型[ 5] 。
现已广泛应用于植物品种鉴定 、遗传作图及遗传多
样性等方面的研究[ 6] 。为了利用这一分子标记进行
东南石栎种群遗传多样性分析 ,获得重复性和可靠
性较高的 ISSR带谱 ,有必要对其影响因素进行优
化 ,确立最佳 ISS R反应体系。
本研究对浙江省千岛湖的东南石栎种群进行
DNA 提取 ,并以此为模板 ,探讨 ISS R-PCR反应体
系中 Mg2+浓度 、4×dNTP 浓度 、模板 DNA 用量 、
引物用量 、BSA 浓度 、Taq DNA 聚合酶用量等 6 个
因素对扩增结果的影响 ,以获得东南石栎 ISSR 反
应的最佳体系。以此反应体系对千岛湖的东南石栎
种群的遗传多样性进行初步分析 ,为进一步利用该
技术研究东南石栎种群遗传多样性及遗传结构奠定
基础 。
1　材料与方法
1.1　材料
试验材料采自浙江省淳安县千岛湖国家森林公
园 ,地理位置 29°12′N , 118°38′E ,海拔 665 m ,坡向
NW30°。随机选取 20株个体 ,每株取着生有较多
健康幼嫩叶片的枝条置于保鲜袋中 ,封口 ,编号。装
于样品贮藏箱(由超低温冰袋保持冷藏条件)中迅速
带回实验室 ,洗净 、晾干 、置于-70℃超低温冰箱中
保存备用 。
1.2　方法
1.2.1　模板 DNA 的提取与定量 　采用改进的
SDS法[ 7] 提取东南石栎基因组 DNA ,经 0.8%琼脂
糖凝胶电泳 ,用 GIS 凝胶成像分析系统(上海天能
科技服务公司)拍照 ,经软件分析荧光面积 ,与标准
DNA 分子量参照比较而定量 , 稀释成 20 ng ·
mL-1 , -20℃保存备用。
1.2.2　ISS R原初扩增条件及 PCR扩增程序　IS-
SR引物采用加拿大哥伦比亚大学(University of
British Columbia ,Set No.9 ,N o.801-900)提供的序
列 ,由上海生工生物工程公司合成。根据本实验室
以往的 PCR扩增经验 ,综合设计得到的原初扩增反
应体系为:10μL PCR 反应体积中 ,1×T aq酶配套
缓冲液(200 mmo l· L-1 T ris-HCl , pH 值 8.8 , 100
mmol · L-1 KCl , 1% Triton X-100), 0.5U Taq
DNA 聚合酶(北京鼎国生物技术有限公司), 2
mmol· L-1 MgC l2 , 0.4 mmo l · L-1 4 ×dN TP , 2
mg ·mL-1牛血清白蛋白(Bovine serum albumin ,
BSA),10 ng 模板 DNA , 3 pmol引物(上海 Sangon
公司)。初步设定的 ISSR-PCR 扩增反应程序为:
94℃预变性 5 min , 94℃变性 1 min ,57℃退火 1 min
(每个循环降低0.5℃), 72℃延伸1.5 min ,共 10个
循环;94℃变性 1 min , 52℃退火 1 min , 72℃延伸
1.5 min ,共 25个循环;72℃延伸 5 min 。扩增反应
在 P ×2梯度热循环仪美国 Thermo 公司生产中进
行 。
扩增产物在 1.6%的琼脂糖凝胶(含 0.5 g ·
L-1溴化乙锭)中电泳 ,电泳缓冲液为 0.5×TBE ,用
200 bp DNA 梯度作标准分子量参照物 ,于 GIS 凝
胶成像分析系统(上海天能科技服务公司)拍照记
录 。
1.2.3　不同退火温度的 PCR扩增　采用 PCR温
度梯度模式 ,自动设定温度从 48℃～ 63℃,生成的
温度梯度为 48.1℃、48.5℃、49.3℃、50.7℃、
52.4℃、54.4℃、56.3℃、58.3℃、60.6℃、62.0℃、
62.7℃、63.2℃。其余 PCR 扩增程序同 1.2.2 ,以
在不同退火温度下进行 PCR扩增 。
1.2.4　东南石栎 ISSR- PCR扩增反应体系的优化
　ISS R-PCR扩增反应体系的优化按常规采用单因
素试验 ,共试验了 6 个因素各 4 个水平(表 1)。其
余条件同 1.2.2。
1.3　数据统计与分析
1.3.1　ISS R多样性表型带计数　用 200 bp DNA
梯度做分子量标记 ,对照反应产物在凝胶上的对应
位置 ,有带记为“1” ,无带记为“0” ,得到原始数据矩
66 西北林学院学报 23 卷　
阵。
表 1　东南石栎 ISSR-PCR体系优化的因素和水平
T ab le 1　Factor s and levels used in the op timiz at ion of L.har land ii ISSR-PCR reaction sys tem
水平 M g2+浓度/(mm ol· L -1) dNTP 浓度/(mmol· L-1) BSA 浓度/(mg·mL -1) 模板DNA用量/ ng 引物用量/ pmol Taq酶用量/ U
1 2 0.3 0 5 3 0.5
2 2.25 0.4 1 10 6 0.7
3 2.5 0.5 2 15 9 0.9
4 2.75 0.6 3 20 12 1.1
1.3.2　数据分析　采用 POPGENE 32软件[ 8] 进行
数据的分析 ,计算多态位点百分率(P)、Shannon 信
息指数(I)和 Nei指数(h)。
2　结果与分析
2.1　ISSR-PCR扩增反应体系的优化
2.1.1　Mg2+浓度对 ISSR扩增的影响　Mg 2+可以
通过影响 Taq DNA 聚合酶的活性 ,从而影响 PCR
扩增[ 9] ,是影响 PCR扩增结果的一个重要因素 。从
图 1(泳道 1 ～ 4)可以看出 ,Mg2+浓度的变化对 IS-
SR扩增有明显的影响 ,当 Mg2+浓度为 2 mmo l·
L-1时 ,条带数量较少 , 亮度较弱;当 Mg2+浓度在
2.25 ～ 2.75 mmol·L -1之间时 ,条带的数量及亮度
变化不明显 。但由于较高的 Mg2+浓度会影响 PCR
扩增时引物与模板结合的特异性 ,因此本试验确定
Mg2+的最适浓度为 2.25 mmol·L-1 。
　　注:M 为 200 bp DNA 梯度标准分子量参照物;1～ 4为 Mg2+浓度 ,分别为 2.00 、2.25 、2.5 、2.75 mmol· L-1;5～ 8为 dNTP 浓度 ,分别为
0.3 、0.4 、0.5 、0.6 mmol· L-1 ;9～ 12为 DNA 用量 ,分别为 5 、10 、15 、20 ng;13～ 16为引物用量 ,分别为 3 、6 、9 、12 pm ol;17～ 20为 BSA 浓度 ,
分别为 0 、1 、2 、3 mg·mL-1 ;21～ 24为 Taq酶用量 ,分别为 0.5 、0.7 、0.9 、1.1U.
图 1　不同因素对东南石栎 ISSR 扩增的影响(UBC873 号引物)
Fig.1　The ef fect of amp li ficat ion condit ions on L.harlandi i ISSR am plifi cation
2.1.2　dNTP 浓度对 ISSR扩增的影响　dNT P 作
为 ISSR-PCR反应的原料底物 ,其浓度的变化对 IS-
SR条带的影响很大。底物浓度太低 ,扩增产物不完
全 ,底物浓度太高 ,又会出现非特异性扩增。由图 1
(泳道 5 ～ 8)看出 ,当 4×dN TP 浓度为0.5 mmol ·
L
-1时 , 扩增的条带最为明亮清晰;当大于或小于
0.5 mmol·L-1时 , 条带数量与清晰度明显减少 。
因此 ,在东南石栎 ISSR 扩增中 4×dN TP 浓度以
0.5 mmol/ L最为适宜。
2.1.3　模板 DNA 用量对 ISS R扩增的影响　从图
1(泳道 9 ～ 12)可以看出 ,在东南石栎的 ISSR-PCR
扩增反应中 ,对模板 DNA用量的要求并不严格 ,不
同浓度模板 DNA 均可扩增出产物 。当模板 DNA
用量从 5 ng 增至 10 ng 时 ,条带清晰度和数量有所
提高;增至 15 ng 时条带质量开始下降 ,可能当浓度
升高时 ,模板 DNA 中所含的杂质会影响 PCR 扩
增。因此 ,本试验确定模板 DNA 的最适用量为 10
ng 。
2.1.4　引物用量对 ISSR扩增的影响　引物的用
量对 ISS R扩增质量会产生明显的影响 ,过量的引
物浓度还会导致引物二聚体的形成[ 10] 。当引物用
量为 3 pmo l时 ,所扩增的条带清晰度较低而且数量
也少(图 1(泳道 13 ～ 16));当引物用量增至 6 pmo l
时 ,条带质量明显提高;但增至 9 pmol时 ,条带开始
模糊。所以本试验确定引物的最佳用量为 6 pmol。
2.1.5　BSA 浓度对 ISSR扩增的影响　BSA 对于
酶活性有一定的促进作用 , 可以减低 ISS R扩增的
背景[ 6] ,从而影响着条带的清晰度 。当不添加 BSA
时(图 1(泳道 17 ～ 20)),条带模糊不清;当 BSA浓
度为 1 mg·L-1时 ,条带清晰度增加;当 BSA 浓度升
高至 2 mg·L-1及以上时 , ISSR扩增效果最为理想。
故本试验最终选择 BSA的最适浓度为 2 mg ·L-1 。
2.1.6　Taq DNA 聚合酶用量对 ISSR扩增的影响
　在 ISS R扩增中 , Taq DNA 聚合酶用量对扩增反
67第 5 期 刘丽丽等　东南石栎 ISS R-PCR反应体系的优化
应的结果有着直接的影响 。用量过低会导致合成速
率下降[ 11] ,增加 Taq 酶用量会导致反应特异性下
降 ,且试验成本提高 。从图 1(泳道 21 ～ 24)可见 ,在
Taq DNA 聚合酶用量的 4 个梯度中 ,扩增效果相
当 ,条带均很清晰 。考虑到经济因素 ,该试验 Taq
DNA 聚合酶用量采用 0.5U 。
2.2　最适 PCR扩增程序的确定
Don 等[ 12] 1991 年提出了降落(touchdown ,
TD)PCR 技术 ,其基本原理为:根据引物的 Tm值 ,
设置一系列从高至低的退火温度 ,开始选择的退火
温度高于估计的 Tm值 ,随着循环的进行 ,退火温度
逐渐降低至 Tm 值 ,并最终低于 Tm值。作为一种行
之有效的 DNA 体外扩增方法 , TD-PCR目前被越
来越多地使用[ 13-14] ,它广泛适用于有非特异性产物
和没有适宜退火温度等的情况[ 12] 。在无法确定最
佳退火温度的前提下 ,通过一系列的递减退火温度
来得到 PCR扩增产物。本试验采用 TD-PCR程序
来进行 ISSR扩增 ,为了验证 TD-PCR程序应用于
ISS R扩增的可行性 ,对千岛湖的东南石栎居群的退
火温度进行确定 ,比较分析在最适退火温度条带下
ISS R扩增效果与 TD-PCR扩增效果的差异。由图
2可以看出 ,在 48.1℃到 50.7℃的温度区间内 ,均
能扩增出清晰而明亮的条带;从 52.4℃到63.2℃的
温度区间内条带数量和清晰度差异不大 ,经比较确
定东南石栎最适的退火温度为 50.7℃。经比较 ,最
适退火温度下 , ISS R的扩增结果与 TD-PCR 的扩
增效果差异不大 ,因此 touchdown程序应用于 ISSR
扩增是可行的。考虑到 TD-PCR可适用于任一 IS-
SR引物 ,不需再额外地进行退火温度的确定 ,因此 ,
采用 touchdown程序应用于 ISSR扩增具有明显的
便利性 。因此 ,本试验最终决定使用 TD-PCR程序
来进行东南石栎 ISSR分析 。
2.3　东南石栎居群遗传多样性初步研究
在最适的 ISSR 扩增体系下 ,从 100 个引物中
共筛选出扩增条带清晰 、重复性好的 12个随机引物
(碱基序列见表 2)作为正式扩增的引物 ,对千岛湖
居群进行了 ISSR扩增 ,其中引物 UBC810 的扩增
结果如图3所示 。12个随机引物在20株东南石栎
个体中共扩增出 174 个 DNA 片段 ,扩增片段大小
介于 200 ～ 2 000 bp 。不同的引物在东南石栎中检
测到的位点数不同 ,如引物 UBC807检测到 17个位
点 ,而 UBC840只检测到 4个位点。在所检测到的
174个位点中 ,多态位点为 142 个 ,多态位点百分率
为 81.61%。经 POPGENE32软件分析 ,可知千岛
湖的东南石栎种群内的遗传多样性很高(Nei指数
为 0.282 2 ,Shannon信息指数为 0.423 2)。李建辉
等[ 3] 对浙江天台山东南石栎 3个种群的遗传多样性
　　注:M 为 200 bp DNA 梯度标准分子量参照物;1～ 12:退火温度
依次为 48.1℃、48.5℃、49.3℃、50.7℃、52.4℃、54.4℃、56.3℃、
58.3℃、60.6℃、62.0℃、62.7℃、63.2℃。
图 2　不同退火温度对东南石栎 ISS R扩增
的影响(UBC873 号引物)
Fig.2　The effect of annealing temperature on L.
har land i i IS SR amplif ication
图 3　千岛湖的东南石栎种群 ISSR 引物
扩增结果(UBC810 号引物)
Fig.3　ISSR am plifi cation result s of L.har land i i
population of Qiandaohu(wi th prim er UBC810)
表 2　ISSR 分析用的 12 个引物序列
Table 2　Sequen ce of 12 primers used in ISSR analysi s
引物 序列 引物 序列 引物 序列
UBC807 AGAGAGAGAGAGAGAG T UBC823 TCTCTCTCTCTCTCTCC UBC844 CTCTCTCTCTCTCTCTRC
UBC810 GAGAGAGAGAGAGAGA T UBC824 TCTCTCTCTCTCTCTCG UBC873 GACAGACAGACAGACA
UBC811 GAGAGAGAGAGAGAGAC UBC840 GAGAGAGAGAGAGAGAYT UBC887 DVDTCTCT CTCTCT CTC
UBC815 CTCTCT CTCTCT CTCTG UBC843 CTCTCTCTCTCTCT CT RA UBC899 CATGGTG TTGGT CAT TGT
68 西北林学院学报 23 卷　
进行 RAPD分析 ,结果显示其多态位点百分率平均
为 65.32%, Nei指数平均为 0.232 0 ,Shannon信息
指数平均为 0.345 8。这与 Gilbert 等[ 14] 、Yang
等[ 15]和 Jonsson 等[ 16] 的研究结果基本一致 ,比较
RAPD而言 , ISSR能检测到更多的遗传变异 ,且稳
定性更好 。东南石栎居群具有较高的遗传多样性 ,
可能与其高适应性有关 ,这可能也是东南石栎成为
我国亚热带常绿阔叶林主要建群种之一的主要原因
之一 。
3　结论
Touchdown程序可以较好地应用于 ISS R 扩
增 ,不再需要对每一引物进行退火温度的优化 ,具有
较高的便利性。最终确定所使用的 ISSR扩增反应
程序:为 94℃预变性 5 min ,94℃变性 1 min , 57℃退
火 1 min(每个循环降低 0.5℃),72℃延伸 1.5 min ,
共 10 个循环;94℃变性 1 min , 52℃退火 1 min ,
72℃延伸 1.5 min ,共 25个循环;72℃延伸 5 min。
通过对 Mg2+浓度 、4×dN TP 浓度 、模板 DNA
用量 、引物用量 、BSA 浓度 、Taq DNA 聚合酶用量
等6个因素进行筛选和优化 ,最终确立东南石栎 IS-
SR-PCR分析的最适宜的反应体系为:10 μl PCR反
应体积中 ,1×Taq酶配套缓冲液(200 mmol · L-1
T ris-HCl , pH 值 8.8 , 100 mmol · L-1 KCl , 1%
T ri ton X-100),0.5U Taq DN A 聚合酶(北京鼎国
生物技术有限公司), 2.25 mmol ·L-1 MgCl2 , 0.5
mmo l·L-1 4×dNTP , 6 pmo l引物 , 2 mg · mL-1
BSA ,10 ng 模板 DNA 。
千岛湖的东南石栎种群的多态位点百分率为
81.61%, Nei 指数为 0.282 2 ,Shannon 信息指数为
0.423 2 ,表明东南石栎的遗传多样性处于较高水
平。
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