全 文 ：黄毛耳草中乌索酸的分离制备及定量分析＊
陈　武 , 邹盛勤 , 李开泉
(宜春学院生物工程研究所 , 江西　宜春　336000)
①
[摘要] 目的:采用 “醇提凝析法” 分离制备黄毛耳草中的乌索酸 , 建立其含量的测定方法.
方法:IR 、MS 、1HNMR、13CNMR鉴定乌索酸结构 , 反相高效液相色谱法测定其含量 , 色谱柱为
Symmetry Shield RP18 柱 (3.9 ×150mm , 5μm);流动相为甲醇∶水 (88∶12 , V/V);流速为
1.0mL/min;二极管阵列检测器检测 , 检测波长 210nm;柱温 25℃;结果:确证化合物为乌索
酸.HPLC法线性范围:4.5 ～ 22.5μg;线性回归系数大于 0.9998.乌索酸纯度为 99.82%, 得率
3.65‰.结论:制备方法实用可行 , 乌索酸纯度高 , 安全性好.HPLC法快速简便 、 精密度高 、
重现性好 、线性范围宽 , 可用于控制乌索酸产品质量.
[关键词] 黄毛耳草;制备;乌索酸;结构确证;含量;HPLC
[中图分类号] RP31 [文献标识码] A　 [文章编号] 1671-380X (2005)02-0001-04
Preparation and Quantitative Analysis of Ursolic Acid Separation from Herba Hedyotidis Corymbosae
CHEN Wu , ZOU Sheng-qin , LI Kai-quan
(Bioengneering Research Institute , Yichun University , Yichun 336000 China)
Abstract:Objective:To separate and extract the Ursolic acid from Hedyotis corymbosa Lam by adopting the method of
“ethanol extracting and agglutination” and to determine the content of ursolic acid.Method:Using spectrum to identify
the structure of ursolic acid by IR , MS , 1HNMR 13CNMR.Adetermination method of ursolic acid by reversed-phase high
performance liquid chromtograph was established.The chromatographic column , SymmetryShield RP18(3.9×150mm ,
5μm), methanol-water (88:12 , V/V)mobile phase with 1.0 mL/min flow rate , the detected wavelength (210
nm), and the column temperature (25 ℃)were adopted.Result:The compound is recognized to be ursolic acid.The
calibration curve of ursolic acid by HPLC was linear under the content of 4.5 ～ 22.5μg , the correlation coefficient was
over 0.9998.The content is 99.82% and the gain rate is 3.65‰.Conclusion:The preparation method is practical and
feasible.The purity of ursolic acid is high and the safety is good.The analytical method is simple , accurate and has good
repeatability and wider linear range.It can be adapted to evaluate the quality of ursolic acid.
Key words:Herba Hedyotidis Corymbosae;preparation;ursolic acid;structural characteristics;content;HPLC
　　黄毛耳草 , 又名敷地两耳草 , 为茜草科耳草属
植物黄毛耳草 Herba Hedyotidis Corymbosae 的全草 ,
分布我国南方各省 , 资源丰富 , 产量较大 , 具有清
热解毒 、活血散瘀 、 利尿消肿 、 平肝明目的功能 ,
民间广泛应用于临床治疗黄疸型病毒性肝炎 , 急慢
性肾炎及肿瘤等疾病[ 1].它含有多种三萜类化合
物 , 其中乌索酸 (Ursolic acid)含量较高[ 2] , 为主
要活性成分 , 并高于同科植物伞房花耳草中乌索酸
的含量[ 3].现在药理研究发现 , 乌索酸具有抗肝
炎 、 抗肿瘤 、 抗病毒 、 抗炎抑菌及增强免疫等多种
药理活性 , 具有重要的药用开发价值[ 4].为此 , 我
们以黄毛耳草为原料 , 采用 “醇提凝析法” 分离制
备乌索酸[ 5-6] , 并建立 RP-HPLC测定分析乌索酸
含量的方法.
1　实验部分
1.1　仪器与试剂
熔点用 Boetius 显微熔点测定仪测定 , 温度未
校正;旋光度用WZZ-1S数字式自动旋光仪测定;
·1·
① 收稿日期:2005-02-28
＊基金项目:国家 “ 863” 计划重点资助项目 (2002AA2Z3217).
作者简介:陈武 (1944-), 男 , 江西奉新人 , 大学本科 , 研究员 , 主要从事天然药物与生物技术研究.
第 27 卷　第 2期
2005 年 4 月 　　　　　　　　　　　　 宜春学院学报Journal of Yichun University(natural science)　　　　　　　　　　Vol.27 , No.2Apr.2005
红外光谱用 PE 公司 Spectrum One 傅立叶变换红外
光谱仪测定;质谱用 Autospec-Ultima ETOF EL 型
质谱测定;核磁用 INOVA-600型核磁共振光谱仪
测定;含量用Waters-515型双泵高效液相色谱仪 ,
2996光电二极管矩阵检测器测定.
药材采自赣西地区宜春市袁州区 , 经本所天然
药物研究室鉴定为茜草科耳草属植物黄毛耳草Her-
ba Hedyotidis Corymbosae的全草.
95%乙醇 , 食用级 , 为广西糖厂产品;“YCXY
-1号” 除杂剂为自制品;复合酶制剂为哈尔滨神
农有限公司产品;活性炭 , 分析纯 , 为上海豪申化
学试剂有限公司产品;乌索酸对照品由中国药品生
物制品检定所提供 (批号 110742-200314).
1.2　色谱条件:色谱柱为 SymmetryShield RP18柱
(3.9×150mm , 5μm), 检测波长λ=210nm , 流动相
为甲醇-水 (88∶12), 流速 1.0mL/min , 柱温 25℃.
用外标法定量分析.
1.3　实验方法
1.3.1　分离制备
采用 “醇提凝析法” 提取分离.将干燥后的黄
毛耳草10kg粉碎成粗粉 (20 目), 用温水湿润后 ,
加入原料干重 0.5%的复合酶制剂 , 于 38℃左右酶
解处理后 , 用 7倍量 95%的乙醇 80℃回流提取 2
次 , 每次 1h , 合并提取液 , 过滤 , 减压回收乙醇
得浸膏 , 以纯水沉降洗涤后 , 加 “YCXY-1 号”
除杂剂除杂处理 2 次 , 过滤 , 用 95%乙醇溶解 ,
调节 pH 值 , 加活性炭脱色 , 过滤除杂 , 再用 95%
乙醇溶解 , 调 pH 值 , 凝析分离 、 纯化精制 , 80℃
干燥 24h , 得无色针状结晶乌索酸样品 36.5g.
1.3.2　样品结构表征
将 “1.3.1” 所得样品进行 UV 、 IR、 MS 、1H-
NMR和13C-NMR波谱测定.
1.3.3　标准曲线的测定
精确称取乌索酸对照品 9.8mg , 置于 10mL 容
量瓶中 , 用甲醇溶解并稀释至刻度 , 摇匀 , 制成含
乌索酸 0.98mg/mL 的对照品溶液 .分别吸取乌索
酸对照品溶液 4 、 8 、 12 、 16 、 20μL , 按 1.2项下色
谱条件进样 , 平行 3次 , 求其峰面积的平均值得标
准曲线.
1.3.4　样品溶液配制
精确称取乌索酸样品 9.6 mg , 置于 10mL 容量
瓶中 , 用甲醇溶解并稀释至刻度 , 摇匀 , 溶液经
0.45μm微孔滤膜过滤后作为样品溶液.
2　实验结果
2.1　样品结构鉴定
样品为无色针状结晶 , 易溶于热乙醇 、 热甲
醇 , 可溶于乙醚 、 醋酸乙酯 、 乙醇 、 甲醇 、 丙酮 、
氯仿等有机溶剂 , 不溶于石油醚和水.[ α] D20+65°
(C0.095 , EtOH), 熔点 285 ～ 287℃, 与乌索酸对
照品混合熔点不下降 .IRKBrmax cm-1:3403 (-OH)、
2965 、 2927 、 2868 (C-H)、 1691 (C =O)、 1456 、
1386 、 1377 (CMM)、 1031 (C-O).EI -MS (m/
z):456 (M+)、 441 (M -CH3)、 438 (M -H20)、
423 (M-CH3 -H20)、 411 (M -COOH)、 410 (M
-H -COOH).D 、 E 环离子 a (RDA 裂解):248
(a.100)、 203 (a -COOH)、 189 (a - CH2 -
COOH)、 133;A 、 B 环离子 b (RDA 裂解):208
(b)、 207 (b-H)、 190 (b-H2O)和 189 (b-H2O
-H).1H -NMR (DMSO-d6)示 5个季碳甲基:
(δ0.68 、 0.75 、 0.87 、 0.89 、 1.04 , 各 3H , s);2个
叔碳甲基 (δ0.81 , J =6.2Hz;δ0.91 , J =6.0Hz ,
各 3H , d);C18 (δ2.01 , J =11.4Hz , d);C3α-H
(δ3.00 , J =11.0 , 5.2Hz , 1H , td ,);C12 -H
(δ5.13 , J =3.5Hz , 1H , t);C15-H (δ1.00 , J =
13.6 , 1H , brd);C16 -H (δ1.93 , J =13.2 , 4.0 ,
1H , td);C29-H (δ0.81 , J =6.2Hz , 3H , d);C30
-H(δ0.91 , J =6Hz , 3H , d).13C-NMR (DMSO
-d6)示 7个伯碳:δ28.3 (C23)、 16.1 (C24)、 15.2
(C25)、 17.0 (C26)、 23.3 (C27)、 16.9 (C29)、 21.1
(C30);9 个仲碳:δ38.2 (C1)、 27.0 (C2)、 18.0
(C6)、 32.7 (C7)、 22.8 (C11)、 27.5 (C15)、 23.8
(C16)、 31.2 (C21)、 36.3 (C22);7个叔碳:δ76.8
(C3)、 54.8 (C5)、 47.9 (C9)、 124.6 (C12)、 52.3
(C18)、 39.4 (C19)、 38.5 (C20);6个季碳:δ38.4
(C4)、 39.8 (C8)、 36.5 (C10)、 138.2 (C13)、 41.6
(C14)、 48.8 (C17);1个羧基碳:178.3 (C28).
以上波谱及理化数据与文献值一致[ 7-8] , 确证
样品为乌索酸[ 9].
2.2　HPLC测定分析样品含量
2.2.1　色谱条件的确定
采用甲醇 -水 (88:12)为流动相 , 配比简
单 , 经济实用 , 出峰时间在 7.4min左右 (柱温 25
℃), 且分离度较好 , 达基线分离 , 同时流动相的
pH 值为 5.4左右 , 符合色谱柱的要求.
2.2.2　测定波长的选择
取乌索酸对照品溶液 , 在 190 ～ 500nm 进行光
谱扫描 , 流动相中乌索酸最大吸收波长为 202.2
nm , (图1), 但溶剂甲醇在短波长处均有吸收 , 为
了减少干扰 , 又尽量不降低灵敏度 , 选择 210 nm
·2·
第 2期　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　宜春学院学报 (自然科学)　　　　　　　　　　　　　　　第 27 卷
作为检测波长.
图 1　乌索酸紫外光谱
2.2.3　标准曲线
以峰面积对样品进样量 (μg)进行线性回归 ,
得乌索酸回归方程为:Y=1.42×105X + 2.19×
10
4 , R =0.9998 , 表明当乌索酸进样量在 4.5 ～
22.5μg 之间时 , 线性关系良好.乌索酸标准曲线见
图2.
图 2　乌索酸标准曲线
2.2.4　精密度试验
精密吸取乌索酸对照品溶液 10μ进样 , 重复 5
次 , 测得乌索酸峰面积 RSD为 0.80% (n=5), 本
法精密度良好.
2.2.5　重现性试验
精密称取同一批乌索酸样品 5份 , 按 1.3.4项
下方法配制样品溶液 , 吸取 10μL 进样分析 , 测得
乌索酸峰面积 RSD为 1.12%(n=5), 方法重现性
好.
2.2.6 含量测定
吸取样品溶液 10μL 进样分析 , 重复进样 5次 ,
测得样品中乌索酸平均含量为 99.82%.乌索酸对
照品及样品HPLC色谱图见图 3.
　　　　　a.乌索酸对照品　　　　　　　　　　　　　　　　b.乌索酸样品
图 3　乌索酸对照品及样品 HPLC 色谱图
3　讨论
3.1　本制备工艺以黄毛耳草为原料 , 采用 “醇提
凝析法” 分离制备乌索酸 , 仅以乙醇为溶剂 , 未加
其它有机溶剂 , 采用自制的 “YCXY-1 号” 除杂
剂 , 有效去除脂类 、 类脂类 、 酚类及叶绿素等杂
质 , 不仅保证了产品无有害溶剂残留 , 提高了安全
性 , 而且简化了操作程序 , 降低了生产成本 , 有利
于乌索酸的富集和纯化 , 为工业试生产创造了技术
条件.
3.2　调节控制 pH 值是本工艺的重要环节 , 对脱色
除杂 、凝析分离 、 产品质量及得率有较大影响.经
反复试验 , 结果表明 , 提取物脱色除杂时 , 应将
pH值调为 9左右 , 使乌索酸形成钠盐 , 过滤除杂
后 , 再将 pH值调为 2左右 , 使乌索酸钠盐转化为
乌索酸 , 这是工艺过程中应注意控制的重要技术参
数.
3.3　为了提高原料药材的利用率 , 简化工艺程序 ,
本工艺采用复合酶制剂对原料进行酶解处理 , 一方
·3·
第 2 期　　　　　　　　　陈　武 , 邹盛勤 , 李开泉:黄毛耳草中乌索酸的分离制备及定量分析＊　　　　　　　第 27 卷
面促使乌索酸及其苷与植物细胞壁脱离 , 加速乌索
酸及其苷的充分释放 , 并使乌索酸苷转化为苷元 ,
另一方面将一些可水解的脂类 、类脂类等杂质转化
为小分子水溶性物质.经上述酶解处理的原料用乙
醇提取 , 所得浸膏加水沉降洗涤 2 次后 , 用
“YCXY-1号” 除杂剂进一步除去脂类 、 类脂类 、
酚类 、叶绿素等杂质.提取物以乙醇溶解 , 加活性
炭脱色 , 经凝析分离 、纯化精制 , 烘干 , 即得无色
针状结晶乌索酸 , 其纯度达 99.82%, 得率达
3.65‰.
3.4　本文建立的高效液相色谱定量分析乌索酸含
量的方法 , 具有快速简便 、 精密度高 、 重现性好 、
线性范围宽的优点 , 可作为控制乌索酸产品质量的
方法.
(致谢:乌索酸的质谱 、核磁共振谱由中国海
洋大学药物研究所李英霞教授代测)
参考文献:
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天然药物活性成分研究重点实验室简介
　　我校组建的省天然药物活性成分研究重点实验室 , 所从事的天然药物学研究开发活动属江西省优
先发展的学术和技术领域。重点实验室经过三年的建设和发展 , 在整体学术水平 、学科建设 、人才培
养 、 实验能力 、科技开发 、 服务经济以及在省内外影响等方面都得到了提高与发展 , 其效能已经开始
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化 、 药理 、生化 、微生物 、生物技术 、 分析测试等实验室;购置了Waters高效液相色谱仪 、 PE 傅立
叶变换红外光谱仪 、 气相色谱仪 、 倒置荧光生物显微镜和图像分析系统 、 Bachman核酸蛋白分析系
统 、 基因杂交仪 、 半自动生化分析仪 、 生物信号采集系统 、生理药理多导仪 、凝胶成像系统 、动物实
验室屏障环境系统等精密高档仪器设备 , 拥有万元以上仪器设备 62台 (套 、件), 本学科中外文藏书
2.5万册 , 其中拥有中外文期刊 80多种 , 实验室开放时间 10910小时 , 实验开出率达90%。现有教学
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开展天然药物活性成分的提取分离 、药物分析 、 制药工艺 、 药理药效研究 、 中药材生产规范化标准
化 、 中药指纹图谱及生物技术等科研教学工作 , 向社会开放 , 为我省我市经济建设提供了技术服务。
重点实验室建设十分注重培养与引进人才 , 现有科研 、教学人员27人 , 其中教授 8人 (含兼职 4
人), 副教授 8人 , 讲师 7人 , 助教 4人;博导 1人 , 硕导 7人;博士 2人 , 硕士 8人 , 硕士生 5人;
省市学科带头人 6人 , 形成了一支结构合理 、 人员稳定和具有较高学术水平的人才队伍 。
重点实验室承担了国家 、省 、 市重点科技计划课题 20项 , 发表学术论文 105篇 , 尤其在实施国
家 “863” 计划课题 “抗肝炎中药一类新药乌索酸及其制剂的研究开发” 中发挥了重要作用 , 获得了
“乌索酸标准品制备研究” 等一批国内领先水平或先进水平的研究成果。
·4·
第 2期　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　宜春学院学报 (自然科学)　　　　　　　　　　　　　　　第 27 卷