全 文 ：分子植物育种，2013年，第11卷，第3期，第415-420页
MolecularPlantBreeding,2013,Vol.11,No.3,415-420
研究报告
ResearchReport
用ISSR分子标记鉴定亚洲百合杂种F1代
管洁 焦雪辉 吴锦娣 王青 吕英民 *
北京林业大学园林学院,国家花卉工程技术研究中心,北京,100083
*通讯作者,luyingmin@bjfu.edu.cn
摘 要 百合杂交育种工作中，只有确定杂种的真实性，才能确定杂交工作是否成功。利用ISSR-PCR分子
标记方法对5个亚洲百合系内杂种进行鉴定，建立了百合ISSR最佳扩增反应体系，从15个ISSR引物中筛
选出了2个多态性引物，共扩增得到29条DNA条带，其中多态性条带24条，占总条带数的82.76%。结果表
明，5个杂种多数条带和亲本共有，出现双亲相加性带型，或双亲各自特有条带，部分杂种出现双亲均没有的
条带从这些特异的带型，我们可初步鉴定杂种的真实性。实践证明，ISSR分子标记，是百合杂交育种中杂种
检测的快速简便手段。
关键词 亚洲百合,杂种鉴定,ISSR标记
IdentificationofAsianLilyHybridF1byUsingISSR
GuanJie JiaoXuehui WuJindi WangQing LvYingmin*
CollegeofLandscapeArchitecture,BeijingForestryUniversity,ChinaNationalFloricultureEngineeringResearchCentre,Beijing,100083
*Correspondingauthor,luyingmin@bjfu.edu.cn
DOI:10.3969/mpb.011.000415
Abstract Only we confirmed the authenticity of the hybrid, can we identify whether the results of Lily cross-
breedingaresuccessful,whichprovidesthebasisforthefollowingbreeding.GenomicDNAswereextractedfrom
young leaves of 5hybrids and their parents. PCR conditions suitable for ISSR (inter-simple sequence repeat)
molecularmarkerwerestudied.2polymorphismprimers,(CT)7AAAand(CT)7AG ,selectedfrom15ISSRprimers
were used for parentage identification. 24 polymorphic bands was obtained among a total of 29 DNA bands
(82.76%), which was useful in matching parents and hybrids. The five hybrids share the majority bands with
parents(fatherormother)whilesomehaveuniquebandsshowingtheauthenticityofthehybrids.Theresultsindicate
thatparentageidentificationbyISSRiseffectiveincrossbreedinghybridofAsianlily.
Keywords Asianlily,Identificationofparentage,ISSRmolecularmarker
收稿日期：2012-11-30 接受日期：2013-01-25 网络出版日期：2013-02-05
URL:http://5th.sophiapublisher.com/abstract-1210-mp opa
基金项目：本研究由国家863项目(2011AA100208)，国家自然科学基金项目(31071815;31272204)和教育部博士点基金项目
(20110014110006)共同资助
百合(Lilium spp.)是百合科(Liliaceae)百合属
(Lilium)所有植物的总称，为重要的球根花卉(陈俊
愉,2000,中国林业出版社,pp.248)。其花形优美，品
质高贵典雅，与月季、菊花、郁金香并列为世界4大
切花。近20年来，百合跃居为荷兰第二大球根花卉，
而国内百合生产种球大多依赖进口，种球费高居切
花成本7成以上(刘华夏,2009)。百合杂交育种工作
开展缓慢主要是因为生长周期长，种间杂交困难。伴
随着组织培养技术和分子标记技术的迅猛发展，使
不具有亲和性的品种间杂交成为了可能，大大加快
了百合育种速度(刘亚娟,2009)。
本研究所用百合杂种是通过提前去雄、套袋授
粉获得的，但胚拯救过程中胚乳或其它母体组织也
有可能发育成苗，为了保证百合杂种后代的真实性，
需要对其进行杂种鉴定。通过观察杂种后代的形态
特征来进行，所需年限较长，受环境影响大。借助分
分子植物育种
MolecularPlantBreeding
子标记手段，可以在杂种幼苗进行早期鉴定，并且不
受环境条件的影响，可快速可靠地确定其是否为真
杂种。为确定杂种的真实性，本研究采用ISSR-PCR
的方法对杂交育种获得的5个杂种进行杂种鉴定。
1结果与分析
1.1亲本及其杂种 DNA提取
本研究用物基因组提取试剂盒(天根生化科技
有限公司)提供的步骤，提取的DNA电泳检测表明
(图1)，DNA主带清晰明亮，无明显的拖尾现象，点样
孔基本无滞留，获得高质量的DNA是后续工作顺利
进行的有利保证。
图1亲本及杂种DNA电泳鉴定
注:M:DL2000marker;B:‘BlackOut’;C:‘Cheops’;D:‘Detroit’;
L:‘Loreto’; MD1:‘Mount Duckling’; N:‘Navona’; T:‘Tre-
sor’; BL:‘Black Out’בLoreto’; MD2:‘Mount Duckling’塥;
NC:‘Navona’בCheops’;ND:‘Navona’בDetroit’;NT:‘Na-
vona’בTresor’
Figure2ElectrophoresisresultforDNAofparentsandhybrids
Note:M:DL2000marker;B:‘Bl c Out’;C:‘Cheops’;D:‘De-
troit’; L:‘Loreto’; MD1:‘Mount Duckling’; N:‘Navona’; T:
‘Tresor’; BL:‘Black Out’בLoreto’; MD2:‘Mount Duckling’
塥; NC:‘Navona’בCheops’; ND:‘Navona’בDetroit’; NT:
‘Navona’בTresor’
1.2 ISSR-PCR扩增反应体系的建立
本研究设计了三种 PCR试验方案对提取的
‘Navona’的DNA进行PCR扩增，每种方案用两个
引物3A02和3A31，每个引物进行4组重复。结果表
明，试验方案2反应体系稳定，且扩增的条带较清
晰，效果较好(图2)。
1.3特异 ISSR引物对亲本及子代的 PCR鉴定
采用试验方案2，分别用15种引物对所有的亲本
和子代的DNA进行PCR扩增，扩增产物进行凝胶
电泳，电泳结果表明引物3A19和3A20得到的条带
比较清晰，并且条带较多(图3)，共计得到29条DNA
条带，其中多态性条带24条，占总条带数的82.76%。
图2三种ISSR-PCR扩增反应体系的建立
注:M:DL2000marker;L:试验方案1 J试验方案2;Y:试验
方案3;每种方案每种引物重复4次
Figure 2 Banding patterns from‘Navona’with primers 3A02
and3A31usingthreeISSR-PCRsystems
Note:M:DL2000marker;L:Testprogram1;J:Testprogram2;
Y:Testprogram3;Eachprogramwith4replications
图3引物3A19和引物3A20对所有亲本及子代的ISSR-PCR
扩增结果
注: M: DL2000 marker; B:‘Black Out’ L‘Loreto’; MD1:
‘MountDuckling’;N:‘Navona’;C:‘Cheops’;D:‘Detroit’;T:
‘Tresor’;BL:‘BlackOut’בLoreto’;MD2:‘MountDuckling’
塥; NC:‘Navona’בCheops’; ND:‘Navona’בDetroit’; NT:
‘Navona’בTresor’
Figure 3 Banding patterns from all parents and hybrids with
primer3A19andprimer3A30
Note: M: DL2000 marker; B:‘Bl c Out’; L:‘Loreto’; MD1:
‘MountDuckling’;N:‘Navona’;C:‘Cheops’;D:‘Detroit’;T:
‘Tresor’; BL:‘Black Out’בLoreto’; MD2:‘Mount Duckling’
塥; NC:‘Navona’בCheops’; ND:‘Navona’בDetroit’; NT:
‘Navona’בTresor’
416
利用扩增结果对亲本及杂种的亲缘关系进行分
析，从表1及图3可以看出，引物(CT)7AAA扩增出的
‘BlackOut’בLoreto’条带中有8条和两亲本共有，
有2条与母本共有的特异条带，有1条与父本共有
的特异条带，没有杂种特有条带；而在引物(CT)7AGT
中有6条和两亲本完全共有的条带，有2条与母本
共有的特异条带，有2条与父本共有的特异条带，还
有1条杂种特有条带，两个引物扩增的条带大部分
与亲本相同，占总带数的63.64%。由此可见‘Black
Out’בLoreto’杂种不仅具有单亲本带型和新带型，
还有两个亲本的相加性带型。
引物(CT)7AAA扩增出的‘MountDuckling’自交
的后代条带与亲本共有，无杂种特异条带出现，而引
物(CT)7AGT扩增的条带中有1条杂种特异条带，两
个引物扩增的条带大部分与亲本共有，占总带数的
92.86%。由此可见‘MountDuckling’自交得到的杂种
兼具亲本的带型和新带型。
引物(CT)7AAA扩增出的‘Navona’בCheops’条
带中有10条与两亲本共有，有2条与父本共有，无
杂种特异条带出现；而引物(CT)7AGT扩增的条带中
有5条同两亲本，有1条同母本，1条同父本，并有1
条杂种特有条带，两个引物扩增的条带大部分与亲
本共有，占总带数的75%。总体上看，杂种‘Navona’×
‘Cheops’不仅具有单亲本带型和新带型，还有两个
亲本的相加性带型，并且与父本共有的特异带型多
于与母本共有特异性条带。
引物(CT)7AAA扩增出的‘Navona’בDetroit’条
带中有7条与两亲本共有，有2条与父本共有，无杂
种特异条带出现；而引物(CT)7AGT扩增的条带中有
4条与两亲本共有，有1条与母本共有，1条与父本
共有，并有2条杂种特有条带，两个引物扩增的条带
大部分与亲本共有，占总带数的64.71%。总体上看，
杂种‘Navona’בDetroit’不仅具有单亲本带型和新
带型，还有两个亲本的相加性带型，并且与父本共有
的特异带型多于与母本共有特异性条带。
引物(CT)7AAA扩增出的‘Navona’בTresor’条
带中有5条两亲本共有，有1条与母本共有，有1条
与父本共有，并有 1条杂种特异条带出现；而引物
用ISSR分子标记鉴定亚洲百合杂种F1代
IdentificationofAsianLilyHybridF1byUsingISSR
表1百合杂种ISSR的扩增带型及数量
Table1ISSRbandpatternandnumbersofLilyhybrids
杂种
Crossinghybrids
‘BlackOut’בLoreto’
‘MountDuckling’自交
‘MountDuckling’se fing
‘Navona’בCheops’
‘Navona’בDetroit’
‘Navona’בTresor’
引物
Primers
(CT)7AAA
(CT)7AGT
总计
Total
(CT)7AAA
(CT)7AGT
总计
Total
(CT)7AAA
(CT)7AGT
总计
Total
(CT)7AAA
(CT)7AGT
总计
Total
(CT)7AAA
(CT)7AGT
总计
Total
总带数
Totalbands
11
11
22
7
7
14
12
8
20
9
8
17
8
9
17
F
2
2
4
-
-
-
0
1
1
0
1
1
1
3
4
M
1
2
3
-
-
-
2
1
3
2
1
3
1
1
2
D
0
1
1
0
1
1
0
1
1
0
2
2
1
1
2
C
8
6
14
7
6
13
10
5
15
7
4
11
5
4
9
各种类型条带
Bandingpatterns
注:F:杂种与母本共有条带;M:杂种与父本共有条带;D:杂种特有条带,父母本没有;C:杂种,父本和母本共有条带
Note:F:Commonbandsbetweenhybridsandfemale;M:Commonbandsbetweenhybridsandmale;D:Specificbandsofhybrids;C:
Commonbandsamonghybridsandparents
417
分子植物育种
MolecularPlantBreeding
(CT)7AGT扩增的条带中有4条与两亲本共有，有3
条与母本共有，1条与父本共有，并有1条杂种特有
带，两个引物扩增的条带大部分与亲本共有，占总带
数的52.94%。总体上看，杂种‘Navona’בTresor’仅
具有单亲本带型和新带型，还有两个亲本的相加性
带型，并且与母本共有的特异带型多于与父本共有
特异性条带。
2讨论
获得百合杂种的同时，对所得的杂种苗进行早
期鉴定对于百合新品种培育具有十分重要的意义。
百合杂种幼苗从播种到开花需要3~5年，通过鉴定
不仅能较早地剔除假杂种，以免造成不必要的浪费，
还能较早地确定杂交的结果如何，为进一步育种工
作的展开提供依据。一般只要杂种出现以下三种带
型之一均可判断杂种的真实性：出现双亲各自的特
异性条带，特别是父本的特异性条带；具有双亲特
异性条带外，另有新带型的出现；显现双亲的加性
带型(吴学尉等,2009)。如仅有母本带型，则是母体组
织(如胚乳)发育而来的幼苗(史永忠等,1998;卢圣栋,
1999)，可能为假杂种。
本研究所获得的杂交苗均为亚洲百合品系内品
种杂交得来，利用ISSR分子标记对杂交苗的真实性
进行鉴定。2条ISSR引物的PCR扩增和电泳结果显
示，有的杂种与母本共有特异性带型多些；有的杂种
与父本共有特异性带型多些，但分别都具有与母本
共有的特异性带型和与父本共有的特异性带型，且
以母本、父本及杂种子代三者共有带型占据大多数，
一些杂种还出现了新带型。此外，杂种‘Navona’×
‘Cheops’，‘Navona’בDetroit’呈现出与父本共有的
特异带型多于与母本共有特异性条带，这是否暗示
其遗传性状更偏向于父本仍有待于进一步研究(谈
晓林等,2011)。本实验杂交过程是在蕾期去雄、严格
套袋情况下进行的，杂种苗与父本出现共有带，证明
了5个杂种苗的真实性。
在人工记带时，遵循只记录易于辨认的条带的
原则，所以ISSR所得到的多态性条带较少，如果用
用更高的分辨率的聚丙烯酰胺凝胶电泳代替琼脂糖
电泳，将会得到更多的条带(杨本超等,2005)。而且由
于ISSR为显性标记，使得某些现象还不能完全得以
解释。杂种鉴定中形态学鉴定是最主要的手段，以
ISSR分子标记作为形态学鉴定的辅助手段，可以在
杂种苗期快速简便的鉴定。通过形态学与ISSR分子
标记相结合对杂种进行鉴定，在今后百合杂交育种
中有广阔的应用前景。
3材料与方法
3.1植物材料及试剂
采集7个杂交亲本的幼嫩叶片以及5个杂交子
代的组培苗叶片，若立即进行DNA的提取可放在室
温下，若长时间保存，则经液氮处理后放入超低温冰
箱保存(图4)。
所用生物基因组DNA提取试剂盒、TaqDNA酶、
图4杂交亲本和子代
注: B:‘Black Out’; L:‘Loreto’; MD1:‘Mount Duckling’; N:
‘Navona’; C:‘Cheops’; D:‘Detroit’; T:‘Tresor’; BL:‘Black
Out’בLoreto’; MD2:‘Mount Duckling’塥; NC:‘Navona’×
‘Cheops’;ND:‘Navona’בDetroit’;NT:‘Navona’בTresor’
Figure4Crossingparentsandhybrids
Note:B:‘BlackOut’;L:‘Loreto’;MD1:‘MountDuckling’;N:
‘Navona’; C:‘Cheops’; D:‘Detroit’; T:‘Tresor’; BL:‘Black
Out’בLoreto’; MD2:‘Mount Duckling’塥; NC:‘Navona’×
‘Cheops’;ND:‘Navona’בDetroit’;NT:‘Navona’בTresor’
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用ISSR分子标记鉴定亚洲百合杂种F1代
IdentificationofAsianLilyHybridF1byUsingISSR
dNTPs等购于天根生化科技(北京)有限公司，15条
ISSR引物(表2)参照加拿大哥伦比亚大学(UBC)提
供的序列由生工生物工程(上海)有限公司合成；琼脂
糖为Promega公司生产，其他试剂均为国产分析纯。
72℃延伸8min；4℃保存。
试验方案3：反应体系(25μL)中各成分浓度：1×
Buffer，MgCl2(3.0 mmol/L)，dNTPs(0.2 mmol/L)，Pri-
mer(0.2μmol/L)，DNA(60ng/25μL)，TaqDNApoly-
merase(0.5U)，剩下的体积用ddH2O补足。
反应程序：94℃预变性5min；30个循环(94℃变
性1min,53℃退火3min,72℃延伸2min)；循环结
束后72℃延伸5min；4℃保存。
3.2.3PCR产物的变性及凝胶电泳分析
PCR扩增反应：分别对应上述PCR体系和相应
的反应程序，以‘Navona’的DNA为模板，通过反复
试验对比确定最佳的试验方案。本实验中采取了混合
液加样的方法，即先将ddH2O、引物、Mg2＋、dNTP、
Taq酶依次加入混合分装，再分别加入各DNA模板。
以所有的亲本和杂种的DNA为试验材料，利用
筛选出的最佳PCR实验方案，分别用15条引物对
其进行PCR扩增，筛选出最佳的引物。
凝胶电泳分析：将由最佳引物扩增出的产物进
行电泳，用2%的琼脂糖凝胶电泳(含EB)，在1×TBE
缓冲液中，120V电压电泳80min，在紫外凝胶成像
系统上，利用 QuantityOne软件观察并照相、记录。
每次试验重复3次。
作者贡献
管洁、焦雪辉和吴锦娣是本研究的实验设计和实
验研究的执行人，完成数据分析，论文的写作与修改；
王青参与论文修改；吕英民是项目的构思者和负责人，
指导实验设计。全体作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由国家 863项目(2011AA100208)，国家
自然科学基金项目(31071815; 31272204)和教育部
博士点基金项目(20110014110006)共同资助。作者感
谢试验过程中北京林业大学黄河师兄和杜庆章师兄
等人的指导。
参考文献
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士学位论文,南京林业大学,导师:施季森,pp.15-18)
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2008, DNA extraction fromLilium brownii va .viridulum
表2引物名称及序列
Table2Primersandsequencesusedinthisresearch
引物名称
Primer
name
3A02
3A11
3A15
3A19
3A20
3A25
3A26
3A27
序列(5→3)
Sequences
(5→3)
(CT)7ATC
(CT)7ACA
(CT)7ATG
(CT)7AAA
(CT)7AGT
(CT)7GAC
(CT)7GCA
(CT)7GAG
引物名称
Primer
name
3A28
3A29
3A30
3A31
3A35
3A59
3A61
序列(5→3)
Sequences
(5→3)
(CT)7AGA
(CT)7GTA
(CT)7GAA
(CT)7 AG
(CT)7 GA
(CT)7GTG
(CT)7 GT
3.2试验方法
3.2.1基因组DNA的提取和检测
主要参照植物基因组提取试剂盒(天根生化科技
有限公司)提供的步骤，提取的 DNA用 50~100μL
无菌ddH2O溶解。配置1%琼脂糖凝胶，5μLDNA
样品加lμL6×LoadingBuffer进行混样，于1×TBE缓
冲液中在90V的电压下电泳25min，完成后将胶块
放入的紫外凝胶成像仪(BioRad公司)成像并摄影。
3.2.2ISSR-PCR分析反应体系建立
分别采用试验方案1(李恩香等,2008)、试验方
案2(姜福星,2006)以及试验方案3(Yamagishietal.,
2002)，筛选出最佳ISSR-PCR反应体系进行试验，并
从前人文献中的15个引物确定多态性较好的引物。
试验方案1：反应体系(25μL)中各成分浓度：1×
Buffer，MgCl2(2.0mmol/L)，dNTPs(0.2 mmol/L)，Pri-
mer(0.4μmol/L)，DNA(60ng/25μL)，TaqDNApoly-
merase(1.5U)，剩下的体积用ddH2O补足。
反应程序：94℃预变性5min；40个循环(94℃变
性50s,52℃45s,72℃延伸75s)；循环结束后72℃
延伸8min；4℃保存。
试验方案2：反应体系(25μL)中各成分浓度：1×
Buffer，MgCl2(1.5mmol/L)，dNTPs(0.3 mmol/L)，Pri-
me(0.6μmol/L)，DNA(60ng/25μL)，TaqDNApoly-
merase(0.5U)，剩下的体积用ddH2O补足。
反应程序：94℃预变性5min；45个循环(94℃变
性40s,52℃退火45s,72℃延伸90s)；循环结束后
419
分子植物育种
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