全 文 ：研究报告
RESEARCH REPORT
龙牙百合的植株再生与遗传转化
刘菊华1　金志强1＊　徐碧玉1　郑思乡2　刘志敏3
1中国热带农业科学院生物技术研究所国家重点实验室 , 海口 , 571101
2云南农业大学 , 昆明 , 650201
3湖南农业大学 , 长沙 , 410128
＊通讯作者 , zhiqiangjin@sohu.com
摘要
以龙牙百合鳞片叶切块为外植体 , 通过多种培养基的比较试验 , 得出 MS+2 ,4-D 2mg/L+6-BA
0.2mg/ L是诱导愈伤的最佳培养基 , MS +6-BA 1mg/L +NAA 0.05mg/L 是不定芽诱导及伸长的适宜
培养基。MS+NAA 2mg/L 是生根的最佳培养基 。本试验已建立了适用于龙牙百合遗传转化的快速高频
再生系统 。用携带有几丁质酶基因和 β -1 、 3葡聚糖酶基因的工程菌 , 通过农杆菌介导法和基因枪转化
法转化龙牙百合 , 经 PCR和点杂交检测证明外源基因已经整合到植物染色体中 。同时对农杆菌介导法和
基因枪法进行比较 , 发现农杆菌介导法的转化率为 16.7%, 基因枪法的转化率为 50%, 因此可能基因枪
转化法更适于龙牙百合的遗传转化。
关键词
龙牙百合 , 遗传转化 , 农杆菌介导 , 基因枪
The Regeneration and T ransformation of Longya Lilium
Liu Juhua
1　Jin Zhiqiang 1＊　Xu Biyu1　Zheng Sixiang2　Liu Zhimin3
1 Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences , National Key Laboratory of Biotechnology Research Inst itute , Haikou , 571101
2 Yunan Agricultural University , Kunming , 650201
3 Hunan Agricultural University , Changsha , 410128
＊Corresponding author , zhiqiangjin@sohu.com
ABSTRACT
The scale leaf of Longya Lilium (lilium spp.)was taken as explant.Through the comparism experiment of dif-
ferent media , we got the result:the combination of MS +2 ,4-D 2mg/L +6-BA 0.2mg/L w as the optimum
medium for the induction of calli;the combination of MS +6-BA 1mg/L +NAA0.05mg/L was the best medium
for shoot differentiation and elongation;the medium of MS +NAA2mg/L w as the best for adventitious root.
The engineering bacterium which carried both I-Chi and I -Glu cDNA was pCG-II.Tw o methods of
Agrobacterium-mediated and gene gun were used to transformate Longya Lilium.The results of PCR analysis
and southern dot blo tting hybridization demonstrated that the Chi and Glu cDNA has been interg rated into host
genome.At the same time , compared Agrobacterium-mediated method w ith gene gun method , the t ransfo r-
mation f requency of the fo rmer was 16.7%, while the latter was 50%, so gene gun transformat ion method
w as sui table fo r Longya Lilium.
分子植物育种 , 2003 年 , 第 1卷 , 第 4 期 ,第 465—474 页
Molecular P lant Breeding , 2003 , Vol.1 , No.4 , 465—474　
KEYWORDS
Longya Lilium , Genetic-t ransformation , Agrobacterium-mediated , Gene gun
1 前言
龙牙百合 (Lilium spp.), 属于单子叶植物 ,
是我国名 、优 、特蔬菜产品之一 , 其独特的风味
和药用价值吸引人们的注意。历年来 , 它是人们
脱贫致富的主要经济作物。随着农村商品经济的
发展 , 种植面积不断扩大 , 难以保证所需轮作年
限 , 造成枯萎病 、 疫霉病日趋严重 , 甚至有的地
区是大面积失收 。农药防治效果不理想 , 给生产
造成重大损失 。因此利用现代生物技术在龙牙百
合的遗传转化上进行一些探索 , 有着十分重要的
理论和实际意义 。许多科研工作者利用百合野生
种和栽培种的不同品种 、 不同部位的外植体进行
了组织培养 , 如花器 、 地上茎 、 茎尖 、 叶片 、 鳞
片叶 、珠芽以及原生质体等 , 其再生体系的建立
已相当成熟。在国外 , Sheridan (1968), Sim-
monds 等 (1976), Gupta 等 (1978), Wick-
remesinhe 等 (1994 ), Arzate-Fernandez 等
(1997), 分别从鳞片 、 花器等诱导愈伤组织并获
得再生植株 。Prakash 等 (1986)和 Van Tuyl 等
(1991)报道:将幼嫩的花药置于培养基中能刺激
胚珠的膨大 , 可能是花药分泌一些激素诱导外植
体生长 。Priy adarshi 等 (1992)报导:完全的黑
暗对于 L.longif lorum 愈伤组织的诱导是至关重
要的 。
在国内 , 赵祥云等 (1993)以珠芽 、 陈小兰
等 (2000)以带腋芽的茎段 、 刘选明 (2000)以
鳞片叶 , 黄敏玲等 (1993)以茎尖和带腋芽的茎
段 , 姚连芳等以鳞片叶和鳞芽 , 李云侠等 (1993)
以鳞茎和叶 , 王家福等 (1999)以鳞片 、 小鳞茎
为外植体 , 对百合快繁条件进行了优化 , 马惠等
(1992)以叶片 , 汉晓红 (2000)以花丝和鳞片 ,
罗丽平等 (2001)分别对百合进行了愈伤组织的
诱导和植株再生以及条件的优化 。
在国外 , Watad 等 (1998)用微弹轰击法对
百合进行了遗传转化并检测到了表达活性 。
Langeveld等 (1995)等采用农杆菌介导法对百合
进行了遗传转化并获得了转化植株。在国内 , 有
关龙牙百合的遗传转化研究尚未见报道。
2 材料与方法
2.1 材料
龙牙百合 (Li lium spp.):为湖南农业大学
周朴华教授提供。
2.2 龙牙百合的植株再生
2.2.1 培养基
为了选择最佳的培养基体系 , 选用和设计了
多种配方的培养基进行比较 (表 1 、表 2 、 表 3)。
表 1 、 表 2 、 表 3中的培养基均为固体培养基 , 琼
脂 0.7%, 蔗糖 3%, 1 mol/L NaOH 调 pH 至 5.8
-6.2 , 121℃高压灭菌 20分钟 。
表 1　愈伤组织诱导培养基
Table1 Media fo r calli induction
培养基 培养基组成
Media Composition of the media
C1 MS+2 , 4 -D2mg/ L+6-BA0.2mg/ L
C2 MS+2 , 4 -D1.5mg/ L+6-BA0.2mg/ L
C3 MS+2 , 4 -D1mg/ L+6-BA0.2mg/ L
C4 MS+2 , 4 -D 0.5mg/ L+6-BA0.2mg/ L
C5 MS+2 , 4 -D 2mg/ L
C6 MS+NAA2mg/ L+6-BA0.2mg/ L
C7 MS+NAA1.5mg/ L+6-BA0.2mg/ L
C8 MS+NAA1mg/ L+6-BA0.2mg/ L
C9 MS+NAA0.5mg/ L+6-BA0.2mg/
表 2　不定芽诱导及伸长培养基
Table 2 Media fo r shoo t induction and elongation
培养基 培养基组成
Media Composition of the media
S1 MS+2mg/ L6-BA
S2 MS+1.75mg/ L6-BA
S3 MS+1.5mg/ L6-BA
S4 MS+1.25mg/ L6-BA
S5 MS+1mg/ L6-BA
S6 MS+2mg/ L6-BA+0.1mg/ LNAA
S7 MS+1.75mg/ L6-BA+0.0875mg/ LNAA
S8 MS+1.5mg/ L6-BA+0.075mg/ LNAA
S9 MS+1.25mg/ L6-BA+0.0625mg/ LNAA
S10 MS+1.0mg/ L6-BA+0.05mg/ LNAA
466　 　分子植物育种
Molecular Plant Breeding
表 3　诱导生根培养基
Table 3 Media fo r root induction
培养基 培养基组成
Media Composit ion of the media
R1 MS +NAA2mg/ L
R2 1/ 2MS+IBA0.25mg/ L
R3 MS+6-BA1mg/ L
R4 MS+6-BA1mg/ L+NAA0.05mg/ L
R5 MS+6-BA2mg/ L
2.2.2 培养方法和培养条件
挖取龙牙百合鳞茎 , 于室内放置一周后 , 把
鳞片叶剥下 , 剔除病残者 , 用流线形自来水冲洗
一个晚上 。第二天用 70%的酒精灭菌 1分钟 , 然
后用 0.1%的升汞消毒 10分钟 , 无菌水冲洗 3次 ,
最后用无菌滤纸吸干 。将鳞片叶切成 1cm 见方的
小块 , 背面朝下放在培养基上 。在人工气候箱
(NK system)内进行培养。
2.3 龙牙百合的遗传转化
2.3.1质粒和菌种
LBA4404/pCG-II (35S 为启动子)为中国
热带农业科学院热带作物生物技术研究所国家重
点实验室提供 。
2.3.2试剂
链霉素 (Str)、 利福平 (Rif)、 卡那霉素
(Kan)、 羧苄青霉素 (Carb)、 噻孢霉素 (Cef)、
乙酰丁香酮 (AS)以及酶 (溶菌酶 、 Taq酶 ,)为
Sigma公司产品 , 购自北京华美公司;其它常规试
剂均为国产分析纯试剂 。
2.3.3农杆菌培养基
YEP 液体:每 1000m l加胰化蛋白胨 10g +酵
母提取物 10g +NaCl 5g , NaOH 调 PH 7.0 。
YEP 固体:每 1000m l液体 YEP +15g 琼脂
粉 , NaOH 调 PH 7.0。
2.3.4含目的基因的农杆菌质粒的鉴定
图 1中 , Chi基因和 Glu基因反向串联 , 它们
都是以 35S 为启动子 , NOS 为终止子 。
质粒的图谱为:
图 1pCG-Ⅱ质粒图谱
Figure 1 The figure of pCG-II
2.3.4.1质粒的提取
采用王关林等 (1998)的碱法小量提取方法。
2.3.4.2引物的设计及合成
参照 Shinshi (1990)的方法进行 , 设计如下
两对物:
I-Chi引物
P1 5 -GAATGAGGCTTTGTAAAT TCAC-3
P2 5 -CGTTAATTTCCAAAAGACCTCTGGT -3
I-Glu引物
P1 5 -AAATGGCTGCTACACACTCCTA-3
P2 5 -CGTCACCCAAAGTTGATATTATATTTGG-3
引物由上海生工合成。
2.3.4.3 PCR扩增及电泳分析
每 25μlPCR反应液中含:0.5lμl DNA (25 -
50ng ), 1.5μlMgCl2 , 2.5μl buffer , 2μldNTPs ,
1.5μlprimer , 16.5μlddH2O , 0.5μlTaq 酶。先在 94℃
下变性 4分钟 , 再在 94℃30秒 , 25℃30秒 , 72℃
30秒进行 5 个循环 , 然后 94℃30秒 , 58℃30秒 ,
72℃30秒中进行 30个循环 , 最后是 72℃4分钟 。
2.3.5农杆菌介导叶盘法转化外源基因
2.3.5.1卡那梯度试验
将鳞片叶分别接种在含卡那 50 、 100 、 150 、
龙牙百合的植株再生与遗传转化
The Regenera tion and T ransfo rmation of Longya Lilium
　 467　
200mg/L 的分化培养基上 , 根据出芽 、生根情况
以确定转化后卡那筛选转化植株的最佳浓度。
2.3.5.2农杆菌液的准备
挑选 pCG-II/4404的单菌落接种于 2mlYEP
(Km 100mg/L , Str 50mg/L , Rif 50mg/L)培养
基中 , 于 28℃, 200rpm 振荡培养至对数生长期 。
取 1.5ml 培养好的菌液倒入一无菌离心管中 ,
5 ,000rpm 离心 1分钟收集菌体 , 用 MS液体培养
基重悬菌体 , 5 ,000rpm 离心 1分钟再收集菌体 ,
最后用 MS液体培养基重悬菌体 , 并稀释至OD约
为 0.3-0.4。加 As 250umol/L 以活化 vir区 。
2.3.5.3叶盘法转化
在超净工作台上 , 将消毒处理的鳞片叶切成
1cm 见方的小块 , 置于最佳的诱导愈伤培养基中
25℃暗培养 15天 , 将已有浅黄色愈伤组织发生的
百合鳞片叶盘与 OD 约为 0.4 的农杆菌液共侵染
30分钟 、 60分钟 , 并轻摇培养皿 , 使叶盘与菌液
充分接触 。取出叶盘于无菌滤纸上吸去附着的菌
液 , 但不可吸干。然后接种于共培养基 (MS+2 ,
4-D2mg/L +As 250umol/ L)中 , 25℃暗培养 2
天 , 再转入选择诱导培养基 (MS+2 ,4 -D2mg/L
+Carb300mg/L +kana150mg/L )中 , 每两周继
代一次。待长出足够多的愈伤以后 , 将其转入分
化培养基 (MS+6-BA 1mg/L +NAA0.05mg/L
+Carb300mg/L+kana100mg/L)中 。当分化的幼
苗高约 2cm 时 , 便将它切下转至生根培养基 (MS
+NAA2mg/ L +kana100mg/L +Cef300mg/ L)中
诱导生根 。每次均设对照。
2.3.6基因枪转化外源基因
参照王关林等 (1998)的 SDS (Sodium dode-
cylsulfate)方法 。
2.3.7转化植株的分子检测
3 结果与分析
3.1不同培养基对愈伤组织的诱导效果的影响
不同培养基的诱导结果显示 (表 4 和图 2),
2 ,4-D比 NAA诱导愈伤效果较好 , 从图 2可知 ,
C1 、 C2 、 C3 、 C4 、 C5 的出愈率均为 100%, 2 , 4
-D 2mg/L , 加 6-BA与不加 6-BA 效果区别不
大 , 这说明在龙牙百合的愈伤诱导方面 , 2 ,4 -D
占主导地位。随着2 ,4 -D用量的减少 , 愈伤之间
间隔稍有增大的趋势 , 但不及随着 NAA 减少 , 愈
伤之间间隔加大那么明显 , 图中 , C1的出愈数和
出愈率都达到最大值。
图 2 不同培养基对诱导愈伤组织效果的影响
Figure 2 The effect of different media on the induction of calli
3.2不同培养基对不定芽的诱导及伸长效果
的影响
不同培养基的诱芽效果显示 (表 5 和图 3),
在相同的条件下 , S10上大量发生芽 , 粗壮 , 深绿
色 , 出芽数最多 , 出芽率为 100%。同样是 6-BA
与 NAA配组 , 其量不同 , 对芽分化的影响较大。
NAA 所加量越大 , 则芽子颜色越浅 。S1 、 S5 、
S10的诱导芽效果见附图 1 、 2。
图 3 不同培养基对诱导芽效果的影响
Figure 3 The effect of different media on shoot induction
3.3 不同培养基对诱导生根效率的影响
468　 　分子植物育种
Molecular Plant Breeding
表 4 不同培养基的愈伤诱导情况
Table 4 The effect o f different media on the calli induction
培养基
Media
接种日期
(月/日)
Inoculat ive date
(month/ day)
外植体
Explants
培养天数
Cultural days
出愈数
Calli formation
number
出愈率 (%)
Calli f ormation
f requency
(percentage)
表 现
Performance
C1 4/ 9 10 17 493 100 愈伤浅黄绿色 , 连成一片
C2 4/ 9 10 17 412 100 愈伤浅黄绿色 , 连成一片
C3 4/ 9 10 17 398 100 愈伤浅黄绿色 , 愈伤之间稍有隔
C4 4/ 9 10 17 313 100 愈伤浅黄绿色 , 愈伤之间稍有隔
C5 4/ 9 10 17 451 100 愈伤浅黄绿色 , 连成一片
C6 4/ 9 10 17 259 90 愈伤浅黄色 , 愈伤之间有小间隔
C7 4/ 9 10 17 207 80 愈伤浅黄色 , 愈伤之间间隔较大
C8 4/ 9 10 17 176 60 愈伤浅黄色 , 稀疏
C9 4/ 9 10 17 40 50 愈伤浅黄色 , 很稀疏
表 5 不同培养基的诱芽效果
Table 5 The effect o f different media on the regeneration of shoot
培养基
Media
接种日期
(月/日)
Inoculat ive date
(month/ day)
外植体数
Explant
number
出芽数
Shoot
formation
number
出芽率 (%)
Shoot formation
f requency
(percentage)
表 现
Performance
S 1 4/ 26 10 294 80 芽较多 , 较粗壮 , 浅绿色
S2 4/ 26 10 257 75 芽较多 , 较粗壮 , 浅绿色
S3 4/ 26 10 242 70 芽较多 , 但瘦弱 , 淡绿色
S4 4/ 26 10 201 60 芽较多 , 但瘦弱 , 黄绿色
S5 4/ 26 10 345 90 芽多 , 粗壮 , 呈深绿色
S6 4/ 26 10 254 76 芽较多 , 但瘦弱 , 黄绿色
S7 4/ 26 10 260 77 芽较多 , 但瘦弱 , 浅黄色
S8 4/ 26 10 189 65 芽较少 , 且弱小 , 浅黄色
S9 4/ 26 10 60 50 芽少 , 但壮 , 深绿色
S10 4/ 26 10 490 100 芽多 , 很粗壮 , 呈深绿色
表 6 不同培养基对生根的影响
Table 6 The effect o f defferent media on the formation o f roo ts
培养基
Media
接种日期
(月/日)
Inoculat ive date
(month/ day)
外植体数
Explant num ber
培养天数
Cultural days
根数
Root number
出根率 (%)
Root format ion
f reqrency
(percentage)
表 现
Performance
R1 4/ 12 7 50 80 100 大量生根和根原基 , 洁白、 粗壮
R2 4/ 12 7 50 21 80 生根较少 , 洁白 , 粗壮
R3 4/ 12 7 50 2 30 仅生 2条纤细根
R4 4/ 12 7 50 70 100 大量生根和根原基 , 洁白
R5 4/ 12 7 50 0 0 无根
龙牙百合的植株再生与遗传转化
The Regenera tion and T ransfo rmation of Longya Lilium
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对诱导芽效果较好的培养基以及文献上认为两
种最好的培养基继续进行生根状况比较见表 6和图
4 , 发现在相同条件下 , R1和 R4大量发生根和根原
基 , 而且根洁白 , 粗壮 , 只是 R4生根数稍少 , 其出
根率均为100%。R5根本就无根发生 , 其生根数和出
根率均为 0。这说明对于龙牙百合 , 激素 NAA诱导
生根效果非常明显 , 生长状况见附图 3 、 4。
图 4 不同培养基对诱导生根效果的影响
Figure 4 The effect of different media on the regeneration of root
3.4外植体对卡那霉素的敏感性
由于龙牙百合外植体可以在 MS+6-BA1mg/
L+NAA0.05mg/ L 上连续生长 , 不断发芽 、 长
根 , 所在只进行了一次梯度试验 , 共设 4 个卡那
霉素浓度梯度 。当培养基中加入不同浓度的卡那
霉素时 , 外植体的生长和分化受到不同程度的影
响 , 当浓度低时 , 发芽发根正常 , 当浓度为
150mg/L 时 , 发芽发根减少并呈萎缩趋势 。而当
浓度增加至 200mg/L 时 , 根本无芽和根的发生。
因此在筛选转化植株时 , 卡那霉素浓度为 150 mg/
L就足以抑制未转化细胞的生长 (表 7和图 5)。
图 5 卡那梯度试验
Figure 5 The g radient experiment of kanamycin
表 7 卡那霉素浓度对外植体生长的影响
Table 7 The effect o f kanamycin on the grow th of explant
浓度 (mg/ L)
Concentration
(mg/ L)
培养基
Media
接种时间
月/日
Inoculat ive
date (month/ day)
培养天数
Cultural days
表 现
Performance
50 S10 4/ 26 27 有芽发生 , 色深绿;有白色的根发生
100 S10 4/ 26 27 有少量芽 、 根发生 , 芽色较绿
150 S10 4/ 26 27 有极少量根芽发生 , 芽色较淡。
200 S10 4/ 26 27 无根发生 , 有的已死亡。
空白对照 S10 4/ 26 27 大量发生根芽 , 芽色深绿 , 根洁白。
3.5 质粒的鉴定
由于转化所用的载体是中国热带农业科学院生
物技术国家重点实验室已构建好的 , 在转化之前 ,
有必要对其进行鉴定。如前所述 , 提取质粒 , 设计
引物 , PCR检测结果如图 6 、 7 所示:泳道 1 为
PCR Marker , 泳道 2 为样品 , 在泳道 2 中 , 无论
是图 6 还是图 7 , 在 1.0Kb 处均有一明亮带 , 与
Chi和 Glu 基因的长度分别为 994bp 和 1011bp 的
结果相符 。证明所用基因正确 , 而且据此所设计的
两对 PCR引物也正确 , 这在后面进行的 PCR反应
中也进一步证实了这一点 。
本试验中 , PCR反应条件比较特殊:先设置较
低的退火温度 , 较少的循环数 , 然后再以较高的退
火温度 , 较多的循环数进行反应 , 前反应的产物作
为后反应的模板 , 这可以抑制非特异性条带的发生。
470　 　分子植物育种
Molecular Plant Breeding
图 6 几丁质酶基因的 PCR检测电泳图
Figure 6 The figure of PCR screening for Chi gene
图 7 β-1、 3 葡聚糖酶基因的 PCR检测电泳图
Figure 7 The figure of PCR screening for G lu gene
3.6外植体材料的预培养
本试验设计了两种处理:(1)鳞片叶预培养 17
天。(2)鳞片叶不经过预培养。结果表明 , 经过预培
养的处理在与农杆菌侵染后 , 经2天共培养 , 再在2 ,
4 -D 2mg/L+Carb300mg/ L+Kana150mg/ L 上生长
15天的抗性愈伤组织呈浅黄绿色 , 有分化芽的趋势 ,
而没有预培养的大部分死亡 , 只有少数呈浅黄色。其
原因有两个方面:一方面预培养可促进细胞分裂。另
一方面可筛选掉污染的外植体 , 而且使外植体适应培
养基的培养条件。
3.7 农杆菌转染
农杆菌侵染时菌液的浓度 、 侵染后共培养的
时间以及 AS 的使用浓度均是借鉴该实验室的经
验:农杆菌菌液的浓度采用 OD600为 0.3-0.4 、
共培养时间为 2天 、 AS的使用浓度为 250umol/ L。
从以后拟转化株的生长状况及 PCR 、 Southern 点
杂交检测结果可以证明该依据也许不是最好的 ,
但是切实可行的。
关于侵染时间 , 本试验设置了 30 分钟和 60
分钟两种处理 , 在经过两天的共培养后 , 外植体
边缘均可见农杆菌菌落 , 只是 60分钟的处理菌落
多一些 , 但在以后的生长中 , 这两种处理差别不
大 , 这可能是龙牙百合是单子叶植物 , 对农杆菌
不太敏感 。
3.8基因枪转化法
本试验在转化之前选叶片和鳞片叶两种外植体
进行17天的预培养 , 发现鳞片叶上长出的愈伤多且
致密 , 颜色为浅黄绿色 , 而从叶片上长出的愈伤少且
较松散 , 颜色稍淡 , 因此本研究以鳞片叶上长出的愈
伤为基因枪的受体材料 , 参数是:真空度 760mmHg ,
射程6cm , 靶受体直径3cm。基因枪转化法无宿主范
围的限制 , 受体类型广泛 , 可控度高 , 操作简便快
速 , 甚至可克服无菌的困难 , 免去了购买抗生素的巨
额费用 , 而且植株株型紧凑 , 叶色浓绿 , 生长健壮
(附图5 、 6), 因此更适于百合的遗传转化 , 只是其
机理尚待进一步研究。
3.9 两种转化方法的转化效率比较
选取在卡那霉素抗性培养基上生根的转化苗 ,
对农杆菌介导法 16株和基因枪法 29 株各随机抽
取 6株提取其 DNA 。以 β-1 、 3 葡聚糖酶基因设
计引物 , 对提取的 DNA 进行 PCR 检测 , 通过
PCR扩增 , 并同时设阳性对照 、阴性对照 。随机
抽取的 6棵农杆菌介导转化株中 , 有 2 棵呈阳性
反应 , 而随机抽取的 6棵基因枪转化株中 , 有 4
棵呈现阳性反应 , 如图 8:
图 8 两种转化法的拟转化株的 PCR检测电泳图
Figure 8 The figure of PCR screening for putative transformat-
ed plants
龙牙百合的植株再生与遗传转化
The Regenera tion and T ransfo rmation of Longya Lilium
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图中 , 上排为农杆菌介导法 , 下排为基因枪
转化法 , 泳道M 为 PCRM arker , CK+CK-分别
为阳性对照和阴性对照 , 泳道 1 、 2 、 3 、 4 、 5 、 6
为样品。
从图可以看出 , 农杆菌介导法中第 3 、 4个样
各有一条与阳性对照一样的 994bp的明亮带 , 基
因枪转化法中第 2 、 3 、 4 、 6 个样各有一条与阳性
对照一样的 994bp 的明亮带。初步证明采用基因
枪转化法 , 外源基因的整合率可能高一些 。对呈
阳性反应的样品继续进行 Southern点杂交 , 其结
果是农杆菌介导法中有一个样呈阳性反应 , 基因
枪转化法中有三个样呈阳性反应 。这说明外源
DNA 已整合到受体植株的基因组中 , 而且基因枪
转化法更适合龙牙百合的遗传转化 , 只是价格昂
贵。如图 9:图中 , CK-为阴性对照 , CK+为阳
性对照 , 1和 2为农杆菌介导法经 PCR检测为阳
性的样品 3 、 4;3 、 4 、 5 、 6 是基因枪法经 PCR
检测为阳性的样品 2 、 3 、 4 、 6。
图 9 Southern 点杂交示意图
Figure 9 The figure of southern do t blotting hybridization
4结论
1 、 本试验以鳞片叶为外植体 , 通过多种培养
基的比较试验 , 发现愈伤组织诱导的适宜培养基
是 MS+2 ,4-D 2mg/ L+6-BA0.2mg/L , 芽诱导
及伸长的适宜培养基为 MS +1mg/L6 -BA +
0.05mg/LNAA , 生根的最佳培养基为 MS +
NAA2mg/L。同时还发现芽诱导及伸长的适宜培
养基也适合于龙牙百合生根 , 其效果稍逊色于 MS
+NAA2mg/L。
2 、通过对 pCG -II/LBA4404进行抗生素筛
选 , 以及对质粒进行 PCR扩增 , 其结果表明该质
粒上确实含有所要的目的基因。
3 、 初步建立了根癌农杆菌转化龙芽百合的实
验程序 , 以鳞片叶为外植体 , 预培养 17 天 , 侵染
时菌液浓度为 OD600约 0.3-0.4 , 确定了选择培
养的卡那霉素适宜浓度为:150mg/L。侵染时间
为 30分钟与 60分钟对以后的脱菌效果影响不大 ,
AS 250umol/L , 共培养 2天有助于遗传转化 , 共
得到拟转化株16株 , 该法通过PCR检测及South-
ern 点杂交 , 发现外源基因已整合到染色体上 , 其
整合率为 16.7%。
4 、 本试验发现基因枪法更适合龙牙百合的遗
传转化 , 共得到拟转化株 29 株 , 经 PCR 检测及
Southern点杂交检测 , 证明外源基因也已整合到
染色体上 , 且其整合率为 50%。对于所导入基因
的遗传规律 、 系统选育等方面的工作有待于进一
步研究 。
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龙牙百合的植株再生与遗传转化
The Regenera tion and T ransfo rmation of Longya Lilium
　 473　
附图 (Additive figure):
附图 1 龙牙百合鳞片叶在不同分化培养基中生长一个
月的情况。
左:MS+6 -BA 2mg/ L , 中:MS +6 -BA 1mg/ L ,
右:MS+6-BA 1mg/ L+NAA0.05mg/ L
Additive Figure 1 The g rowth of scale leaves in different
media for 1 month.
Left:MS+6 -BA 2 mg/ L , Middle:MS +6 -BA 1
mg/ L , Right:MS+6-BA 1 mg/ L+NAA0.05mg/ L
附图 2 龙牙百合鳞片叶在不同分化芽培训基中生长 50 天
的情况。
左:MS +6 -BA 1mg/ L , 中:MS +6 -BA 1mg/ L +
NAA0.05mg/ L , 右:MS+6-BA 1 mg/ L
Additive Figure 2 The grow th of scale leaves in different shoo t
inducing media for 50 days.
Left:MS+6-BA 1mg/ L , Middle:MS+6-BA 1mg/ L+
NAA0.05mg/ L , Right:MS+6-BA 2mg/ L
附图 3 龙牙百合鳞片叶在不同生根培养基中生长 50
天的情况。
左:MS+6-BA1mg/ L , 中:MS +6 -BA1mg/ L +
NAA0.05mg/ L , 右:MS+6-BA2mg/ L
Additive Figure 3 The g rowth of scale leaves in different
root inducing media for 50 day s.
left:MS+6-BA1mg/ L , Middle:MS+6-BA1mg/ L
+NAA0.05mg/ L , Right:MS+6-BA2mg/ L
附图 4植株在 1/ 2MS+IBA0.25mg/ L和 MS+NAA2mg/ L
上的生根状况。
Additive Figure 4 The g rowth of plants in 1/2MS +
IBA0.25mg/ L and MS+NAA2mg/ l
附图 5 基因枪转化法拟转化株在 Kana150 mg/ L 上的
生根情况
Additive Figure 5 The situation of roo t formation fo r pu-
tative plants in Kana150 mg/ Lusing gene gun transfor-
ma ted method
附图 6基因枪转化法拟转化株在 Kana150 mg/ L上的生长
情况
Additive Figure 6 The g row th of putative plants in Kana150
mg/ Lusing gene gun transformated method
474　 　分子植物育种
Molecular Plant Breeding