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收稿　2000-05-29　　　　修定　2000-11-10
　 1　国家和河北省自然科学基金联合资助项目(39930230)。
百合花粉细胞中钙离子的荧光测定法1
尚忠林＊　王永飞＊　钱　洪＊＊ 　马力耕＊ 　孙大业＊(＊河北师范大学生命科学学院分子细胞研究
室 ,石家庄 050016 ;＊＊中国农业科学院蔬菜花卉研究所 ,北京 100081)
The Measurement of Calcium Fluorescence in Lily Pollen Cells
SHANG Zhong-Lin＊ , WANG Yong-Fei＊, QIAN Hong＊＊, MA Li-Geng＊, SUN Da-Ye＊(＊Laboratory of Molecular &Cell
Biology , College of Biological Science , Hebei Normal University , Shijiazhuang 050016;＊＊Institute of Vegetable &Flowers ,
Chinese Academy of Agricultural Science , Beijing 100081)
　　提要　以川百合花粉为材料 , 利用孵育法在花粉原生
质体中 ,特别是利用低温装载法在完整花粉粒中 ,成功地载
入酯化形式的钙离子荧光探针 fluo-3 AM 。利用激光共聚
焦显微技术对花粉细胞质中游离钙离子的分布特点进行研
究的结果表明 ,花粉萌发初期细胞质内游离钙离子呈极性
分布 ,萌发沟附近的钙离子浓度明显高于其他部位 ,萌发孔
附近最高 ,花粉细胞核中较低 。文中对低温装载法的可行
性进行了讨论。
　　关键词　川百合　花粉　游离钙离子　fluo-3 AM 　
激光共聚焦显微术
　　花粉细胞质中自由钙离子浓度与花粉萌发和
花粉管伸长关系密切[ 1～ 3] ,在研究花粉细胞内钙
离子的生理作用时 ,常常需要测定花粉细胞内游离
钙离子浓度 、分布特点及动态变化 ,其中将钙离子
荧光探针导入花粉细胞是实验的关键步骤 。一般
多用酯化形式的钙离子荧光探针(如 fluo-3AM),
它容易透过细胞质膜进入细胞 ,自身不发荧光 ,但
它一旦被酯酶分解成游离状态分子 ,即与 Ca2+结
合而发出荧光。多数植物细胞壁中有非特异性酯
酶 ,可使酯化的荧光探针在细胞外水解成不易透过
细胞膜的离子态而阻碍钙离子荧光探针进入花粉
细胞 。为了克服此影响 ,本文采用低温抑制酯酶的
方法取得较好结果 ,并已在花粉细胞中应用。
材料与方法
1　花粉原生质体的大量制备和纯化
　　川百合 (Lilium davidii)花粉采自兰州郊区
大田 , -75℃冰箱中干燥保存 。花粉原生质体制
备参照 Tanaka 等[ 4] 和周嫦等[ 5 ,6] 的方法 ,花粉经
1.5%纤维素酶 、1.5%果胶酶水解 3 h 后 ,以 500
r·min-1离心 5 min ,沉淀离心洗涤 2 次后再进行
15%Percoll梯度离心 ,吸取富含原生质体的界面
层 ,再用磷酸缓冲液(pH 5.8 , 0.6 mol·L-1蔗糖)
离心洗涤几次 ,以进一步纯化 。
2　原生质体 Fluo-3AM的装载及细胞质游离钙离
子的观察
　　将原生质体密度调整到 105·ml-1 ,加入 fluo-
3AM 母液[ 1 mmol·L-1 fluo-3 AM ,以无水 DMSO
(二甲基亚砜)配制]至终浓度为 4.4μmol·L-1 ,于
25℃暗中保温 4050 min后 ,用洗涤介质离心洗涤 2
次。以 2%低熔点琼脂糖(用洗涤介质配制)将原
生质体粘在载玻片上 ,然后把载玻片固定在激光共
聚焦显微镜(BIO-RAD MRC-1024 型)的载物台
上 ,以波长 488 nm 的激光连续对原生质体作光切
片扫描 ,图像文件储存于计算机中 。
3　花粉粒细胞内钙离子分布的观察
　　根据 Zhang 等[ 7] 的方法 ,对低温下将 f luo-3
AM 导入百合花粉粒进行了探索性实验 。花粉粒
用萌发介质 [ 1 mmol·L -1 KNO3 、1 mmol·L-1
Ca(NO3)2 、1 mmol· L-1 MgSO4 、1 mmol·L-1
319植物生理学通讯　第 37 卷 第 4 期 , 2001年 8月
DOI :10.13592/j.cnki.ppj.2001.04.022
H3BO3 、0.5 mol·L-1蔗糖] 水合 45 min。然后取
100μl花粉溶液 ,加入 f luo -3 AM 母液至终浓度
为 20 μmol·L-1 ,混匀后置于 4℃冷室中放置 2 h ,
取出用萌发介质离心洗涤 2次 ,于 25℃室温下静
置 1 h 。另取 100 μl花粉溶液 , 加入 f luo-3 AM 母
液至终浓度为 20 μmol·L-1 , 混匀后于 25℃室温
下静置 1 h , 用萌发介质离心洗涤 2次作为常温装
载对照 。将装载了荧光探针的花粉溶液滴于载玻
片上 , 加盖玻片 , 再将载玻片放在激光共聚焦显
微镜的载物台上 , 以波长 488 nm 的激光对花粉粒
连续进行光切片扫描 , 图像文件均储存于计算机
中。
4　花粉萌发率和花粉管长度的测定
　　经水合和低温装载的花粉 ,置于 25℃恒温培
养箱中培养 ,每隔 1 h取花粉液镜检 ,统计萌发率
和花粉管长度。计算萌发率时一般统计 300 ～ 400
粒花粉 ,测定花粉管长度时一般统计 20 ～ 30 个花
粉管。然后对未经低温处理的花粉和经过低温装
载恢复到常温后的花粉萌发率及花粉管长度进行
对比 ,绘制成图。
实验结果
1　原生质体 Fluo-3 AM的装载及细胞内游离钙离
子分布的测定
　　纯化原生质体与 fluo-3AM 混匀静置 40 min
后 ,在荧光显微镜下经蓝光激发可以发出明亮的绿
色荧光 ,表明 fluo-3 AM 已经进入原生质体 ,进一
步用激光共聚焦显微镜观察也证实荧光来自细胞
内部 。分析原生质体的激光共聚焦扫描切片 ,见到
细胞内钙离子分布是不均匀的 ,在其一端钙离子水
平较高 ,该区域内又以靠近质膜的区域细胞质内的
钙离子浓度最高 ,而其它部位的钙离子浓度相对较
低 ,细胞周缘区的荧光较弱(图 1)。这一现象可能
反映了细胞内钙离子分布的极性现象 ,钙离子浓度
高的区域往往进行着旺盛的代谢反应 。
2　花粉粒Fluo-3 AM的装载及细胞内游离钙离子
的分布测定
　　在室温中处理 1 h后 ,荧光显微镜下见到的花
粉粒的荧光非常弱 ,离心洗涤后进行共聚焦显微镜
图 1　花粉原生质体细胞质中钙离子分布图
　　花粉原生质体的连续光切片成像 , 1～ 5为花粉原生质体不同切面 ,示原生质体细胞内钙离子不均匀分布。左下角标尺代表 50μm。
图 2　花粉粒细胞质中钙离子分布图
　　1.花粉粒的透射光成像图。上部颜色较深的部分为细胞壁较厚的部分 ,下部颜色较浅的部分为细胞壁较薄的萌发沟部位 , 三角所指为
萌发孔部位。 2～ 6.花粉粒的激光共聚焦连续光切片 ,分别为花粉粒的不同切面 ,示萌发沟和萌发孔部位的强荧光。 7.萌发花粉粒的激光
共聚焦扫描图 ,示萌发沟和刚长出的花粉管中的强荧光。 8.室温装载后的花粉粒细胞 ,示花粉细胞壁上的荧光和细胞内的弱荧光。左下角
标尺代表 50μm。
观察 ,结果除了细胞壁上有一些荧光之外 ,细胞内 部几乎没有荧光(图 2-8)。表明室温下细胞壁中
320 植物生理学通讯　第 37 卷 第 4 期 , 2001年 8月
酯酶活性高 ,它能将细胞外溶液中酯化形式的荧光
探针水解为不能透过细胞膜的离子形式 ,使之无法
进入细胞内部。而在低温处理 2 h 后 ,在荧光显微
镜下可以见到花粉粒发出微弱的绿色荧光 ,此种荧
光随着温度的回升而逐渐加强 , 30 min后荧光强
度逐渐稳定 ,花粉粒成为明亮的绿色小球。这表明
低温可以明显抑制细胞外酯酶的活性 ,但对 fluo-3
AM 进入花粉粒内部则没有明显影响 。回到常温
下 ,细胞内酯酶活性升高 , 积累在细胞内的大量
lfuo-3 AM 即水解 ,形成的离子形式的 f luo-3与钙
离子结合 ,受激发光的照射后可以产生强烈的荧
光。分析花粉粒的激光共聚焦连续光切片时可以
见到 ,水合后花粉粒细胞内钙离子呈极性分布 ,萌
发沟附近的细胞质中钙离子浓度较高 ,萌发孔部位
钙离子浓度最高 , 细胞内其它部位的荧光相对较
弱 ,表明这些部位的钙离子水平相对较低。在刚萌
发的花粉粒中 ,萌发沟部位仍维持高浓度的钙离
子 ,其中以刚长出的花粉管中钙离子浓度最高(图
2-1 ～ 7)。
图 3　低温装载对花粉萌发率的影响
图 4　低温装载对花粉管伸长的影响
3　花粉萌发率和花粉管长度的测定
　　经统计比较 ,低温装载荧光探针后的花粉萌发
率和花粉管长度与正常温度下的对照差别不大 ,表
明低温和进入细胞内的指示剂并未对花粉活性造
成明显影响(图 3 、4)。
讨　　论
　　在研究细胞内钙离子浓度以及分布特点时 ,
通常使用钙离子荧光探针结合荧光分析技术 , 而
荧光探针装载是这一方法中的关键问题。在使用
酯化形式的钙离子荧光探针测定植物细胞内钙离
子时 , 常因细胞壁中酯酶水解破坏而使酯化的指
示剂无法进入细胞 。在前人的实验中 , 多采用制
备原生质体的方法以消除细胞外酯酶对钙离子荧
光探针装载的影响[ 8] , 而用花粉原生质体的报道
不多 。我们采用将酯化形式荧光探针装载入花粉
原生质体的方法 , 结果利用激光共聚焦显微技术
可以观察到花粉原生质体细胞质中游离钙离子的
极性分布 。但是制备原生质体操作技术复杂 , 耗
时费力 , 原生质体在实验过程中容易破裂 , 给测
定钙离子浓度带来许多不便 , 因为原生质体失去
细胞原有的形态特征后 , 即无法判断钙离子分布
的确切位置 , 因而很难研究钙离子与花粉萌发和
花粉管伸长的关系 。
常温下花粉细胞中装载钙离子荧光探针时 ,
经常见到花粉细胞外的溶液中有强烈的绿色荧光 ,
这表明细胞壁中的非特异性酯酶将酯化形式的钙
离子荧光探针已水解为离子形式 , 而与细胞外溶
液中钙离子结合 , 这样受激发后即发出荧光。这
种条件下的细胞内难以积累足量的 fluo-3 , 因而花
粉细胞中的荧光很弱 , 即使提高细胞外溶液中的
探针浓度或延长处理时间也无法获得满意的效果 。
1998年有人报道可采用低温条件下将酯化型钙离
子荧光探针导入植物细胞的方法[ 7] , 这一方法的
原理是:低温条件下细胞壁中的酯酶活性受抑制 ,
因而无法水解酯化型探针 , 但探针分子扩散进入
细胞内的过程受低温的影响并不大 , 它可以穿过
细胞质膜进入植物细胞内部 , 以低温处理一段时
间后 , 植物细胞内可以积累一定量的探针分子 ,
回到常温下后 , 细胞内酯酶活性即回升 , 从而将
进入胞内的探针分子水解成离子形式而与钙离子
结合 , 于是在一定波长光的激发下便发出荧光[ 7] 。
参照这一方法 , 我们于低温下将钙离子探针 f luo-3
AM 导入百合花粉粒细胞 , 结果对花粉的活力并
不造成明显影响 , 这一方法尚未见报道。我们用
这一方法在蚕豆叶片气孔保卫细胞和茎维管束薄
321植物生理学通讯　第 37 卷 第 4 期 , 2001年 8月
壁细胞以及小麦根毛细胞中也取得良好效果。这
初步表明此方法可适用于多种植物材料的钙离子
测定 。
前人多次指出 , 花粉管尖端有大量钙离子通
道分布 , 它们的开放会导致花粉管尖端的钙离子
浓度增高 , 从而在花粉管前端形成钙离子的浓度
梯度 , 这一梯度控制着花粉管伸长生长的速度和
方向[ 1 ～ 3] , 但有关花粉萌发初期细胞中钙离子分
布的情况的报道尚不多。本文在测定花粉原生质
体和花粉粒细胞中钙离子的过程中 , 见到花粉萌
发初期细胞质中游离钙离子均呈极性分布 , 花粉
粒还显示出钙离子集中分布于与萌发密切相关的
萌发沟部位 , 以萌发孔部位的钙离子浓度最高 。
这一结果进一步表明 , 钙离子有可能是控制花粉
萌发的重要因素 。我们推测花粉萌发初期细胞质
膜上钙离子通道的不均匀分布可能就已经形成 ,
这种不均匀分布的钙离子通道可能就是导致细胞
中游离钙离子呈极性分布的直接原因。
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第 26届国际种子检验协会会议简讯
　　第 26 届国际种子检验协会(International Seed Testing Association , ISTA)会议于 2001 年 6 月 14 至 22 日在法国
Angers 召开。有 76 个国家和地区的 614 名专家学者参加了会议。会议由组织委员会主席 、ISTA 第一副主席 Lefort主持 ,
法国农业和渔业部部长 Vincon P ,国际种子检验协会主席 Leist N , Angers 市市长 Antonini J-C 以及一些国际学术组织的负
责人出席了会议并讲话。我国包括台湾地区共有 6 人参加了会议。
会议由执行委员会会议(Executive Committee Meeting s) 、种子专题讨论会(Seed Symposium)和常规会议(Ordinary
Meeting)三部分组成。 ISTA 有 18个执行委员会 , 执行委员会会议主要是总结上一届的工作 ,提出本届的工作计划。种子
专题讨论会涉及(1)种子质量 、(2)收获后种子技术 、(3)种子质量评价 、(4)种子批的健康 、(5)种子发育和萌发 ,以及(6)种
子伤害和修复的机制;共有 41 个大会报告和 400 多张墙报。常规会议主要是讨论和通过 ISTA的各项议程。会议内容将
在 ISTA主办的刊物 ——— Seed Science and Technology 上发表。会议期间 , 有 24 个机构(或公司)展销了种子检验的仪器设
备和相关技术。
本次会议的特点和该领域的发展趋势有:(1)现代生物学技术如分子标记技术正用于种子检验;(2)种子的健康检查正
在加强 , ADGEN 公司已研制了植物病害诊断试剂盒;(3)遗传修饰作物(genetically modified crop)种子的检验受到极大的
关注;1999 年 IS TA 成立了遗传修饰体(genetically modified organism , GMO)特别工作组 , 研究 GMO 种子的检验技术;在本
次会议上还有 1小时的GMO特别工作组会议 、30 分钟的大会报告以及 20 余篇墙报;(4)发达国家参加会议的人数多 , 种
子检验的设备先进 ,具有完整的精准检验技术 。(中山大学生命科学学院 , 宋松泉)
322 植物生理学通讯　第 37 卷 第 4 期 , 2001年 8月