全 文 ：地耳草黄酮类成分分析及其动态研究
收稿日期:2010-10-15;修稿日期:2011-01-05
基金项目:南京中医药大学优秀科技创新团队支持计划
作者简介:韩乐(1985-),男 ,江苏南京人 ,南京中医药大学 2008级硕士研究生。 ＊通信作者:025-85811511
韩乐1 ,宋建平2 ,刘训红1＊ ,吴启南1 ,王丽娟1 ,傅兴圣1
(1.南京中医药大学药学院 , 江苏 南京　210046;2.盐城卫生职业技术学院 , 江苏 盐城　224006)
摘要:目的　探讨地耳草黄酮类成分的动态积累 , 为确定地耳草的最佳采收期提供依据。方法　采用紫外-可见分光光
度法测定不同采收时间地耳草中总黄酮的含量 , 并以其中芦丁 、异槲皮苷 、槲皮苷 、槲皮素和山柰酚为指标成分 , 采用高
效液相色谱法考察它们的动态变化。结果　不同生长期地耳草中黄酮类成分积累具有一定规律。结论　地耳草黄酮类
成分积累曲线最大峰值与传统采收期基本一致。
关键词:地耳草;黄酮类成分;动态变化
中图号:R284.1 文献标志码:A 文章编号:1000-5005(2011)02-0165-04
Component Analysis of and Dynamic Approach to Flavonoids in HerbaHyperici Japonici
HAN Le1 ,SONG Jian-ping 2 ,LIU Xun-hong1＊ ,WUQi-nan1 ,WANG Li- juan1 ,FU Xing-sheng1
(1 .S chool o f Pharmacy , Nanj ing University of Chinese Medicine , Nanj ing , 210046 ,China;2 .Yancheng health voca-
tional and technical college ,Yancheng , 210046 ,China)
ABSTRACT:OBJECTIVE　To investig ate the dynamic accumulation of flav onoids in Herba Hy perici J aponici , to pro vide
scientific ba sis for determining the best co llecting time.METHODS　Contents like , rutin , isoquercitrin , que rcitrin and quer-
cetin , kaempfero l in H erba Hype rici Japonici w ere tested by means of UV-VIS spectrum and HPLC to know the to tal a-
mount of f lavono ids o f the plants co llected in diffe rent time.RESULTS　The accumulation o f flavono ids show ed a r egula r
pa tte rn.CONCLUSION　The content o f flav onoids is the highest in the traditional harve sting time.
KEY WORDS:Herba Hyperici Japonici;flavonoids;dynamic accumulation
　　地耳草为较常用中药 ,系藤黄科植物地耳草
Hypericum japonicum Thunb.干燥全草 , 具清
热利湿 、解毒消肿之功效 ,主治湿热黄疸 、泄泻 、痢
疾 、疮痂痈肿 、急性肾炎 、血吸虫病等症 ,其注射液
已广泛用于临床 ,治疗急 、慢性肝炎 , 效果均显
著[ 1] 。现代药理研究表明 ,地耳草具有增强免疫
和抗肿瘤的作用[ 2 ] ,其主要活性成分为黄酮类化
合物 。本研究在地耳草药材品质鉴定研究的基础
上[ 3-5] ,用 UV-VIS 和 HPLC 法考察不同采收时
间地耳草中总黄酮 、芦丁 、异槲皮苷 、槲皮苷 、槲皮
素 、山柰酚含量动态变化 ,为确定药材的最佳采收
期提供科学依据 。
1　材料
754型紫外可见分光光度计(上海光学仪器
有限公司);Waters 2965高效液相色谱仪(包括:
四元泵 、自动进样器 、在线脱气装置 、柱温箱 、2996
DAD检测器),Empow er色谱工作站。
山柰酚对照品(中国药品生物制品检定所提
供 ,批号:110861-200303);槲皮素对照品(中国药
品生物制品检定所提供 ,批号:10081-9905);芦丁
对照品(中国药品生物制品检定所提供 , 批号:
0080-9705);异槲皮苷对照品(上海博蕴生物科技
有限公司 ,批号:21637-25-2),槲皮苷对照品(中
国药品生物制品检定所提供 , 批号:111538-
200302)。
乙腈(美国 TEDIA 试剂公司 ,色谱纯);甲醇
(江苏汉邦科技有限公司 ,色谱纯);甲醇(上海实
意化学试剂有限公司奥佳化工有限公司产品 ,批
号:20071018);无水乙醇(国药集团化试有限公司
产品 ,批号:20070412)。蒸馏水为自制重蒸水。
所有试剂均为分析纯 。
地耳草不同采收期(080513 ,080523 ,080603 ,
—165—南京中医药大学学报 2011 年 3 月第 27 卷第 2 期JOURNALOF N ANJING TCM UNIVERSITY Vol.27 No.2 Mar.2011
DOI :10.14148/j.issn.1672-0482.2011.02.021
080613 ,080623 , 080703 , 080713 , 080723)样品均
采自福建省尤溪县台溪乡台溪村第二洋 ,经作者
鉴定为藤黄科植物地耳草 Hypericum japoni-
cum T hunb.的全草。留样凭证存放于南京中医
药大学中药鉴定实验室。
2　方法与结果
2.1　色谱条件
色谱柱:Alltima C1 8(250×4.6 mm id , 5
μm);柱温 50 ℃;流动相:A-0.4%磷酸 , B-乙腈;
梯度洗脱:0 ～ 10 min , A∶B 为 89∶11 ,18 m in , A
∶B线性改变到 84∶16 ,18 ～ 30 min , A∶B为 84
∶16 ,35 min , A ∶B 线性改变到 77∶23 , 35 ～
40min为 77∶23 ,55 m in , A∶B线性改变到 60∶
40 ,65 min , A ∶B 线性改变到 89 ∶11;65 ～ 70
min , A∶B 为 89∶11;流速:1 mL/min;检测器:
DAD;检测波长:254 nm;进样量:10μL 。
2.2　对照品溶液制备
精密称取芦丁对照品 10.54 mg 、槲皮素对照
品 10.04 mg 和山奈酚对照品 4.90 mg ,分别置于
50 mL 量瓶中 ,用 80%甲醇溶解并定容。精密称
取异槲皮苷对照品 8.29 mg 、槲皮苷对照品 9.89
mg ,分别置于 10 mL 量瓶中 ,用 80%甲醇溶解并
定容 。制得浓度分别为芦丁 0.2108 mg/mL 、异
槲皮苷 0.829 mg/mL 、槲皮苷 0.989 mg/mL ,槲
皮素 0.200 8 mg/mL 和山奈酚 0.098 mg/mL 的
对照品储备液。精密吸取芦丁 、槲皮素 、山奈酚储
备液 6 mL ,异槲皮苷储备液 5 mL ,槲皮苷储备液
8 mL ,溶于 50 mL 容量瓶中 ,则配成混合标准品
液。精密吸取混合标准品液适量 ,逐级稀释 ,使芦
丁浓度依次为:2.530 、5.059 、7.589 、10.118 、
12.648 、25.296μg/mL ,异槲皮苷的浓度依次为:
8.29 、16.58 、24.87 、33.16 、41.45 、82.90 μg/mL ,
槲皮苷的浓度依次为:15.82 、31.65 、47.47 、
63.30 、79.12 、158.24μg/mL ,槲皮素的浓度依次
为:2.41 、4.82 、7.23 、9.64 、12.05 、24.10μg/mL ,
山奈酚的浓度依次为 1.551 、3.035 、4.986 、
6.656 、7.965 、15.51μg/mL。
2.3　供试品溶液制备
精密称取样品粉末(过 3 号筛)1.0 g ,加入
80%甲醇 50 mL ,回流 90 min ,然后补足质量 ,继
续回流90min ,补足质量 ,再回流90min ,过滤 ,滤
液用 80%甲醇定容至 100 mL 量瓶中 ,过 0.45
μm 微孔滤膜 ,作为供试品溶液。
2.4　标准曲线 、检测限与定量限
精密吸取上述不同浓度的混合标准品溶液各
10.00μL ,进样作 HPLC 分析 ,以对照品的峰面
积(Y)对相应的浓度(X)进行线性回归 ,得回归方
程 、相关系数及线性范围;以各化合物的信噪比等
于 3(S/N =3)时的相应浓度确定最低检测限
(LOD);以各化合物的信噪比等于 10(S/N =10)
时的相应浓度确定最低定量限(LOQ)。结果见
表 1。
表 1　5 种黄酮化合物的标准曲线 、检测限与定量限(μg·m L-1)
标准品 标准曲线 相关系数/ r 线性范围 LOD LOQ
芦丁 Y =42 017X+5 819.7 0.999 2 2.53 ～ 25.30 0.230 0.767
异槲皮苷 Y=178 721X+22 553.0 0.999 4 8.29 ～ 82.90 0.754 2.512
槲皮苷 Y=457 060X+52 195.0 0.999 4 15.82 ～ 158.24 1.438 4.794
槲皮素 Y =83 803X+6 961.3 0.999 6 2.41 ～ 24.10 0.219 0.730
山奈酚 Y =36 226X+4 128.4 0.999 4 1.55 ～ 15.51 0.141 0.470
2.5　系统适用性试验
色谱柱理论板数:在选定的条件下注入混合
标准品液 ,按 n=5.54(tR/Wh / 2)2分别计算色谱
柱理论板数 n。 tR为保留时间 ,Wh / 2为半峰高宽。
分离度:在选定的条件下 , 注入混合标准品
液 ,按 R=2(tR2 -tR1)/(W1 +W2)分别计算分离
度 R。 tR2为相邻的 2 个峰中后一个峰的保留时
间 , tR1为相邻的 2个峰中前一个峰的保留时间;
W1 ,W2为相邻的 2个峰的峰宽。
结果表明 ,分离度均大于 1.5 , 达到相关要
求。结果见表 2 ,图 1。
表 2　系统适用性试验结果
标准品 保留时间/min 理论板数 分离度
芦丁 23.536 8 915.79 -
异槲皮苷 25.081 5 588.01 1.800
槲皮苷 33.425 24 907.79 6.463
槲皮素 44.206 12 445.61 8.350
山奈酚 51.886 105 376.74 5.948
—166— 南京中医药大学学报 2011年 3 月第 27 卷第 2 期
图 1　混合标准品液的 HPLC-DAD 图谱
1.芦丁;2.异槲皮苷;3.槲皮苷;4.槲皮素;5.山奈酚
2.6　方法学考察
精密度试验:取一定浓度的混合标准品液 ,
重复进样 6次 ,每次 10.00μL 。各标准品平均峰
面积 RSD 为:芦丁 1.21%,异槲皮苷 0.88%,槲
皮苷 0.82%,槲皮素 0.71%,山奈酚 0.93%。表
明仪器精密度良好。
稳定性试验:取地耳草(080513)样品供试液
10.00μL ,分别在 0 、1 、2 、4 、8 、12 h 进样 6次 ,5种
黄酮类成分平均峰面积 RSD 为:芦丁 0.87%, 异
槲皮苷 0.24%, 槲皮苷 0.38%,槲皮素 0.89%,
山奈酚 2.38%。
重复性试验:精密称取地耳草(080513)样品
6份 ,每份 1.0 g ,分别按供试品液制备方法制成
供试液 ,取 20.00 μL 进样测定 , 5种黄酮类成分
平均峰面积 RSD 为:芦丁 0.87%, 异槲皮苷
0.24%,槲皮苷 0.38%,槲皮素 0.89%, 山奈酚
2.38%。
加样回收率试验:取已知含量的地耳草
(080513)样品 1.0(6份),精密称定 ,分别精密加
入不同量的芦丁 、异槲皮苷 、槲皮苷 、槲皮素及山
奈酚对照品 ,按供试品溶液制备方法制备加样回
收供试品溶液 ,并按样品测定方法进行测定 ,计算
回收率 。芦丁平均回收率为 97.9%, RSD 为
1.96%;异槲皮苷平均回收率为 99.2%,RSD 为
1.17%;槲皮苷平均回收率为 96.3%, RSD 为
1.39%;槲皮素平均回收率为 98.7%, RSD 为
1.27%;山奈酚平均回收率为 97.6%, RSD 为
4.01%。
2.7　样品测定
精密吸取供试品溶液 10.00μL ,注入液相色
谱仪 ,按上述色谱条件 ,采用外标法进行测定 。根
据相应线性关系计算样品含量。结果见图 2 ,表
3。
图 2　地耳草样品液的 H PLC-DAD 图谱
1.芦丁;2.异槲皮苷;3.槲皮苷;4.槲皮素;5.山奈酚
表 3　不同物候期地耳草中黄酮类成分分析结果(mg/g)
采集时间 芦丁 异槲皮苷 槲皮苷 槲皮素 山奈酚
080513 0.199 4.798 7.299 1.206 0.295
080523 - 7.947 3.291 2.820 0.317
080603 0.105 3.924 8.481 2.154 0.365
080613 - 3.100 8.203 2.432 0.530
080623 - 6.272 12.901 2.792 0.935
080703 - 6.340 12.677 1.584 0.300
080713 - 6.219 9.455 0.853 0.156
080723 - 6.996 8.239 0.727 0.944
　　　　　　　　　　　　　注:“ -”表示未检出。
—167—韩乐 ,等:地耳草黄酮类成分分析及其动态研究　第 2 期
3　讨论
3.1　实验条件的优选
3.1.1　色谱条件的优化
色谱柱的选择:选用 Allt ima C18(150 mm ×
4.6mm id ,5μm)和 Allt ima C8(250 mm×4.6 mm
id ,5μm)2种反相柱做对比试验 ,结果表明 ,Allti-
ma C18柱(250 mm ×4.6 mm id ,5 μm)柱效较高 ,
分离效果好 ,确定以此柱作为试验用柱 。
洗脱条件的选择:流动相的组成 ,选择试验了
乙腈-甲醇 、乙腈-0.4%磷酸 ,试验结果表明 ,后者
对峰的分离较好 ,减少拖尾现象;洗脱梯度条件则
是经过多次反复试验摸索而确定。
柱温与流速的选择:流速与柱温对分离度 、峰
形也有一定影响 。实验选择 30 ℃、40 ℃、50 ℃的
不同柱温和 0.8 mL/min 、1 mL/min2 种流速 ,试
验结果表明 ,50 ℃的柱温 、1 mL/min 的流速 ,可使
色谱峰得到最好的分离效果。
3.1.2　供试品制备的优化
提取方法的选择:以芦丁 、异槲皮苷 、槲皮
苷 、槲皮素 、山奈酚的总含量为指标 ,比较回流法
与超声提取法 ,试验结果表明 ,回流法提取的总含
量高于超声提取法的含量 ,故选择直接回流法制
备供试品 。
提取溶剂的选择:以芦丁 、异槲皮苷 、槲皮苷 、
槲皮素 、山奈酚的总含量为指标 ,比较 60%甲醇 、
70%甲醇 、80%甲醇 、95%甲醇等不同提取溶剂 ,
试验结果表明 ,以 80%甲醇提取 , 4种黄酮总含量
最高 ,确定 80%甲醇为提取溶剂 。
提取条件的优选:选择溶剂用量 、提取时间 、
提取次数 3个因素 ,每个因素选择 3个水平 ,设定
因素水平表 ,进行正交试验 ,确定上述提取条件。
3.2　黄酮类成分分析及其动态变化
1)不同物候期地耳草总黄酮积累呈现规律性
变化 ,以 6月底进入高峰期 , 7月份含量达到最高
期 ,此时期 ,地耳草植物生长已进入果期 ,说明其
总黄酮的积累 ,主要受其植物内部自身生长发育
规律的制约 ,生态因素对其可能也有一定影响。
2)不同物候期黄酮类成分分析结果显示 ,异
槲皮苷以 7月下旬含量较高 ,槲皮苷与槲皮素以
6 、7月含量较高 ,山奈酚含量以 6 月下旬较高 ,芦
丁含量极低 , 5月下旬及 6月上旬左右几乎没有 ,
动态变化不明显;异槲皮苷 、槲皮苷 、槲皮素及山
奈酚的总量以 6月下旬至 7月上旬较高。不同物
候期地耳草中异槲皮苷∶槲皮苷∶槲皮素∶山奈
酚的比值变化明显 。
3)综合上述分析结果 ,地耳草黄酮类成分积
累曲线最大峰值与传统采收期基本一致。结合地
耳草挥发性成分积累动态分析结果[ 6 ] ,初步认为
6 、7月份为适宜采收期。
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MS 分析及其动态研究[ J] .质谱学报 , 2010 , 31(4):142-
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(编辑:李伟东)
·征订·
《南京中医药大学学报(社会科学版)》 　1999 年创刊(季刊),由江苏省教育厅主管 、南京中医药大学主办 , 国内外公
开发行。设有中医文化 、哲学 、史学 、文献研究 、人物 、教育研究等专栏 , 刊登中医文化 、哲学 、经济 、中医学史 、中医文献 、
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