全 文 ：第2 9卷第2 期
2 仪肠 年4 月
水 产 学 报
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文章编号 : l 州幻 一 06 1 5 ( 2 0 5) 02 一 01 6 一 07
坛紫菜人工色素突变体的诱变与分离
严兴洪 , , 梁志强` , 宋武林“ , 黄 健“ , 马 平“ , 有贺佑滕“
l(
. 卜海水产大学 , 农业部水产种质资源与养殖生态重点开放实验室 , 上海高校水产养殖学 E 一 研究院 , 土海 2( 联从卜
2
. 福建省水产技术推广总站 , 福建 福州 3 5川川3 ; 3 . 东京农业大学 , 东京 , 1豁 一 8 52 0 日本 )
摘要 :坛紫菜叶状体经一定剂量的团 C O 一 丫射线辐射再培养 一段时间后 , 出现 r 少量色素体颜色发生变异的细
胞 ,它们呈点状无规则地镶嵌在野生型细胞中 。 培养 3 周后 , 色素变异细胞分裂并形成 了不同颜色的细胞块 ,
其颜色呈桔红 、桔黄 、浅黄褐 、浅红 、 紫红 、紫褐 、黄绿 、绿色等 在辐射剂量 。 一 1 1田 吻 范围内 , 叶状体 L色素
变异细胞块的出现频率随着辐射剂量的增加而增加 ;但辐射剂量增至 1 4川 ) G y 时 , 色素变异细胞块出现的频
率反而下降 ,说明 1 l o G y 是合适的辐射剂量 。 在同一个叶状体的不同部位上色素变异细胞块出现的频率是
小同的 , 从基部到稍部 , 随着部位的上移而逐渐增加 用酶解法把含色素变异细胞的叫状体细胞单个分离出
来并进行离体培养 , 在它们的再生体中 , 出现了多种单色的色素突变叶状体 , 从中分离到 tan (红褐色 ) 、 加: (深
桔红色 ) 、 。动 (紫红色 ) 、 舫n( 枯草色 ) 、 。、 (深黄绿色 )等不同颜色的纯色突变体 。 从各单色突变体中分离出来
的丝状体 , 其颜色与各自的叶状体相同 。 各突变体的丝状体成熟后 , 放散的壳饱 子长成 单色的 F . 叶状体 , 其
颜色与各自最初的母体叶状体相同 ,说明所得到的上述突变体是稳定的色素突变体
关键词 : 坛紫菜 ;叶状体 ; 单离细胞 ; 以℃o 一 丫射线 ;变异 ; 色素突变体
中图分类号 : 5 9 17 文献标识码 : A
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u e it o n a n d i s o la it o n o f a rt iif c i a l P l gm e n at t i o n m u at n t s i n
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收稿 日期 : 2{ x) `一邝一 16
资助项目 : }阅家高科技研究发展计划 ( l弘拭, 计划 )资助项 目 ( Zo Z A A。 )3〔)2 3 ;) 国家自然科学基金资助项 目 ( 3 0 17 07 料 )浏 海市教育委员
会 E一研究院建设项 口 ( D 后渊 因 ) ; 上海水产 大学校长基金项 日 (2 0 101 )
作者简介 : 严 兴洪 ( l(, 泌 一 ) . 男 ,浙江义 乌人 , 教授 ,博士生导师 , 主要从事藻类生物技术和遗传育种研究 E 一 m ial : x hy aJ I @ s h fo . ed 。 . c n
2 期 严兴洪等 :坛紫菜人工色素突变体的诱变与分离
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目前 ,在我国被大规模养殖的紫菜有坛紫菜
和条斑紫菜 。 坛紫菜主要在福建 ,浙江等三个南
方省份被广泛养殖 , 条斑紫菜则主要被养殖在江
苏和山东二省 。 坛紫菜养殖产量 占全国紫菜产量
的 7 0% 左右 。
紫菜含 3 种主要的光合色素 , 即叶绿素 a , 藻
红蛋 白和藻蓝蛋自 (。 其口十状体的色彩主要 由这三
种色素的含量和它们之间的比例来决定 。 商品紫
菜饼的质量好坏也主要取决于这 3 种色素的含量
高低 [’ 一 ;`〕。 所以 ,研究紫菜色素突变体不仅对它
的遗传学 ,生理学 , 生物技术等基础研究很重要 ,
而 且对诱变育种和改 良养殖品种都具重大意义 。
日前 , 国内外研究紫菜突变体的工作主要集中在
条斑紫菜 。 日本在上世纪 70 年代获得 了条斑紫
菜的不同自然色素突变体川 。 他们利用色素突变
体 , 开展 了一系列的条斑紫菜遗传学和生理学研
究 ,其中最大的研究成果之一是 阐明了条斑紫菜
减数分裂的确切发生位置是在壳抱子萌发的第一
和第二次分裂时期 尸 3 、 。 这一有重要学术价值的发
现极大地推动了条斑紫菜遗传学 和育 种学 的发
展 ( ) 根据这 一发现 ,他们把得到的条斑紫菜不 同
自然色素突变体进行相互杂交获得 了新的良种品
系 ` , ) 、 ) 随后 ,各国研究者相继利用诱变剂试图获
得紫菜人工色素突变体 , 但未能有效地分离 出突
变株 7 , “ 。 使用最强烈的诱变剂进行处理也只获
得了极少量的紫菜突变体网 。 90 年代开始 , 经过
近 卜年的研究 , 条斑紫菜的大量有用 人工色素突
变体和其它变异体被分离出来 “` 一 ’ “ 〕。
卜世纪 7() 年代 ,对坛紫菜的基本生物学 , 生
活史 , 全人工采苗 , 自山丝状体采苗和养殖技术进
行 了大狱的研究 ”` ,州 ;但对坛紫菜 的遗传规律认
识极少 ,坛紫菜的品种选育工作几乎没有开展过 。
近几年 ,我们在获得条斑紫菜人工色素突变体和
育种研究成功的基础上 , 开展 r 坛紫菜的人工色
素突变体和育种研究 , 现将部分研究结果报告如
下。
1 材料和方法
1
.
1 坛紫菜叶状体培养
本试验 所用材料 为野生 型坛紫菜 ( oP 甲梅。
加而leI o i.、 c h an g et hZ en g ) , 采 自福建平谭岛 自然
岩礁上 , 19 1 年建立纯系 , 株名为 盯 一 0 1 , 以 自
由丝状体形式被保存在实验室内 。
取一定量 的 自由丝状体 , 用小型粉碎机将其
切碎后 ,撒人事先 已洗干净的贝壳表面上 ,使之移
植到 贝壳 内 。 培养温度为 20 士 1℃ , 光照密度 5
:如 o L · m 一 2 · S 一 ` , 明暗周期 12 L : 12 D 。 培 养 10 d
后 ,第 1 次清洗贝壳 ,除去附在贝壳表面上的多余
自由丝状体 ,换进新鲜培养液 ,把光照密度提高到
20 拜m o L
·
m
一 2 · s 一 ` , 其它培养条件不 变 。 培养数
周后 , 当整个贝壳表面内层长满紫红色丝状体时 ,
把培养温度提高到 2 5 土 1℃ , 2 周后 ,再把温度提
高到 2 9 士 0 . 5℃ , 同时 , 把光照密度降到 10 1如 O .L
m
一 2 · s 一 ’ , 明暗周期为 10 :L 14 D 。 数周后 , 当贝壳
表面长 出一层膨大藻丝时 , 把 1 一 2 个贝壳放人
5 0
1 l l L 的烧杯中冲气培养 , 另外 , 放人 长度为 3 -
4 c m 的尼龙单丝 4 一 6 根供壳袍子附着 , 培养温
度 25 士 1℃ ,光照密度 40 1如 O .L m 一 “ · S 一 ’ 把已附
着一定数量壳抱子的尼龙单丝移到另一个冲气培
养瓶 内培 养 , 培 养温 度 25 士 1℃ , 光照 密 度 朋
f如 o .L m 一 “ · s 一 ’ 。 当叶状体体长达 3 一 5 c m 时 , 把
它们从尼龙单丝上摘下 ,继续冲气培养 ,培养温度
2 5 士 1℃ ,光照密度 80 一 10 矛如 oL · m 一 “ · S 一 ’ 〔、
1
.
2 诱变处理和突变体分离
培养 3 0 一 4() d 后 , 选择健康的叶状体 (体长
约 5 c m )用于人工诱变处理 。 诱变处理采用 以七。
一 y 射线 照 射 , 辐射剂量 分别为 2 0 , 5 0 八;侧 ) ,
1 0
,
1 月减洲) G y 。 经辐照过的坛紫菜叶状体 ,在黑
暗条件下培养 24 h 后 ,进人正常光照培养 。 培养
2 一 3 周后 ,每组随机取 3 棵叶状体进行色素变异
细胞块统计 ,从叶状体的稍部到基部每隔 2 c m 检
查 :30 个视野 ( x 2 0) 内的色素变异细胞块数 。 辐
射处理后 ,再培 养 巧 d 左右 , 挑 出含色素发生变
异的叶状体 ,用于酶解分离单个变异细胞 ,进行再
生培养脚〕 : 培养 3 周后 ,从细胞再生体中挑选 出
单色变异体进行单株培养 。 当变异体达到 1 c m
左右时 ,再把它们移到 5 0 1l l L 的培养瓶内进行冲
气培养 。 培养温度 25 士 1℃ , 光照密度 阴 I加 o .L
m
一 “ · s 一 ` 当叶状体长到一 定大小时 , 利用单性
生殖 , 获得纯种丝状体 。 培养温度 23 士 l ℃ , 光照
密度 40 拼m o L · m 一 “ · S 一 ’ , 明暗周期 12 L : 12 D 。 培
养 3 个月后 , 光照密度降至 10 ,加 O L · m 一 “ · s 一 ` , 以
水 产 学 报 9 2卷
长期保存突变体的丝状体 。 本试验使用的培养液
均为 MES培养基「 ] 2。
2结果
2
.
1诱变和色素变异
经不同剂量 的 下射线照射后 , 均导致 了坛紫
菜叶状体细胞的部分死亡 。 照射后培养 1 周 , 细
胞颜色变淡 ,但随着培养时间的延长 , 一部分颜色
变淡的细胞又慢慢地恢复正常颜色 , 开始细胞分
裂 ;但一部分细胞一直保持很淡的色彩 ,不分裂也
不死亡 ;还有一部分细胞则完全失去颜色而死亡 。
辐射后再培养 l 周左右 , 坛紫菜叶状体上出现了
少数色素发生明显变异的细胞 , 随着培养时间的
延长 ,变异细胞逐渐分裂并形成 不同颜色的色素
变异细胞块 。 如图版 1所示 , 色素变异细胞块 与
野生型细胞有较清晰的界限 , 借助显微镜很容易
把它们区分开来 。 如表 1 所示 , 变异细胞块 的主
要颜色有桔红 、桔黄 、 紫红 、 红紫 、 黄绿 、浅绿 、紫褐
和灰褐色等 。 桔红色变异细胞块 出现频率最高 ,
其次是桔黄色细胞块 , 绿色细胞块较低 ,灰色细胞
块最低 (表 1 ) 。 对照组叶状体上未出现色素变异
细胞块 ,而辐射组的叶状体上均出现 了色素变异
细胞块 ,这说明色素变异细胞块是 由 于仪℃o 一 丫射
线辐射诱导引起的 。 如图 1 所示 ,在 。 一 1 l o G y
范 围内 ,色素变异细胞块出现的频率 ,随着诱变剂
量的增加而增加 ,而诱变剂量超过 了 1 l o yG 后 ,
则出现了相反 的情况 , 随着诱变剂量的增加 ,变异
细胞块数量反而减少 ,这说明 1 10 吻 是诱 一异坛紫
菜叶状体产生色素体变异的合适剂量 。 如图 2 所
示 ,在同一 棵叶状体上 ,不同部位的细胞诱变效果
不 同 , 从基部到稍部 , 随着藻体部位的 上移 , 色素
变异细胞块出现的频率越来越高 。
表 1 坛紫菜叶状体经 丫·射线辐射再培养 28 d 后出现的色素变异细胞块的种类和数目
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色素突变细胞块的种类和数 目
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图 l 经不同剂量的 7 一 射线辐射后 , 坛紫菜叶状体 上
出现的色素变异细胞块数量 (培养 2 8d)
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图 2 经 卜射线辐射再培养 28 d 后 ,坛紫菜叶状体 上
不同部位出现的色素变异细胞块的数量
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补 ayr i n e u lt l l℃ o f 2 8 d a y s
2期 严兴洪等 :坛紫菜人_ L 色素突变体的诱变 与分离
2
.
2色素突变体分离
把含色素变异细胞的 上述各组叶状诊利用酶
解法获得大量的的单个细胞 ,后者经过 2 一 3 个月
的体外培养 ,单个 的变异细胞再生成 多种颜色的
色素变异体 , 其种类有桔红 、 桔黄 、 红紫 、 黄绿 、 浅
绿 、 紫褐等 , 变异体的颜色种类基本上 与母体叶状
体 卜观察到的色素变异细胞种类一致 。 所获得的
色素变异体绝大 部分是单色 , 少部分为多种颜 色
镶嵌 的嵌合体 。 单色 色素变异体其颜色相 当稳
定 , 当把它们再次酶解 ,分离出单个体细胞进行再
生培养 , 其再生体的颜 色仍然是单色并与母体的
颜色相同 , 可见其颜色是稳定的 。 图版 1 所示 为
获得的 5种 主要色素突变体的体细胞再生体 。 参
照色名字典 ~洲 ,它们分别被命名为 t an (红褐色 ) 、
l)(
:
(深桔红色 ) 、 ce b( 紫红色 ) 、 h on (枯草色 ) 、 。 ac
(深黄绿色 ) , 如表 2 所示 。
表 2 坛紫菜野生型和 5 种色素突变体的颜色和命名
T ab
.
2 C ol o sr a n d l l a ll l e s of n ve iP gl
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全}_褐色突变体 ,“ n 七an 初 d i劝 b or 、 。
深个,`i乡l色突变体 l)` , r b u m t o r an g e d跳 o r an g e
紫红色突变体 二` j) e h e叮 b一。 m pi n k
丰,11叮L色突 变体 }“ , , , hon e y p a l e y e l l o w ihs b or wn
深黄绿色突变体 `丫, e e鱿 t u s d u一1 y e一l o w g r e e n
2
.
3 色素突变体 F , 叶状体培养观察
利用坛紫菜的单性生殖 , 从各单色突变体分
离到的纯种丝状体 ,其颜色与各 自的叶状体相同 。
单色突变体的丝状体分别被移植 到贝壳内 , 长成
贝壳丝状体 。 经过 4 个月左右 的培养 , 各色素突
变体的贝壳丝状体逐渐成熟 , 放出壳抱子 , 后者经
过 2 个月的冲气培养 , 长成 F I 大叶状体 。 每种单
色突变体的 F , 叶状体均为一种颜色 的纯色叶状
体 , 其颜色 与各 自的母体叶一状体相同 , 说明所得到
的单色突变体是稳定的色素突变体 。
3 讨沦
至今 , 在紫菜人工色素突变体的研究中 ,作为
诱变剂被使用过 的主要有化学诱变剂 , 如秋水仙
素 , EM s , MN G 等
一
7一 ” · ` ’ , 2` · ’ “ , 以 及物理诱变剂 ,
如紫外线和 补射线 L ’ {), ’吕」。 在条斑紫菜人工色素
突变体的诱导和分离中 , 被证明最有效的诱变剂
是化学诱变剂— M NN G ,利用它大量有用的色素突变 体被分 离出来 [ “` , ’ 3 , ’ 5 一 `7 。 本 试验使用
以℃o 一 y射线辐射诱导野生型坛紫菜紫菜叶状体产
生突变 , 获得 r 较好 的效果 , 获得的色素变异细
胞 ,在种类和数量上 , 与 M N N G 又寸坛紫菜叶状体
的诱变相 比 , 效 果差 不多 2 4 { 〔 ) 在 诱变剂量 。 -
1 10 yG 范围内 , 虽然色素变异细胞 出现的频率
随着诱变剂量 的增加而增加 , 但死亡 细胞的增加
并不明显 ,绝大部份的细胞是活的 , 只有极少量的
细胞颜色变淡 ,细胞分裂很慢 ,并且细胞体积明显
比正常分裂 的细胞大 。 这说明 , 低于 1 10 G y 的
辐射剂量 ,无法大童地杀死坛紫菜叶状体细胞 ,但
也可产生较多的色素变异细胞 。 当辐射射剂量达
到 l 刁栩 ) G y 时 , 出现了较多的死亡细胞 ,死亡率还
没有达到一半 , 而色素变异细胞出现 的频率却比
1 10 御 组低 。 这一结果明显不同于使用 M N刊G
诱导条斑紫菜和坛紫菜紫菜叶状体产生色素变异
时 ,死亡率达到 50 % 左右 , 才能获得最 大的变异
率 ” 料 。 经 以℃o 一丫射线辐射处理后的坛紫菜叶状
体 ,再培养 1周左右 ,叶状体上出现 了单个的色素
体颜色发生明显变异的细胞 。 随着培养时间的延
长 ,色素变异细胞逐渐分裂并形成不同颜色的细
胞块 。 单个细胞块内的细胞其颜 色 ,大小和结构
相 同 , 因此 , 可以认为每一个色素变异细胞块基本
上都是 由一个最初的色素变异细胞分裂而来 的 ,
色素变异细胞块的频率基本代表辐射处理后产生
的色素变异细胞的频率 。 此外 , 还出现了另一 类
色素变异细胞 ,它们不形成色素变异细胞块 , 而是
色素变异细胞与野生型细胞或其它变异细胞呈点
状嵌合排列 ,但这类变异细胞在种类 和数量上明
显比可以形成色素变异细胞块 的变异细胞 少得
多 。 它们多数由一种色素变异细胞和野生型细胞
组成 ,有时也有二种色素变异细胞和野生型细胞
组成 。 由 M N N G 处理获得的条斑紫菜人 工色素
变异变体中 ,也有色素变异细胞呈点状嵌合排列
的色素变异体 , 它们被认为是不稳定变异体超〕
本文得到不同颜色的色素变异细胞无规则排列的
坛紫菜嵌合色素变异体是否属于不稳定的变异体
有待进一步证明 。
在叶状体的不同部位上 ,色素变异细胞块出
现的频率不同 ,稍部出现 的频率最大 , 中部次之 ,
基部最小 。 推测其可能 的原因 : 坛紫菜叶状体虽
然是散生长 ,但叶状体各部位的颜色 ,细胞大小和
1 7 ) (水 产 学 报9 2卷
藻体厚度存在明显的差异 。 日龄小的坛紫菜紫菜
叶状体 一般是稍部的颜色明显 比其它部位偏红而
鲜艳 , 中部 的颜色 又比基部鲜艳 ; 细胞大小 : 稍部
< 中部 < 基部 ; 藻体厚度 : 稍部 < 中部 < 基部 。 山
此可 见 ,坛紫菜叶状体的稍部分生细胞最多 ,细胞
分裂和牛长最旺盛 ;其次是 中部和基部的生长相
对迟缓 。 所以 , 叶状体稍部处寸1分裂时期的嫩细
胞较 多 , 老化细胞较 少 ; 中部 的嫩细胞 又比基部
多 〔 处十分裂的嫩细胞 比老化 细胞 更容易被诱
变 这样就可以解释为什么同一个计卜状体 L各部
位的色索变 异细胞频率不同的现象
把含色素变异细胞的坛紫菜紫菜叶状体酶解
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获得 单离细 胞 , 后者经过 2 一 3 个月的体外培 养 , 歌、 :、
再生成野生型叶状体和多种颜色的色素突变体
所获得的色素突变体绝大部分是单色 , 少部分为 ` l、
多种颜色镶 嵌的嵌合体 此外还获得 了细长型形
态突变体 , 叶状体边缘尤刺突变体等 , 其结果将在 ,:
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