全 文 ：第 30 卷第 5 期 大 连 海 洋 大 学 学 报 Vol． 30 No． 5
2 0 1 5年 1 0月 JOUＲNAL OF DALIAN OCEAN UNIVEＲSITY Oct ． 2 0 1 5
DOI:10． 16535 / j． cnki． dlhyxb． 2015． 05． 007 文章编号:2095－1388(2015)05－0489－05
纳米 TiO2 和 Cu(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)对小球藻
和新月菱形藻的毒性研究
胡冰1，王华1，张冬冬1，于春艳2，刘恒明3
(1. 大连海洋大学 水产与生命学院 辽宁省贝类良种繁育工程技术研究中心，辽宁 大连 116023;2. 国家海洋环境监测中心，辽
宁 大连 116023;3. 大连海洋大学 海洋科技与环境学院，辽宁 大连 116023)
摘要:为了研究纳米材料和重金属对水生生物的毒性作用，采用水生毒理学试验方法，考察了 TiO2纳米
颗粒、重金属Cu(Ⅱ)和Zn(Ⅱ)对小球藻 Chlorella sp. 和新月菱形藻 Nitzschia closterium的毒性。单一毒性试
验结果表明，纳米 TiO2对小球藻和新月菱形藻 96 h EC50分别为 11. 655、13. 693 mg /L，Cu(Ⅱ)对小球藻和
新月菱形藻的 96 h EC50分别为 10. 197、10. 033 mg /L，Zn(Ⅱ)对小球藻和新月菱形藻的 96 h EC50分别为
11. 330、13. 583 mg /L。联合毒性试验结果表明，TiO2 +Cu(Ⅱ)、TiO2 +Zn(Ⅱ)对两种微藻的联合效应 EC50
值均随暴露时间的延长而减小，TiO2 +Cu(Ⅱ)和 TiO2 +Zn(Ⅱ)对小球藻的 96 h EC50分别为 9. 287、11. 084
mg /L，对新月菱形藻的 96 h EC50分别为 10. 632、12. 954 mg /L。按照水生毒理学联合效应的相加指数法评
价 TiO2 +Cu(Ⅱ)、TiO2 +Zn(Ⅱ)的联合毒性效应，可知纳米 TiO2分别和Cu(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)对小球藻和新月菱
形藻的联合毒性效应均表现为拮抗作用。
关键词:纳米 TiO2;Cu(Ⅱ) ;Zn(Ⅱ) ;小球藻;新月菱形藻;毒性
中图分类号:S949 文献标志码:A
纳米科技的迅猛发展，推动了纳米材料在医
药、化工、环保等领域的应用［1］。其中，纳米
TiO2具有良好的热稳定性、耐化学腐蚀性、光催化
特性和防紫外线功能，成为目前应用最广泛的纳米
半导体材料之一。但是，纳米 TiO2在生产和使用
过程中可能出现流失，并随着水的环境循环进入到
水域生态系统中，对水生生物产生一定的毒害作
用［2］。目前，纳米 TiO2对水生生物的生态毒理学
效应已逐渐引起人们的关注。有研究表明:纳米
TiO2作用于蛋白核小球藻 Chlorella pyrenoidesa 时，
由于 TiO2极高的比表面积，可以吸附其他污染物
并具有运载其进入生物体内的能力，导致其毒性增
加［3］;纳米 TiO2还能促进藻细胞内超氧自由基的
产生，抑制 SOD、CAT 等抗氧化酶系的抗氧化能
力，并对藻类的光合速率和呼吸速率产生影响［4］。
近年来，沿海地区经济和工业的迅速发展，有
毒重金属元素随工农业废水排放进入水环境，部分
近岸海域重金属污染状况日益严重。海洋生态系统
中的重金属污染可以引起生态系统中各级生物的不
良反应，甚至危害生态系统中各类生物的生存［5］。
Zn和 Cu是藻类生长所必须的微量元素，但高浓度
Zn能导致细胞膜通透性增加并引起细胞形态变
异［6］，高浓度 Cu是一种典型的细胞抑制剂［7］。
微藻是水生生态系统中最重要的初级生产者，
微藻的种群结构可以影响水域生态系统的物质循环
和能量流动［8］。关于单一毒物对微藻的毒性作用
已有较多研究［9］，但在实际的水环境中，微藻可
能受到多种毒物的共同作用。当纳米材料与重金属
污染物在水环境中共存时，可能对微藻产生联合毒
性作用，但目前有关纳米材料与重金属共存对海洋
微藻联合毒性作用的研究较少。本研究中，以小球
藻 Chlorella sp. 和新月菱形藻 Nitzschia closterium为
受试生物，选择 TiO2纳米颗粒、重金属Cu(Ⅱ)和
Zn(Ⅱ)作为毒物，考察不同浓度 TiO2纳米颗粒、
重金属Cu(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)的单一急性毒性，以及
TiO2纳米颗粒和Cu(Ⅱ)、TiO2纳米颗粒和Zn(Ⅱ)
收稿日期:2014－12－09
基金项目:辽宁省自然科学基金资助项目 (2014020149)
作者简介:胡冰 (1990—) ，男，硕士研究生。E－mail:872268519@ qq. com
通信作者:王华 (1973—) ，男，博士，副教授。E－mail:wanghua@ dlou. edu. cn
对小球藻和新月菱形藻的联合毒性，研究结果可为
纳米材料的环境安全性评价提供参考资料。
1 材料与方法
1. 1 材料
小球藻 Chlorella sp. 和新月菱形藻 Nitzschia
closterium由大连海洋大学藻种间提供。
纳米 TiO2 (P25，Degussa) ，含量 ＞ 99. 5%，
粒径约为 20 nm，混晶型。CuSO4 · 5H2 O 和
ZnSO4·7H2O 均为分析纯 (国药集团化学试剂有
限公司)。
1. 2 方法
1. 2. 1 试验液的配制 纳米 TiO2、Cu(Ⅱ)和
Zn(Ⅱ)的储备液均用超纯水配制而成，浓度均为 1
g /L，使用时稀释至试验所需浓度。试验用海水为
经沙滤的大连市黑石礁近岸表层海水，盐度为 30，
pH为 8. 0，煮沸后使用。本试验中所用自然海水
中Cu(Ⅱ)的本底值为 0. 16 μg /L，Zn(Ⅱ)的本底
值为 0. 28 μg /L。
1. 2. 2 微藻培养 将处于指数生长期的小球藻与
新月菱形藻接种到含有康威营养盐［10］的海水中，
培养温度为 (20 ±1)℃，明暗周期为 12 h ∶ 12 h，
光照强度约为 3000 lx，每天摇瓶 3 次。小球藻起
始密度约为 1×106 cells /mL，新月菱形藻起始密度
约为 2×105 cells /mL。
1. 2. 3 纳米 TiO2、Cu(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)的单一毒性
试验 参照微型 (单细胞)藻类毒性试验方法［11］，
采用 96 h EC50 (引起 50%微藻生长被抑制的毒物
浓度)作为评价指标。在预试验基础上，将纳米
TiO2、Cu(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)的浓度均设为 3. 0、6. 0、
9. 0、12. 0、15. 0 mg /L，空白对照组不加任何毒
物，每个试验组设置 3 个平行。自接种之日起每隔
24 h取样一次，用血球计数板计数，记录 96 h 的
微藻生长情况。
采用 SPSS 19. 0 软件通过概率单位法［12］计算
出各个毒物的 EC50值，通过单因素方差分析法
(ANOVA)对 3 种毒物的 EC50数据进行分析，显著
性水平设为 0. 05。
1. 2. 4 纳米 TiO2 +Cu(Ⅱ)、TiO2 +Zn(Ⅱ)的联合
毒性试验 对纳米 TiO2和重金属的联合毒性评定
采用 Marking相加指数 AI (Additive index)法［11］。
以纳米 TiO2、Cu(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)的单一急性毒性试
验为基础，按 TiO2和Cu(Ⅱ)以及 TiO2和Zn(Ⅱ)浓
度比均为 1 ∶1 接种藻液，进行联合毒性试验。每隔
24 h取样计数。
用 SPSS 19. 0 软件的 Probit 过程计算出 TiO2 +
Cu(Ⅱ)、TiO2 + Zn(Ⅱ)对两种海洋微藻的 EC50。
计算公式为
M=am /a1 +bm /b1。
其中:M实际联合毒性生物学作用之和;a1和 b1分
别为纳米 TiO2和重金属Cu(Ⅱ)或Zn(Ⅱ)单独暴露
时的毒性;am和 bm分别为纳米 TiO2和重金属混合
暴露下，溶液达到相同毒性时纳米 TiO2和重金属
的浓度。将 M转换为纳米 TiO2和重金属联合毒性
的相加指数 AI，当 M≤1 时，AI=1 /M－1;当 M≥1
时，AI=1－M。通过 AI可以确定纳米 TiO2和重金属
联合毒性的作用类型，当 AI= 0 时，纳米 TiO2和重
金属联合毒性为加和作用;当 AI＞0 时，纳米 TiO2
和重金属联合毒性作用为协同作用，AI 加 1 即为
混合物的毒性增大系数;当 AI ＜0 时，表示纳米
TiO2和重金属联合毒性作用为拮抗作用，AI减 1 后
绝对值的倒数即为混合毒物的毒性增大系数。
2 结果与讨论
2. 1 纳米 TiO2、Cu(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)对小球藻和新
月菱形藻的单一毒性
图 1 为纳米 TiO2、Cu(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)对小球藻
24 h至 96 h 的 EC50。从图 1 可见，3 种毒物对小
球藻的 EC50均随着暴露时间的延长而降低。在 24
h和 48 h 时，纳米 TiO2对小球藻的 EC50显著高于
Cu(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)的 EC50 (P＜0. 05) ，说明在本试
验条件下 48 h内，重金属Cu(Ⅱ)和Zn(Ⅱ)的毒性
强于 纳 米 TiO2;但 在 72 h 时，纳 米 TiO2、
Cu(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)对小球藻的 EC50值相近，三者的
毒性无显著性差异 (P＞0. 05) ;到 96 h 时，纳米
TiO2和Zn(Ⅱ)对小球藻的 EC50值相近，两者的毒
性无显著性差异 (P＞0. 05) ，但二者对小球藻的
EC50值显著高于Cu(Ⅱ)对小球藻的 EC50值 (P ＜
0. 05) ，说明在此时间点上Cu(Ⅱ)的毒性强于纳米
TiO2和Zn(Ⅱ)。由图 1 还可知，从 48 h 至 72 h，
纳米 TiO2对小球藻的 EC50值下降极为显著，表明
纳米 TiO2对小球藻的毒性作用在 48 h 后表现更为
突出。
图 2 为纳米 TiO2、Cu(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)对新月菱
形藻在 24 h至 96 h 的 EC50。从图 2 可见，3 种毒
物对新月菱形藻的 EC50均随着时间的延长而略有
下降。在 24 h时，3 种毒物对新月菱形藻的毒性强
094 大 连 海 洋 大 学 学 报 第 30 卷
弱顺序依次为Cu(Ⅱ)＞Zn(Ⅱ)＞纳米 TiO2，3 种毒
物对新月菱形藻的毒性有显著性差异 (P＜0. 05) ;
在 48 h时，3 种毒物对新月菱形藻的毒性强弱顺序
与 24 h 时相同，3 种毒物的毒性有显著性差异
(P＜ 0. 05) ;在 72 h 和 96 h 时，纳米 TiO2、
Zn(Ⅱ)对新月菱形藻的毒性无显著性差异 (P ＜
0. 05) ，但Cu(Ⅱ)对新月菱形藻的毒性明显强于纳
米 TiO2和Zn(Ⅱ) (P＜0. 05)。
注:标有不同小写字母表示同一时间下不同溶液组间有显著性
差异 (P＜0. 05) ，标有相同小写字母者表示不同溶液组间无显
著性差异 (P＞0. 05) ，下同
Note:The means with different letters in different solution are signif-
icant differences at the 0. 05 probability level in the same time，and
the means with the same letters in different solution are not significant
differences，et sequentia
图 1 纳米 TiO2、Cu(Ⅱ)和Zn(Ⅱ)对小球藻的 EC50
Fig. 1 EC50 of TiO2 nanoparticles，Cu (Ⅱ)and
Zn(Ⅱ)to Chlorella sp.
图 2 纳米 TiO2、Cu(Ⅱ)和Zn(Ⅱ)对新月菱形藻的
EC50
Fig. 2 EC50 of TiO2 nanoparticles， Cu(Ⅱ) and
Zn(Ⅱ)to Nitzschia closterium
此外，由图 1 和图 2 还可知，纳米 TiO2对小球
藻和新月菱形藻 24 h EC50分别为 45. 843、17. 591
mg /L，48 h EC50分别为 39. 973、17. 457 mg /L，72
h EC50分别为 11. 793、13. 406 mg /L，96 h EC50分
别为 11. 655、13. 693 mg /L。以上结果表明，在 24
h、48 h，纳米 TiO2对新月菱形藻的毒性强于对小
球藻;但在 72 h、96 h，纳米 TiO2对小球藻的毒性
强于对新月菱形藻。张宁等［13］研究发现，纳米
TiO2 (粒径为 20 ～ 35 nm)对小球藻 Chlorella sp. 、
中肋骨条藻 Skeletonemaceae costatum、微囊藻 Micro-
cystis sp. 、斜生栅藻 Scenedesmus obliquus、莱茵衣
藻 Chlamydomonas reinhardi 的 72 h EC50为 10 ～ 26
mg /L，毒性表现为叶绿素 a 和可溶性蛋白质含量
下降，脂质氢过氧化物含量积累。朱小山等［14］研
究发现，纳米 TiO2 (粒径为 20 nm，锐钛矿型)对
斜生栅藻的 96 h EC50为 15. 262 mg /L。Hund－Ｒinke
等［15］研究了纳米 TiO2对近具刺链带藻 Desmodesmus
subspicatus 的毒性，结果表明，6 h EC50 为 14
mg /L。Wang等［16］研究表明，纳米 TiO2 (平均粒
径为 21 nm)浓度≥ 10 mg /L 时会抑制衣藻
Chlamydomonas sp. 的生长。本试验研究结果基本
与上述研究结果相类似。
Cu(Ⅱ)和Zn(Ⅱ)是工业发达地区近岸海域海
水中常见的重金属污染物。Cu(Ⅱ)和Zn(Ⅱ)对牟
氏角毛藻 Chaetoceros muelleri［17］、三角褐指藻 Phae-
odactylum tricornutum［18］、栅藻 Scenedesmus sp. ［19］
的毒性顺序均为Cu(Ⅱ)＞ Zn(Ⅱ)。在本试验中，
对两种海洋微藻的毒性强弱顺序也均为Cu(Ⅱ)＞
Zn(Ⅱ) ，与已有的研究报道一致。
2. 2 纳米 TiO2 +Cu(Ⅱ)、纳米 TiO2 +Zn(Ⅱ)对
小球藻和新月菱形藻的联合毒性效应
表 1 为 TiO2 +Cu(Ⅱ)、TiO2+Zn(Ⅱ)对小球藻
和新月菱形藻联合毒性的 EC50。从表 1 可见，
TiO2+Cu(Ⅱ)、TiO2+Zn(Ⅱ)对小球藻的 96 h EC50
分别为 9. 287、11. 084 mg /L，对新月菱形藻的 96
h EC50分别为 10. 632、12. 954 mg /L。对小球藻和
新月菱形藻的联合毒性强弱顺序均为 TiO2 +
Cu(Ⅱ)＞TiO2+Zn(Ⅱ)。这可能是由于纳米 TiO2粒
径小，有高的表面活性、表面能和比表面积，对
Cu(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)具有一定的吸附能力［20］，而
Cu(Ⅱ)对海洋微藻的毒性强于Zn(Ⅱ) ，导致TiO2+
Cu(Ⅱ)的联合毒性强于 TiO2 +Zn(Ⅱ)。同时，在
96 h 内，新月菱形藻对 TiO2 + Cu(Ⅱ)或 TiO2 +
Zn(Ⅱ)联合毒性的耐受能力均强于小球藻，这可
能与不同微藻种类对联合毒物的耐受能力不同有
关。从表 1 还可知，TiO2 +Cu(Ⅱ)、TiO2 +Zn(Ⅱ)
的联合效应 EC50值随暴露时间的延长而减小，但
减小的幅度低于单独 TiO2对两种海洋微藻 EC50值
随暴露时间的延长而下降的幅度。
纳米 TiO2在水中易于吸附其他污染物，使其
对水生生物的毒性发生变化［21－22］。Hartmann 等［23］
研究发现，粒径为 30 nm的 TiO2能快速吸附水中的
194第 5 期 胡冰，等:纳米 TiO2 和 Cu(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)对小球藻和新月菱形藻的毒性研究
表 1 TiO2+Cu(Ⅱ)、TiO2+Zn(Ⅱ)对小球藻和新月菱形藻的 EC50
Tab. 1 Joint EC50 of TiO2+Cu(Ⅱ)and TiO2+Zn(Ⅱ)to Chlorella sp. and Nitzschia closterium mg /L
微藻 microalgae 溶液 solution 24 h EC50 48 h EC50 72 h EC50 96 h EC50
小球藻 Chlorella sp.
TiO2 +Cu(Ⅱ)
TiO2 +Zn(Ⅱ)
12. 156
12. 920
11. 661
12. 833
10. 213
11. 846
9. 287
11. 084
新月菱形藻 Nitzschia closterium
TiO2 +Cu(Ⅱ)
TiO2 +Zn(Ⅱ)
13. 364
15. 723
12. 952
15. 583
11. 053
13. 334
10. 632
12. 954
Cd(Ⅱ) ，并增加对绿藻生长的抑制，说明Cd(Ⅱ)
有效浓度的减少不一定意味着重金属的毒性减弱。
但是，辛元元［9］研究发现，纳米 TiO2与重金属
Cd(Ⅱ)共存时，因其可吸附水中的Cd(Ⅱ) ，从而
降低了对绿藻的毒性。本研究中运用 Marking 相加
指数法求得纳米 TiO2和重金属联合毒性的相加指
数 AI，结果见表 2。由于纳米 TiO2和重金属联合毒
性的 AI 值均为负数，可见 TiO2 +Cu(Ⅱ)、TiO2 +
Zn(Ⅱ)对小球藻和新月菱形藻 24 h至 96 h 的联合
毒性效应均为拮抗作用，即 TiO2 +Cu(Ⅱ)和 TiO2 +
Zn(Ⅱ)对海水中小球藻或新月菱形藻的毒性效应，
均小于它们分别单独作用所产生的毒性效应。本研
究表明，纳米 TiO2和重金属离子共同存在于海水
中时，对两种海洋微藻的毒性作用会有所降低。
表 2 TiO2+Cu(Ⅱ)、TiO2+Zn(Ⅱ)对小球藻和新月菱形藻的联合毒性相加指数 AI
Tab. 2 Joint AI values of TiO2+Cu(Ⅱ)and TiO2+Zn(Ⅱ)to Chlorella sp. and Nitzschia closterium
微藻 microalgae 溶液 solution
相加指数 AI joint additive AI values
24 h 48 h 72 h 96 h
小球藻 Chlorella sp.
TiO2 +Cu(Ⅱ)
TiO2 +Zn(Ⅱ)
－0. 168
－0. 191
－0. 309
－0. 322
－0. 737
－0. 952
－0. 708
－0. 912
新月菱形藻 Nitzschia closterium
TiO2 +Cu(Ⅱ)
TiO2 +Zn(Ⅱ)
－0. 770
－0. 926
－0. 752
－1. 005
－0. 884
－0. 948
－0. 853
－0. 920
表 3 为 TiO2 +Cu(Ⅱ)、TiO2 +Zn(Ⅱ)对小球藻
和新月菱形藻联合毒性的增大系数。根据相加指数
与毒性增大系数的关系，96 h 时，TiO2 +Cu(Ⅱ)、
TiO2 +Zn(Ⅱ)混合物的毒性增大倍数均约为 0. 5。
范传刚［24］研究发现，纳米 TiO2与 Cd对大肠杆菌的
抗氧化酶、蛋白质和 DNA 均有毒性作用，而二者
的联合作用低于二者毒性的相加作用，表现为拮抗
作用。但是，田冰心等［25］研究则发现，纳米 TiO2
(1 mg /L)与菲、芘的联合作用表现出比单一污染
物更大的毒性作用;Zhu 等［26］研究表明，纳米
TiO2和三丁基锡的相互作用会对鲍鱼胚胎表现出更
大的毒性效应，两者表现为协同作用。由此可见，
对于纳米 TiO2的环境生态效应不应只关注其本身
的毒性，而应关注纳米 TiO2与环境污染物共同作
用的结果，这更能反映纳米 TiO2的环境暴露风险。
表 3 TiO2+Cu(Ⅱ)、TiO2+Zn(Ⅱ)对小球藻和新月菱形藻联合毒性的增大系数
Tab. 3 Joint augmentation coefficient of TiO2+Cu(Ⅱ)and TiO2+Zn(Ⅱ)to Chlorella sp. and Nitzschia closterium
微藻 microalgae 溶液 solution
增大系数 joint augmentation coefficient
24 h 48 h 72 h 96 h
小球藻 Chlorella sp.
TiO2 +Cu(Ⅱ)
TiO2 +Zn(Ⅱ)
0. 856
0. 840
0. 764
0. 756
0. 576
0. 512
0. 585
0. 523
新月菱形藻 Nitzschia closterium
TiO2 +Cu(Ⅱ)
TiO2 +Zn(Ⅱ)
0. 565
0. 519
0. 571
0. 499
0. 531
0. 513
0. 540
0. 521
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Toxicity of TiO2 nanoparticles，Cu(Ⅱ)and Zn(Ⅱ)to
Chlorella sp． and Nitzschia closterium
HU Bing1，WANG Hua1，ZHANG Dong－dong1，YU Chun－yan2，LIU Heng－ming3
(1． Engineering Ｒesearch Center of Shellfish Culture and Breeding in Liaoning Province，College of Fisheries and Life Science，Dalian Ocean Universi-
ty，Dalian 116023，China;2． National Marine Environmental Monitoring Center，Dalian 116023，China;3． College of Marine Science and Envi-
ronment，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China)
Abstract:The toxicity of TiO2 nanoparticles and Cu(Ⅱ) ，Zn(Ⅱ)on Chlorella sp． and Nitzschia closterium was
investigated using the aquatic toxicology method． The one way－toxicity test showed that the 96 h EC50 value of TiO2
nanoparticles was 11． 655 mg /L for Chlorella sp． and 13． 693 mg /L for Nitzschia closterium． The 96 h EC50 value of
Cu(Ⅱ)was 10． 197 mg /L for Chlorella sp． and 10． 330 mg /L for Nitzschia closterium，and the 96 h EC50 value of
Zn(Ⅱ)was 11． 033 mg /L for Chlorella sp． and 13． 583 mg /L for Nitzschia closterium． The EC50 of joint toxic effect
of TiO2+Cu(Ⅱ)and TiO2+Zn(Ⅱ)was decreased with elapse of the experiment． The 96 h EC50 value of TiO2 +
Cu(Ⅱ)and TiO2+Zn(Ⅱ)on Chlorella sp． was 9． 287 mg /L and 11． 084 mg /L，respectively． For Nitzschia clos-
terium，the 96 h EC50 value of TiO2+ Cu(Ⅱ)and TiO2+ Zn(Ⅱ)was 10． 632 mg /L and 12． 954 mg /L，respec-
tively． The additive index method releaved that the joint toxicity of TiO2+Cu(Ⅱ)and TiO2+Zn(Ⅱ)on Chlorella
sp． and Nitzschia closterium both were antagonism．
Key words:TiO2 nanoparticle;Cu(Ⅱ) ;Zn(Ⅱ) ;Chlorella sp．;Nitzschia closterium;toxicity
394第 5 期 胡冰，等:纳米 TiO2 和 Cu(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)对小球藻和新月菱形藻的毒性研究