全 文 :第 30 卷第 5 期 大 连 海 洋 大 学 学 报 Vol. 30 No. 5
2 0 1 5年 1 0月 JOURNAL OF DALIAN OCEAN UNIVERSITY Oct . 2 0 1 5
DOI:10. 16535 / j. cnki. dlhyxb. 2015. 05. 007 文章编号:2095-1388(2015)05-0489-05
纳米 TiO2 和 Cu(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)对小球藻
和新月菱形藻的毒性研究
胡冰1,王华1,张冬冬1,于春艳2,刘恒明3
(1. 大连海洋大学 水产与生命学院 辽宁省贝类良种繁育工程技术研究中心,辽宁 大连 116023;2. 国家海洋环境监测中心,辽
宁 大连 116023;3. 大连海洋大学 海洋科技与环境学院,辽宁 大连 116023)
摘要:为了研究纳米材料和重金属对水生生物的毒性作用,采用水生毒理学试验方法,考察了 TiO2纳米
颗粒、重金属Cu(Ⅱ)和Zn(Ⅱ)对小球藻 Chlorella sp. 和新月菱形藻 Nitzschia closterium的毒性。单一毒性试
验结果表明,纳米 TiO2对小球藻和新月菱形藻 96 h EC50分别为 11. 655、13. 693 mg /L,Cu(Ⅱ)对小球藻和
新月菱形藻的 96 h EC50分别为 10. 197、10. 033 mg /L,Zn(Ⅱ)对小球藻和新月菱形藻的 96 h EC50分别为
11. 330、13. 583 mg /L。联合毒性试验结果表明,TiO2 +Cu(Ⅱ)、TiO2 +Zn(Ⅱ)对两种微藻的联合效应 EC50
值均随暴露时间的延长而减小,TiO2 +Cu(Ⅱ)和 TiO2 +Zn(Ⅱ)对小球藻的 96 h EC50分别为 9. 287、11. 084
mg /L,对新月菱形藻的 96 h EC50分别为 10. 632、12. 954 mg /L。按照水生毒理学联合效应的相加指数法评
价 TiO2 +Cu(Ⅱ)、TiO2 +Zn(Ⅱ)的联合毒性效应,可知纳米 TiO2分别和Cu(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)对小球藻和新月菱
形藻的联合毒性效应均表现为拮抗作用。
关键词:纳米 TiO2;Cu(Ⅱ) ;Zn(Ⅱ) ;小球藻;新月菱形藻;毒性
中图分类号:S949 文献标志码:A
纳米科技的迅猛发展,推动了纳米材料在医
药、化工、环保等领域的应用[1]。其中,纳米
TiO2具有良好的热稳定性、耐化学腐蚀性、光催化
特性和防紫外线功能,成为目前应用最广泛的纳米
半导体材料之一。但是,纳米 TiO2在生产和使用
过程中可能出现流失,并随着水的环境循环进入到
水域生态系统中,对水生生物产生一定的毒害作
用[2]。目前,纳米 TiO2对水生生物的生态毒理学
效应已逐渐引起人们的关注。有研究表明:纳米
TiO2作用于蛋白核小球藻 Chlorella pyrenoidesa 时,
由于 TiO2极高的比表面积,可以吸附其他污染物
并具有运载其进入生物体内的能力,导致其毒性增
加[3];纳米 TiO2还能促进藻细胞内超氧自由基的
产生,抑制 SOD、CAT 等抗氧化酶系的抗氧化能
力,并对藻类的光合速率和呼吸速率产生影响[4]。
近年来,沿海地区经济和工业的迅速发展,有
毒重金属元素随工农业废水排放进入水环境,部分
近岸海域重金属污染状况日益严重。海洋生态系统
中的重金属污染可以引起生态系统中各级生物的不
良反应,甚至危害生态系统中各类生物的生存[5]。
Zn和 Cu是藻类生长所必须的微量元素,但高浓度
Zn能导致细胞膜通透性增加并引起细胞形态变
异[6],高浓度 Cu是一种典型的细胞抑制剂[7]。
微藻是水生生态系统中最重要的初级生产者,
微藻的种群结构可以影响水域生态系统的物质循环
和能量流动[8]。关于单一毒物对微藻的毒性作用
已有较多研究[9],但在实际的水环境中,微藻可
能受到多种毒物的共同作用。当纳米材料与重金属
污染物在水环境中共存时,可能对微藻产生联合毒
性作用,但目前有关纳米材料与重金属共存对海洋
微藻联合毒性作用的研究较少。本研究中,以小球
藻 Chlorella sp. 和新月菱形藻 Nitzschia closterium为
受试生物,选择 TiO2纳米颗粒、重金属Cu(Ⅱ)和
Zn(Ⅱ)作为毒物,考察不同浓度 TiO2纳米颗粒、
重金属Cu(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)的单一急性毒性,以及
TiO2纳米颗粒和Cu(Ⅱ)、TiO2纳米颗粒和Zn(Ⅱ)
收稿日期:2014-12-09
基金项目:辽宁省自然科学基金资助项目 (2014020149)
作者简介:胡冰 (1990—) ,男,硕士研究生。E-mail:872268519@ qq. com
通信作者:王华 (1973—) ,男,博士,副教授。E-mail:wanghua@ dlou. edu. cn
对小球藻和新月菱形藻的联合毒性,研究结果可为
纳米材料的环境安全性评价提供参考资料。
1 材料与方法
1. 1 材料
小球藻 Chlorella sp. 和新月菱形藻 Nitzschia
closterium由大连海洋大学藻种间提供。
纳米 TiO2 (P25,Degussa) ,含量 > 99. 5%,
粒径约为 20 nm,混晶型。CuSO4 · 5H2 O 和
ZnSO4·7H2O 均为分析纯 (国药集团化学试剂有
限公司)。
1. 2 方法
1. 2. 1 试验液的配制 纳米 TiO2、Cu(Ⅱ)和
Zn(Ⅱ)的储备液均用超纯水配制而成,浓度均为 1
g /L,使用时稀释至试验所需浓度。试验用海水为
经沙滤的大连市黑石礁近岸表层海水,盐度为 30,
pH为 8. 0,煮沸后使用。本试验中所用自然海水
中Cu(Ⅱ)的本底值为 0. 16 μg /L,Zn(Ⅱ)的本底
值为 0. 28 μg /L。
1. 2. 2 微藻培养 将处于指数生长期的小球藻与
新月菱形藻接种到含有康威营养盐[10]的海水中,
培养温度为 (20 ±1)℃,明暗周期为 12 h ∶ 12 h,
光照强度约为 3000 lx,每天摇瓶 3 次。小球藻起
始密度约为 1×106 cells /mL,新月菱形藻起始密度
约为 2×105 cells /mL。
1. 2. 3 纳米 TiO2、Cu(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)的单一毒性
试验 参照微型 (单细胞)藻类毒性试验方法[11],
采用 96 h EC50 (引起 50%微藻生长被抑制的毒物
浓度)作为评价指标。在预试验基础上,将纳米
TiO2、Cu(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)的浓度均设为 3. 0、6. 0、
9. 0、12. 0、15. 0 mg /L,空白对照组不加任何毒
物,每个试验组设置 3 个平行。自接种之日起每隔
24 h取样一次,用血球计数板计数,记录 96 h 的
微藻生长情况。
采用 SPSS 19. 0 软件通过概率单位法[12]计算
出各个毒物的 EC50值,通过单因素方差分析法
(ANOVA)对 3 种毒物的 EC50数据进行分析,显著
性水平设为 0. 05。
1. 2. 4 纳米 TiO2 +Cu(Ⅱ)、TiO2 +Zn(Ⅱ)的联合
毒性试验 对纳米 TiO2和重金属的联合毒性评定
采用 Marking相加指数 AI (Additive index)法[11]。
以纳米 TiO2、Cu(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)的单一急性毒性试
验为基础,按 TiO2和Cu(Ⅱ)以及 TiO2和Zn(Ⅱ)浓
度比均为 1 ∶1 接种藻液,进行联合毒性试验。每隔
24 h取样计数。
用 SPSS 19. 0 软件的 Probit 过程计算出 TiO2 +
Cu(Ⅱ)、TiO2 + Zn(Ⅱ)对两种海洋微藻的 EC50。
计算公式为
M=am /a1 +bm /b1。
其中:M实际联合毒性生物学作用之和;a1和 b1分
别为纳米 TiO2和重金属Cu(Ⅱ)或Zn(Ⅱ)单独暴露
时的毒性;am和 bm分别为纳米 TiO2和重金属混合
暴露下,溶液达到相同毒性时纳米 TiO2和重金属
的浓度。将 M转换为纳米 TiO2和重金属联合毒性
的相加指数 AI,当 M≤1 时,AI=1 /M-1;当 M≥1
时,AI=1-M。通过 AI可以确定纳米 TiO2和重金属
联合毒性的作用类型,当 AI= 0 时,纳米 TiO2和重
金属联合毒性为加和作用;当 AI>0 时,纳米 TiO2
和重金属联合毒性作用为协同作用,AI 加 1 即为
混合物的毒性增大系数;当 AI <0 时,表示纳米
TiO2和重金属联合毒性作用为拮抗作用,AI减 1 后
绝对值的倒数即为混合毒物的毒性增大系数。
2 结果与讨论
2. 1 纳米 TiO2、Cu(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)对小球藻和新
月菱形藻的单一毒性
图 1 为纳米 TiO2、Cu(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)对小球藻
24 h至 96 h 的 EC50。从图 1 可见,3 种毒物对小
球藻的 EC50均随着暴露时间的延长而降低。在 24
h和 48 h 时,纳米 TiO2对小球藻的 EC50显著高于
Cu(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)的 EC50 (P<0. 05) ,说明在本试
验条件下 48 h内,重金属Cu(Ⅱ)和Zn(Ⅱ)的毒性
强于 纳 米 TiO2;但 在 72 h 时,纳 米 TiO2、
Cu(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)对小球藻的 EC50值相近,三者的
毒性无显著性差异 (P>0. 05) ;到 96 h 时,纳米
TiO2和Zn(Ⅱ)对小球藻的 EC50值相近,两者的毒
性无显著性差异 (P>0. 05) ,但二者对小球藻的
EC50值显著高于Cu(Ⅱ)对小球藻的 EC50值 (P <
0. 05) ,说明在此时间点上Cu(Ⅱ)的毒性强于纳米
TiO2和Zn(Ⅱ)。由图 1 还可知,从 48 h 至 72 h,
纳米 TiO2对小球藻的 EC50值下降极为显著,表明
纳米 TiO2对小球藻的毒性作用在 48 h 后表现更为
突出。
图 2 为纳米 TiO2、Cu(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)对新月菱
形藻在 24 h至 96 h 的 EC50。从图 2 可见,3 种毒
物对新月菱形藻的 EC50均随着时间的延长而略有
下降。在 24 h时,3 种毒物对新月菱形藻的毒性强
094 大 连 海 洋 大 学 学 报 第 30 卷
弱顺序依次为Cu(Ⅱ)>Zn(Ⅱ)>纳米 TiO2,3 种毒
物对新月菱形藻的毒性有显著性差异 (P<0. 05) ;
在 48 h时,3 种毒物对新月菱形藻的毒性强弱顺序
与 24 h 时相同,3 种毒物的毒性有显著性差异
(P< 0. 05) ;在 72 h 和 96 h 时,纳米 TiO2、
Zn(Ⅱ)对新月菱形藻的毒性无显著性差异 (P <
0. 05) ,但Cu(Ⅱ)对新月菱形藻的毒性明显强于纳
米 TiO2和Zn(Ⅱ) (P<0. 05)。
注:标有不同小写字母表示同一时间下不同溶液组间有显著性
差异 (P<0. 05) ,标有相同小写字母者表示不同溶液组间无显
著性差异 (P>0. 05) ,下同
Note:The means with different letters in different solution are signif-
icant differences at the 0. 05 probability level in the same time,and
the means with the same letters in different solution are not significant
differences,et sequentia
图 1 纳米 TiO2、Cu(Ⅱ)和Zn(Ⅱ)对小球藻的 EC50
Fig. 1 EC50 of TiO2 nanoparticles,Cu (Ⅱ)and
Zn(Ⅱ)to Chlorella sp.
图 2 纳米 TiO2、Cu(Ⅱ)和Zn(Ⅱ)对新月菱形藻的
EC50
Fig. 2 EC50 of TiO2 nanoparticles, Cu(Ⅱ) and
Zn(Ⅱ)to Nitzschia closterium
此外,由图 1 和图 2 还可知,纳米 TiO2对小球
藻和新月菱形藻 24 h EC50分别为 45. 843、17. 591
mg /L,48 h EC50分别为 39. 973、17. 457 mg /L,72
h EC50分别为 11. 793、13. 406 mg /L,96 h EC50分
别为 11. 655、13. 693 mg /L。以上结果表明,在 24
h、48 h,纳米 TiO2对新月菱形藻的毒性强于对小
球藻;但在 72 h、96 h,纳米 TiO2对小球藻的毒性
强于对新月菱形藻。张宁等[13]研究发现,纳米
TiO2 (粒径为 20 ~ 35 nm)对小球藻 Chlorella sp. 、
中肋骨条藻 Skeletonemaceae costatum、微囊藻 Micro-
cystis sp. 、斜生栅藻 Scenedesmus obliquus、莱茵衣
藻 Chlamydomonas reinhardi 的 72 h EC50为 10 ~ 26
mg /L,毒性表现为叶绿素 a 和可溶性蛋白质含量
下降,脂质氢过氧化物含量积累。朱小山等[14]研
究发现,纳米 TiO2 (粒径为 20 nm,锐钛矿型)对
斜生栅藻的 96 h EC50为 15. 262 mg /L。Hund-Rinke
等[15]研究了纳米 TiO2对近具刺链带藻 Desmodesmus
subspicatus 的毒性,结果表明,6 h EC50 为 14
mg /L。Wang等[16]研究表明,纳米 TiO2 (平均粒
径为 21 nm)浓度≥ 10 mg /L 时会抑制衣藻
Chlamydomonas sp. 的生长。本试验研究结果基本
与上述研究结果相类似。
Cu(Ⅱ)和Zn(Ⅱ)是工业发达地区近岸海域海
水中常见的重金属污染物。Cu(Ⅱ)和Zn(Ⅱ)对牟
氏角毛藻 Chaetoceros muelleri[17]、三角褐指藻 Phae-
odactylum tricornutum[18]、栅藻 Scenedesmus sp. [19]
的毒性顺序均为Cu(Ⅱ)> Zn(Ⅱ)。在本试验中,
对两种海洋微藻的毒性强弱顺序也均为Cu(Ⅱ)>
Zn(Ⅱ) ,与已有的研究报道一致。
2. 2 纳米 TiO2 +Cu(Ⅱ)、纳米 TiO2 +Zn(Ⅱ)对
小球藻和新月菱形藻的联合毒性效应
表 1 为 TiO2 +Cu(Ⅱ)、TiO2+Zn(Ⅱ)对小球藻
和新月菱形藻联合毒性的 EC50。从表 1 可见,
TiO2+Cu(Ⅱ)、TiO2+Zn(Ⅱ)对小球藻的 96 h EC50
分别为 9. 287、11. 084 mg /L,对新月菱形藻的 96
h EC50分别为 10. 632、12. 954 mg /L。对小球藻和
新月菱形藻的联合毒性强弱顺序均为 TiO2 +
Cu(Ⅱ)>TiO2+Zn(Ⅱ)。这可能是由于纳米 TiO2粒
径小,有高的表面活性、表面能和比表面积,对
Cu(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)具有一定的吸附能力[20],而
Cu(Ⅱ)对海洋微藻的毒性强于Zn(Ⅱ) ,导致TiO2+
Cu(Ⅱ)的联合毒性强于 TiO2 +Zn(Ⅱ)。同时,在
96 h 内,新月菱形藻对 TiO2 + Cu(Ⅱ)或 TiO2 +
Zn(Ⅱ)联合毒性的耐受能力均强于小球藻,这可
能与不同微藻种类对联合毒物的耐受能力不同有
关。从表 1 还可知,TiO2 +Cu(Ⅱ)、TiO2 +Zn(Ⅱ)
的联合效应 EC50值随暴露时间的延长而减小,但
减小的幅度低于单独 TiO2对两种海洋微藻 EC50值
随暴露时间的延长而下降的幅度。
纳米 TiO2在水中易于吸附其他污染物,使其
对水生生物的毒性发生变化[21-22]。Hartmann 等[23]
研究发现,粒径为 30 nm的 TiO2能快速吸附水中的
194第 5 期 胡冰,等:纳米 TiO2 和 Cu(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)对小球藻和新月菱形藻的毒性研究
表 1 TiO2+Cu(Ⅱ)、TiO2+Zn(Ⅱ)对小球藻和新月菱形藻的 EC50
Tab. 1 Joint EC50 of TiO2+Cu(Ⅱ)and TiO2+Zn(Ⅱ)to Chlorella sp. and Nitzschia closterium mg /L
微藻 microalgae 溶液 solution 24 h EC50 48 h EC50 72 h EC50 96 h EC50
小球藻 Chlorella sp.
TiO2 +Cu(Ⅱ)
TiO2 +Zn(Ⅱ)
12. 156
12. 920
11. 661
12. 833
10. 213
11. 846
9. 287
11. 084
新月菱形藻 Nitzschia closterium
TiO2 +Cu(Ⅱ)
TiO2 +Zn(Ⅱ)
13. 364
15. 723
12. 952
15. 583
11. 053
13. 334
10. 632
12. 954
Cd(Ⅱ) ,并增加对绿藻生长的抑制,说明Cd(Ⅱ)
有效浓度的减少不一定意味着重金属的毒性减弱。
但是,辛元元[9]研究发现,纳米 TiO2与重金属
Cd(Ⅱ)共存时,因其可吸附水中的Cd(Ⅱ) ,从而
降低了对绿藻的毒性。本研究中运用 Marking 相加
指数法求得纳米 TiO2和重金属联合毒性的相加指
数 AI,结果见表 2。由于纳米 TiO2和重金属联合毒
性的 AI 值均为负数,可见 TiO2 +Cu(Ⅱ)、TiO2 +
Zn(Ⅱ)对小球藻和新月菱形藻 24 h至 96 h 的联合
毒性效应均为拮抗作用,即 TiO2 +Cu(Ⅱ)和 TiO2 +
Zn(Ⅱ)对海水中小球藻或新月菱形藻的毒性效应,
均小于它们分别单独作用所产生的毒性效应。本研
究表明,纳米 TiO2和重金属离子共同存在于海水
中时,对两种海洋微藻的毒性作用会有所降低。
表 2 TiO2+Cu(Ⅱ)、TiO2+Zn(Ⅱ)对小球藻和新月菱形藻的联合毒性相加指数 AI
Tab. 2 Joint AI values of TiO2+Cu(Ⅱ)and TiO2+Zn(Ⅱ)to Chlorella sp. and Nitzschia closterium
微藻 microalgae 溶液 solution
相加指数 AI joint additive AI values
24 h 48 h 72 h 96 h
小球藻 Chlorella sp.
TiO2 +Cu(Ⅱ)
TiO2 +Zn(Ⅱ)
-0. 168
-0. 191
-0. 309
-0. 322
-0. 737
-0. 952
-0. 708
-0. 912
新月菱形藻 Nitzschia closterium
TiO2 +Cu(Ⅱ)
TiO2 +Zn(Ⅱ)
-0. 770
-0. 926
-0. 752
-1. 005
-0. 884
-0. 948
-0. 853
-0. 920
表 3 为 TiO2 +Cu(Ⅱ)、TiO2 +Zn(Ⅱ)对小球藻
和新月菱形藻联合毒性的增大系数。根据相加指数
与毒性增大系数的关系,96 h 时,TiO2 +Cu(Ⅱ)、
TiO2 +Zn(Ⅱ)混合物的毒性增大倍数均约为 0. 5。
范传刚[24]研究发现,纳米 TiO2与 Cd对大肠杆菌的
抗氧化酶、蛋白质和 DNA 均有毒性作用,而二者
的联合作用低于二者毒性的相加作用,表现为拮抗
作用。但是,田冰心等[25]研究则发现,纳米 TiO2
(1 mg /L)与菲、芘的联合作用表现出比单一污染
物更大的毒性作用;Zhu 等[26]研究表明,纳米
TiO2和三丁基锡的相互作用会对鲍鱼胚胎表现出更
大的毒性效应,两者表现为协同作用。由此可见,
对于纳米 TiO2的环境生态效应不应只关注其本身
的毒性,而应关注纳米 TiO2与环境污染物共同作
用的结果,这更能反映纳米 TiO2的环境暴露风险。
表 3 TiO2+Cu(Ⅱ)、TiO2+Zn(Ⅱ)对小球藻和新月菱形藻联合毒性的增大系数
Tab. 3 Joint augmentation coefficient of TiO2+Cu(Ⅱ)and TiO2+Zn(Ⅱ)to Chlorella sp. and Nitzschia closterium
微藻 microalgae 溶液 solution
增大系数 joint augmentation coefficient
24 h 48 h 72 h 96 h
小球藻 Chlorella sp.
TiO2 +Cu(Ⅱ)
TiO2 +Zn(Ⅱ)
0. 856
0. 840
0. 764
0. 756
0. 576
0. 512
0. 585
0. 523
新月菱形藻 Nitzschia closterium
TiO2 +Cu(Ⅱ)
TiO2 +Zn(Ⅱ)
0. 565
0. 519
0. 571
0. 499
0. 531
0. 513
0. 540
0. 521
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Toxicity of TiO2 nanoparticles,Cu(Ⅱ)and Zn(Ⅱ)to
Chlorella sp. and Nitzschia closterium
HU Bing1,WANG Hua1,ZHANG Dong-dong1,YU Chun-yan2,LIU Heng-ming3
(1. Engineering Research Center of Shellfish Culture and Breeding in Liaoning Province,College of Fisheries and Life Science,Dalian Ocean Universi-
ty,Dalian 116023,China;2. National Marine Environmental Monitoring Center,Dalian 116023,China;3. College of Marine Science and Envi-
ronment,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China)
Abstract:The toxicity of TiO2 nanoparticles and Cu(Ⅱ) ,Zn(Ⅱ)on Chlorella sp. and Nitzschia closterium was
investigated using the aquatic toxicology method. The one way-toxicity test showed that the 96 h EC50 value of TiO2
nanoparticles was 11. 655 mg /L for Chlorella sp. and 13. 693 mg /L for Nitzschia closterium. The 96 h EC50 value of
Cu(Ⅱ)was 10. 197 mg /L for Chlorella sp. and 10. 330 mg /L for Nitzschia closterium,and the 96 h EC50 value of
Zn(Ⅱ)was 11. 033 mg /L for Chlorella sp. and 13. 583 mg /L for Nitzschia closterium. The EC50 of joint toxic effect
of TiO2+Cu(Ⅱ)and TiO2+Zn(Ⅱ)was decreased with elapse of the experiment. The 96 h EC50 value of TiO2 +
Cu(Ⅱ)and TiO2+Zn(Ⅱ)on Chlorella sp. was 9. 287 mg /L and 11. 084 mg /L,respectively. For Nitzschia clos-
terium,the 96 h EC50 value of TiO2+ Cu(Ⅱ)and TiO2+ Zn(Ⅱ)was 10. 632 mg /L and 12. 954 mg /L,respec-
tively. The additive index method releaved that the joint toxicity of TiO2+Cu(Ⅱ)and TiO2+Zn(Ⅱ)on Chlorella
sp. and Nitzschia closterium both were antagonism.
Key words:TiO2 nanoparticle;Cu(Ⅱ) ;Zn(Ⅱ) ;Chlorella sp.;Nitzschia closterium;toxicity
394第 5 期 胡冰,等:纳米 TiO2 和 Cu(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)对小球藻和新月菱形藻的毒性研究