全 文 ：从 20世纪 80年代以来，纳米科技蓬勃发展，随
着生产和应用的快速扩大，纳米材料因其特殊的理化
性质在当今社会众多领域得到广泛应用[1-2]。在给人们
带来巨大经济和社会效益的同时，纳米材料通过各种
途径进入环境而成为纳米污染物的机会也将相应增
加，对人类健康和生态环境产生潜在风险，因此纳米
材料的环境行为和生态效应已经成为科研的新领域。
纳米ZnO与 TiO2已在工业上规模生产，且被用于化
妆品、遮光剂、纺织、涂料和建筑等领域[3-4]。这两种纳
摘 要：随着生产和应用的快速发展，纳米材料通过各种途径进入环境，导致污染的可能大大增加，对其可能产生的环境风险和生
物安全值得关注。以斜生栅藻（Scenedesmus oblignus）为指示生物，采用藻类生长抑制、光合色素含量及抗氧化酶活性测定等实验，
研究了纳米氧化锌（ZnO）和纳米二氧化钛（TiO2）的毒理学效应。结果显示：纳米 ZnO在低浓度时（5 mg·L-1）对斜生栅藻生长有显著
促进作用，随着浓度升高，逐渐表现为抑制；在最高浓度 50 mg·L-1时，细胞色素含量减少，蛋白质含量及抗氧化酶活性明显下降，引
起显著细胞氧化损伤。纳米 TiO2也表现为低浓度（1 mg·L-1）促进、高浓度（200 mg·L-1）抑制藻类生长的趋势，同时高浓度还导致细
胞色素和蛋白质含量减少，抗氧化酶活性明显下降，同样引起氧化胁迫效应。研究结果表明此类纳米材料的生态毒性效应不容忽
视，为此应进一步加强其环境健康和生态毒性研究，为纳米材料的生态风险评价和安全评估提供科学依据，促进纳米技术的健康、
安全和可持续发展。
关键词：纳米 ZnO；纳米 TiO2；超氧化物歧化酶（SOD）；过氧化物酶（POD）；毒性效应
中图分类号：X820.4 文献标志码：A 文章编号：1672-2043（2013）06-1122-06 doi:10.11654/jaes.2013.06.006
纳米氧化锌和二氧化钛对斜生栅藻的毒性效应
李雅洁，王 静，崔益斌，李 梅 *
（南京大学环境学院污染控制与资源化研究国家重点实验室，南京 210023）
Ecotoxicological Effects of ZnO and TiO2 Nanoparticles on Microalgae Scenedesmus oblignus
LI Ya-jie, WANG Jing, CUI Yi-bin, LI Mei*
（School of the Environment, Nanjing University, State Key Laboratory of Pollution Control & Research Reuse, Nanjing 210023, China）
Abstract：With the mass production and widespread use of nanomaterials, the potential for their release into the environment is increasing.
The potential risks and ecological effect to human health and ecological environment has become a new field of scientific research. In this
study the impact of nano-ZnO and nano-TiO2 on aquatic ecosystems has been investigated using microalage Scenedesmus oblignus as a
model. Microalgae S. oblignus were exposed to nano-ZnO and nano-TiO2 at different doses（0.01, 0.1, 0.5, 1, 5, 50 mg·L-1 and 1, 5, 10, 50,
100, 200 mg·L-1）for 96 h. Response of the growth, photosynthetic pigments and antioxidant enzyme activities were selected as assessment
indicators. The results indicated that the effect of nano-ZnO within the concentrations of 0.01, 0.05, 1 mg·L-1 on the growth of S. oblignus
showed a significant improvement（P<0.05）but no significant difference on protein content compared with control. However, when the con－
centration was increased to 5 mg·L-1, nano-ZnO started to bring an evident stress to the growth and protein content, and high concentrations
of 50 mg·L-1 significantly inhibited the growth and protein content, while the inhibitation of photosynthetic pigments, and superoxide dis－
mutase（SOD）and peroxidase（POD）activities was observed in lower concentrations. Similarly, dose-effects of nano-TiO2 was also ob－
served in S. oblignus, being found to promote the growth at low concentrations of 1 mg·L-1, which could increase the content of photosyn－
thetic pigments, especially the content of the chlorophyll b and protein. As the concentration increased, the stimulative effect was reduced
and the inhibition effect was enhanced. The influence on the activities of SOD and POD was consistent with that of cell growth. These stud－
ies suggested that nano-ZnO and nano-TiO2 at high concentrations induced toxicological effects.
Keywords：nano-ZnO; nano-TiO2; superoxide dismutase（SOD）; peroxides（POD）; toxicity effect
收稿日期：2012－11－19
基金项目：国家自然科学基金（21077052）；江苏省社会发展项目
（BE2012737）
作者简介：李雅洁（1990—），女，硕士研究生，主要从事环境毒理学研
究。E-mail：lyj121582@126.com
*通信作者：李 梅 E-mail：meili@nju.edu.cn
2013，32（6）:1122-1127 2013年 6月农 业 环 境 科 学 学 报
Journal of Agro-Environment Science
第 32卷第 1期2013年 6月
米材料市场需求量高而且产量大，从而也增加了其环
境释放风险，引起了广泛研究和关注[5]。
藻类对水生生态系统的平衡和稳定起着十分重
要的作用。水生毒理学研究中，藻类作为水体的初级
生产者，其种类多样性和初级生产量直接影响水生态
系统的结构功能，因而成为监测评价水环境质量的重
要指标[6]。已有许多国家采用藻类进行化学品的风险
评价，并建立了相关的标准测试方法。选用藻类作为
模式生物进行纳米材料的生物毒性效应已引起广泛
关注，针对纳米金属及氧化物、碳纳米材料等对藻类
的毒性效应方面取得了较大进展[6-13]，研究结果表明纳
米材料的毒性效应与纳米材料的形态、粒径、溶解度
及分散性等诸多因素有关，同时也与不同藻类的细胞
结构和理化性质相关[14，8]。相关研究证实纳米TiO2和
ZnO对藻类具有毒性效应，如 Hartmann等的研究发
现 3种不同粒径纳米 TiO2对近头状伪蹄形藻（Pseu－
dokirchneriella subcapitata）具有不同的毒性效应 [9]；
Aruoja 研究了 CuO、ZnO 和 TiO2纳米粒子对水域中
微藻的毒性影响，结果表明相较于其他两种物质，纳
米 ZnO的毒性最强[15]；陆长梅等从表观和生理上检测
了纳米级 TiO2对铜绿微囊藻的毒性效应[16]。由于纳米
材料种类繁多，相比而言不同纳米颗粒对藻类毒性研
究仍显不足。因此，研究不同纳米材料作用于不同藻
类的毒性效应具有十分重要的意义[17]。
斜生栅藻（Scenedesmus oblignus）因其个体小、对
毒物敏感，生长周期短，易于培养等特点，已被广泛地
用作评价污染物环境与健康影响的模式生物[18]。本研
究以斜生栅藻作为实验材料，选择超氧化物歧化酶
（SOD）、过氧化物酶（POD）和光合色素作为评价指
标，探讨纳米 ZnO和 TiO2的毒性效应，以期为水生态
环境纳米材料的生物安全评价及更加科学合理地使
用纳米材料提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
斜生栅藻（S. oblignus）购自中科院水生生物研
究所藻种库，并经室内扩大培养用于实验。ZnO 和
TiO2纳米颗粒购自南京爱普瑞纳米材料有限公司，两
者均为金红石型（粒度为 10～20 nm），纯度大于 99%，
比表面积纳米 ZnO 为 58 m2·g-1，纳米 TiO2为 120~
130 m2·g-1。超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）
和考马斯亮蓝试剂盒均购自南京建成生物工程研
究所。
1.2 培养条件
按 OECD 标准采用 SE 培养基 [7]，取对数生长期
藻体接种，接种密度为每毫升 1×106～2×106个细胞，
置于恒温光照培养箱中培养。培养条件为光强 80～90
μmol·m-2·s-1，温度（25±1）℃，光暗周期比 12 h∶12 h，
静置培养 96 h，每日定时摇动并随机移动各瓶的位置
以减少误差。
1.3 毒性实验
以灭菌 SE 培养基制备相应浓度的纳米材料悬
浊液，染毒前用超声波处理器处理 10 min（超声 20 s，
间歇 10 s）。纳米 ZnO共设 6个剂量组（0.01、0.1、0.5、
1、5、50 mg·L-1），纳米 TiO2共 6 个剂量组（1、5、10、
50、100、200 mg·L-1），每个剂量 3个平行，并设空白
（蒸馏水）对照组。培养 4 d，每日定时取样，通过血球
计数板于 400倍光学显微镜下计数藻细胞浓度。
1.4 光合色素及酶活测定
微藻处理 4 d后，一定量藻液于 5000 r·min-1下
离心 10 min，弃上清，加入 5 mL 80%丙酮，于黑暗处
提取 24 h后，8000 r·min-1离心 15 min，取上清液，分
光光度法测定各组叶绿素与类胡萝卜素含量[19-20]。
离心收集一定量藻液重新悬浮于适量预冷磷酸盐
缓冲液（pH7.0）中，冰浴下超声破碎，4℃低温高速离心
（12 000 r·min-1、20min），取上清液做酶活性分析。按照
试剂盒说明书所述方法测定 SOD、POD和蛋白质含量。
1.5 实验数据处理
每组实验均设 3 组平行，实验数据处理采用
SPSS 13.0统计分析软件，进行 t检测和差异显著性分
析并绘图。以下各图和表中 *表示和对照组相比差异
显著（P＜0.05）。
2 结果与分析
2.1 纳米金属氧化物对斜生栅藻生长的影响
不同纳米 ZnO浓度下斜生栅藻 4 d（96 h）生长曲
线如图 1所示。由图可见，在 0.01~1 mg·L-1较低浓度
范围内，纳米 ZnO对藻类生长有促进作用，其中 0.1、
0.5、1 mg·L-1 3组与对照相比差异显著（P＜0.05）。当
浓度超过 5 mg·L -1 逐渐转为抑制，浓度为 50
mg·L-1时，斜生栅藻的生长受到明显抑制。
图2显示不同浓度纳米 TiO2作用下斜生栅藻的
生长曲线。可见低浓度纳米 TiO2（1~50 mg·L-1）处理组
与对照曲线比较一致，对藻类生长无明显作用，当浓度
大于 100 mg·L-1，表现出明显的抑制作用（P<0.05），且
随浓度增大抑制作用增强，但小球藻仍能缓慢生长。
李雅洁，等：纳米氧化锌和二氧化钛对斜生栅藻的毒性效应 1123
农业环境科学学报 第 32卷第 6期
2.2 纳米金属氧化物对光合色素含量的影响
图 3为不同浓度纳米 ZnO对斜生栅藻光合色素
含量的影响。与对照组相比，各浓度组纳米 ZnO对叶
绿素和类胡萝卜素（CAR）含量均有一定程度的抑制
作用。当浓度为 50 mg·L-1时，相比对照，各种色素含
量降低显著（P＜0.05），叶绿素 a（Chla），叶绿素 b（Chlb）
和 CAR含量分别降低了 17.0%、26.1%和29.9%。
不同浓度纳米 TiO2下斜生栅藻光合色素含量的
变化见图 4。由图可见，各浓度组纳米 TiO2对叶绿素
和类胡萝卜素的作用并不一致。随着处理浓度的增
加，纳米 TiO2对 Chla表现为低浓度促进，高浓度抑
制，对 Chlb则表现为明显的抑制作用，而对 CAR含
量无显著影响。
2.3 纳米金属氧化物对蛋白质含量、SOD 和 POD 活
性的影响
以不同剂量的 ZnO纳米颗粒染毒 96 h后，斜生
栅藻抗氧化酶（SOD和 POD）活性和蛋白质含量变化
如表 1所示。对于试验剂量范围内的纳米 ZnO，蛋白
质含量在低浓度下（0.01~1 mg·L-1）无显著变化，随着
处理浓度升高，呈现下降趋势，且差异显著（P＜0.05），
其中 5 mg·L-1和 50 mg·L-1剂量组相比对照分别降低
了 10.51%和 34.32%；SOD活性则随剂量升高显著下
降，其中 50 mg·L-1处理组相比对照下降了 35.55%；
POD活性与 SOD 趋势相同，即随纳米 ZnO 浓度升
高，均表现为抑制作用，其中 5 mg·L-1和 50 mg·L-1分
别比对照下降了 58.62%和 65.84%。
不同浓度纳米 TiO2染毒 96 h后，蛋白质变化趋
势与 ZnO处理相同（表 2），即低剂量 TiO2处理时（1~
10 mg·L-1）无明显变化，随浓度升高含量明显下降（P<
0.05），其中 50 mg·L-1和 200 mg·L-1组与对照相比分
别降低了 34.03%和 48.50%；SOD活性除了 1 mg·L-1
处理组无明显变化外，其余各组均随剂量升高显著下
降，且具一定剂量-效应关系，其中最高处理组 200
mg·L-1 相比对照下降了 38.83%；POD 活性变化与
ZnO处理稍有不同，在 1 mg·L-1暴露剂量时明显受到
促进（P<0.05），随着染毒剂量的增加，出现下降趋势，
在高剂量 50 mg·L-1和 200 mg·L-1时相比对照分别下
5
4
3
2
1
0
浓度/mg·L-1
含
量
/m
g ·（
10
6
ce
lls
）
-1
0 0.01 0.1 0.5 1 5 50
Chla Chlb CAR
*
**
**
*
***
*
**
*
图 3 不同浓度 ZnO对光合色素含量的影响
Figure 3 Effects of nano-ZnO on the photosynthetic pigments
of S. oblignus
图 4 不同浓度 TiO2对光合色素含量的影响
Figure 4 Effects of nano-TiO2 on the photosynthetic pigments
of S. oblignus
5
4
3
2
1
0
浓度/mg·L-1
含
量
/m
g ·（
10
6
ce
lls
）
-1
0 1 5 10 50 100 200
Chla
Chlb
CAR
*
*
*
*
*
***
*
图 1 不同浓度纳米 ZnO下斜生栅藻生长曲线
Figure 1 Growth curves of S. oblignus treated with different
concentrations of nano-ZnO
35
30
25
20
时间/h
细
胞
密
度
/×
10
5
ce
ll ·
m
L-
1
0
0 mg·L-1
0.01 mg·L-1
0.1 mg·L-1
0.5 mg·L-1
1 mg·L-1
5 mg·L-1
50 mg·L-1
10020 40 60 80
*
*
*
图 2 不同浓度纳米 TiO2下斜生栅藻生长曲线
Figure 2 Growth curves of S. oblignus treated with different
concentrations of nano-TiO2
26
24
22
20
18
16
时间/h
细
胞
密
度
/×
10
5
ce
ll ·
m
L-
1
0
0 mg·L-1
1 mg·L-1
5 mg·L-1
10 mg·L-1
50 mg·L-1
100 mg·L-1
200 mg·L-1
10020 40 60 80
*
*
1124
第 32卷第 1期2013年 6月
表 1 不同剂量 ZnO纳米颗粒对蛋白质含量、SOD和 POD活性的影响（平均值±标准差）
Table 1 Effects of different concentration of nano-ZnO on protein content，and activities of SOD and POD（Mean± SD）
表 2 不同剂量 TiO2纳米颗粒对蛋白质含量、SOD和 POD活性的影响（平均值±标准差）
Table 2 Effect of different concentration of nano-TiO2 on proteins content，activity of SOD and POD（Mean± SD）
浓度/mg·L-1 CK 0.01 0.1 1 5 50
Protein/mg·106cells-1 0.036±0.001 0.037±0.002 0.037±0.001 0.035±0.005 0.032±0.001* 0.020±0.007*
SOD/U·（106cells）-1 1.98±0.06 1.73±0.14* 1.31±0.05* 1.32±0.020* 1.57±0.27* 1.27±0.04*
POD/U·（106cells）-1 0.46±0.04 0.28±0.01* 0.19±0.03* 0.20±0.02* 0.18±0.06* 0.15±0.02*
注：*与空白组相比差异显著（P<0.05），下同。
浓度/mg·L-1 CK 1 10 50 200
Protein/mg·（106cells）-1 0.037±0.002 0.038±0.003 0.036±0.004 0.024±0.001* 0.019±0.001*
SOD/U·（106cells）-1 2.27±0.13 2.33±0.25 2.15±0.15* 1.59±0.03* 1.38±0.21*
POD/U·（106cells）-1 0.57±0.03 0.65±0.03* 0.46±0.02* 0.36±0.08* 0.27±0.01*
降了 38.14%和 51.90%，差异显著（P<0.05）。
3 讨论
纳米材料可能通过多种途径进入环境而成为纳
米污染物，如纳米材料的环境直接释放、工厂和实验
室的废物排放、纳米产品在使用和废弃处理过程中的
环境释放等，但目前还不清楚这些过程的释放程度，
对纳米材料在不同环境介质中迁移途径的了解也比
较有限[21]。
纳米 TiO2作用于藻类的研究较多[8-9，11]，本研究中
TiO2纳米颗粒试验采用了较高的暴露剂量，目的是充
分了解其对藻类的急性毒性效应。试验中不同的纳米
材料水悬浮液对斜生栅藻的生长均有一定影响，其中
纳米 ZnO和纳米 TiO2水悬浮液分别在 0.5 mg·L-1和
5 mg·L-1可对斜生栅藻生长产生显著的促进作用（P<
0.05），这与朱小山等的研究差异较大，其研究显示纳
米 TiO2（≤20 nm，锐钛矿型）对斜生栅藻的 96 h EC50
为 15.3 mg·L-1 [22]，可能由于本文选取的纳米颗粒与其
具有不同的粒径及比表面积，有文献称纳米 ZnO和纳
米 TiO2由于粒径不同，毒效可能存在差异[23，9]，表面曲
率和粗糙度在溶剂中也起到重要的作用[14]。纳米 ZnO
和 TiO2在低浓度时对斜生栅藻生长的促进作用，可
能是由于低浓度毒物的“刺激效应”或称“兴奋效应”所
致[24-25]，与纳米材料的暴露胁迫，增加藻体内某些酶的
活性，促进藻类生长有关，巩宁等和朱小山等在相关
研究中也发现有类似现象[26，22]。随着两种金属纳米氧化
物浓度升高，斜生栅藻的生长受到抑制，这可能与纳
米材料会吸附在藻细胞表面，抑制藻类生长有关[14]。
此外，纳米金属氧化物的加入也可干扰能量的转换，
影响 ATP的合成[27]，对细胞周期有阻断作用[13]，并且
影响相关信号的传导，如庞小峰等发现纳米氧化钛可
以游离于细胞之间，使胞间通信受阻，从而降低细胞
的生长速度[28]。Aruoja等[15]的研究证明纳米 ZnO的毒
性主要是因为其溶解出的 Zn2+所致。在 50 mg·L-1浓
度组下斜生栅藻的生长均受到抑制，且 ZnO处理组
较为明显，在已有的针对其他生物的研究中，也发现
纳米 ZnO较之 TiO2具有较明显的毒性[29]。
光合色素是在光合作用中参与吸收、传递光能或
原初光化学反应的色素，植物的光合色素一般包括
Chla、Chlb和类胡萝卜素。本实验中两种纳米金属氧
化物对细胞色素的作用没有明显的规律，但在最高浓
度组都呈显著性抑制作用（图 3、图 4），这可能是因为
短时间内纳米 ZnO和 TiO2尚不能刺激藻体细胞发生
防御反应，只能使 Chla分子受损或其合成代谢受到
抑制，含量降低。随着时间的延续，当达到防御系统的
刺激阈值时，藻体的防御机制启动，生成相应的解毒
物质。但当胁迫浓度进一步加大时，就可能超过其防
御能力，直接破坏解毒物质，而且形成大量的活性氧
自由基[30]，这些自由基的产生和累积导致膜脂质过氧
化，致使叶绿素含量下降，细胞生长受阻碍[31]。另外从
藻体结构看，由于斜生栅藻是低等植物，所以纳米金属
氧化物侵入较高等植物更容易，毒性效应也更明显[9]。
本研究结果表明纳米 ZnO 和纳米 TiO2对 Chla的作
用最为明显，这可能是因为 Chla作为捕光色素复合
体重要组成部分，在光合系统 PSⅡ的反应中心中，作
为光合电子传递链的电子供体，与其他光合色素相
比，更容易受到光降解作用的影响[32]。
纳米颗粒毒性的主要机制被认为是氧化胁迫，它主
李雅洁，等：纳米氧化锌和二氧化钛对斜生栅藻的毒性效应 1125
农业环境科学学报 第 32卷第 6期
要影响脂、多糖、蛋白质的合成和对 DNA造成损伤[33]，
本实验中，低浓度处理时对蛋白质含量均无显著影
响；随着处理浓度逐渐升高，蛋白质含量呈现下降趋
势，这可能是由于蛋白质与-SH结合导致蛋白质变性
而降解，也可能是蛋白质合成酶的失活或DNA转录
翻译途径受阻，影响了蛋白质的合成[34]。有机体内的
多种酶具有抗氧化能力，可以将细胞内产生的活性氧
通过电子传递链还原为水，这一系列酶包括 SOD、
POD和过氧化氢酶（CAT）等。SOD主要催化细胞内的
O-2·转变为细胞毒性相对较低的 H2O2，在细胞的抗氧
化保护机制中可能起中心作用[35]；POD则是细胞内清
除 H2O2的主要酶类，使藻细胞体内活性氧自由基的
形成和清除之间保持动态平衡。这些抗氧化酶和机
体内的其他抗氧化物协同作用，清除机体内过多的
活性氧自由基，防止机体受到氧化损伤[30]。逆境胁迫
下，抗氧化酶中的一种或几种会表现出“毒物兴奋效
应”[36-37]，SOD与 POD受到显著诱导，以清除活性氧从
而提高微藻的抗逆性。
4 结论
（1）低浓度纳米 ZnO和纳米 TiO2对斜生栅藻生
长均起促进作用，一定浓度后表现为抑制作用，呈现一
定的浓度依赖性。与 TiO2相比，ZnO 具有较明显的
毒性。
（2）纳米 ZnO和纳米 TiO2胁迫导致斜生栅藻体
内活性氧自由基的大量产生和积累，光合色素和可溶
性蛋白含量降低，SOD和 POD活性降低，浓度越高，
抑制效应越明显。其中抗氧化酶活性对纳米 ZnO和
纳米 TiO2反应灵敏，可作为此类纳米金属氧化物污
染的潜在生物标志物。
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