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布朗葡萄藻培养方面的研究概况



全 文 :《现代农业科技》2008年第15期
自发现布朗葡萄藻(Botryococusbrauni),又名丛粒藻、葡
萄藻,具有高烃含量后,将该藻作为无污染可再生的替代能
源生产者经若干研究者倡议引起广泛重视,美、法、日、英、
澳、苏、荷和南朝鲜等国都或早或晚开展了有关研究。葡萄
藻是一种单细胞绿藻,温带、热带和大陆性气候带的淡水、
微咸湖水等地广为分布,在培养物中,其产烃量为生物量干
重的 0.3%~76.0%,通常为 25%~40%,在天然样品中最高达
86%,大大高于其他微生物的含烃量(几乎都低于1%),并且
葡萄藻所产烃的组成和结构与石油极其相似,在一些石油
沉积中几乎全部有机质都是该藻形成的[1],故又被称为“油
藻”,最可望成为工业藻种。此外,葡萄藻的培养可提高 CO2
的固定效率,降低生活污水的氮磷浓度,起到净化环境的作
用[2]。目前,为试图得到高的生物量和产烃量,对葡萄藻的培
养方面已经作了很多研究。
1 葡萄藻培养常用的培养基及条件
最初的Chu10培养液,在组成和稀释度上,可以同富营
养的湖水相比,适合多种浮游藻类生长,但生长率较慢。至
20世纪 80年代,用 Chu13培养液成功促进了葡萄藻的生
长繁殖[3]。现在改良Chu13(medifiedChu13)培养基是葡萄藻
培养的常用培养基。BBM培养基、BBMa培养基、BGⅡ培养
基以及不同浓度(0.25X,0.5X,0.75X,1X,2X)改良 Chul3培
养基也适合B.brauniSAG30.8l和 LB572的生长,但各培养
基中藻的生物量和烃含量有差别,其中BGⅡ培养基中的藻
体在光暗周期比16∶8,光强为1200±200Lx,温度为(25±1)℃
的培养条件下有较高的生物量(2.0g/L和 2.8g/L)和产烃量
(46%和 33%)[4]。用 Prat培养基培养葡萄藻,能获得生物量
3.9kg/m3,生长世代 3~4d,指数阶段生长率是 0.235d-1。葡萄
藻的生长速率可以进一步提高,在其盐度实验中,用 SE培
养基,温度 23℃,光强 60w/m2,光暗周期 12h∶12h,盐度为
0.15M的条件下培养B.brauniChina1,该藻的平均倍增时间
可以缩短到2.0±0.02d左右[5]。比较表明,葡萄藻能适应较广
的培养基和多种培养条件,但对于不同的品系或藻株,最适
合其生长的培养基成分和条件通常有差异。
2 影响葡萄藻生长的理化因子
像其他的微藻一样,葡萄藻的生长受碳、氮、磷、温度、
光强、pH值、盐度等影响。为降低倍增时间,人们对葡萄藻
可能利用的碳源进行了研究,培养基中加入重碳酸盐不能
缩短葡萄藻生长代时,而 200mg/L的 NaHCO3作为补充碳
源能一定程度上促进葡萄藻生长。CO2浓度对生长有显著
影响,用空气培养时,葡萄藻生长缓慢,延滞期为 4d左右,
第23天进入减速期,第 30天进入稳定期,最小倍增时间为
6d[6];用含 0.3%的CO2通气培养葡萄藻,能极大地促进其生
长,最小倍增时间缩短到 40h;用 1%的CO2通气培养,指数
阶段生物量的平均加倍时间是 2d,烃产量增加了 5倍[7]。可
见,葡萄藻是自养的,但是通气培养以及利用合适外源碳,
例如NaHCO3,能促进其生长和烃合成。对于葡萄藻化学种
B,CO2通气培养有利于合成C30-C32的丛粒藻烯,碳原子数
稍低于不通气培养的情况(C33-C34)。显然,在CO2通气培养
条件下,从C30的丛粒藻烯甲基化合成C31,C32丛粒藻烯的速
度要快于合成C33、C34以及其他更高碳原子数的同系物[7]。
氮是葡萄藻生长的必需营养元素。培养基中不含氮时,
藻体几乎无生长,随着KNO3浓度的提高,氮的同化作用加
强,生长速率增加,当硝酸钾浓度大于 200mg/L时,继续增
加硝酸钾浓度,生长速率增加较慢,并且过高的初始浓度,
例如3kg/m3,干扰烃合成[6]。氮浓度为完整Prate培养基中的
1/4时,藻体叶绿素a和叶绿素b含量比完整培养基中培养
的低2.5倍,培养进行到第13天时,藻体由绿色变为黄褐色,
生物量为全培养基中的1/2[8]。另有研究表明,在氮缺乏条件
下,葡萄藻的干重、叶绿素 a和蛋白质含量都明显下降,但
类胡萝卜素和脂类增加。葡萄藻在一定程度上能利用亚硝
酸盐作为唯一氮源,当其浓度为 2mmoL/L时,葡萄藻的最
小倍增时间为4.2d,与4mmoL/L硝酸盐的培养情况相同;浓
度为 4mmoL/L时,大约经过 10d左右的延滞期后,藻体开
始快速生长,最终生物量与对照基本相同;浓度增加到 8
mmoL/L时,完全抑制葡萄藻的生长[9]。铵盐作为氮源对藻体
有损害,能抑制丛粒藻烯的合成,并有利于氨基酸的生成[10]。
低浓度的NH4+作为氮源,其毒性多表现在藻体对数生长晚
期,使培养液的pH值降到 4左右,对藻体造成不可逆的损
伤;当藻体处于 5mmoL/L高浓度 NH4+的环境下 24h,硝酸
盐还原酶就会失活[11]。用NH3作为氮源,葡萄藻的光合作用
以及烃合成量都显著降低,CO2固定作用减少了60%,O2释
布朗葡萄藻培养方面的研究概况
马 梅 王朋云
(中国海洋大学,山东青岛 266003)
摘要 对布朗葡萄藻培养方面的有关研究进行总结,内容涉及布朗葡萄藻常用的培养基、培养条件以及影响其生长的理化因素。重点
概述和讨论了碳源、氮源、磷源、温度、光强、pH值、盐度、细菌、SC1058等理化因素对布朗葡萄藻生物量和烃产量的影响,并进一步提出获
得高生物量和产烃量的可能研究方向。
关键词 布朗葡萄藻;培养;理化因素
中图分类号 Q949.25+3 文献标识码 A 文章编号 1007-5739(2008)15-0035-04
作者简介 马梅(1980-),女,山东潍坊人,硕士研究生。研究方向:藻类
生物学。
收稿日期 2008-06-10
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《现代农业科技》2008年第15期
放量不足原先的 50%,但是丙氨酸、谷氨酸盐、5-氨基乙酰
丙酸以及其他氨基酸的量显著增加,这表明乙酰CoA从烃
合成途径转入氨基酸合成途径[10]。对硝酸盐、亚硝酸盐、铵
盐、氨气分别作为氮源的研究表明,不同的氮源及浓度对葡
萄藻生长的影响不同,藻体氮代谢体系可能优先利用硝酸
盐。
磷浓度不是葡萄藻生长的限制性因素[12],但磷是葡萄藻
生长所必需的,所需磷源通常是磷酸氢二钾的形式。磷浓度
在0~160mg/L范围内,随着磷浓度增大,葡萄藻的生长速率
和生物量均增大[6]。培养基中磷耗尽后,葡萄藻仍能维持一
段时间的活跃生长,即当磷浓度低于检测水平时,葡萄藻仍
能处于指数生长阶段。这符合许多藻类利用磷的特点,许多
藻能迅速地吸收磷酸盐远远超过它们需要的量,过量的磷
酸盐被储存于胞内颗粒中,当胞外磷酸盐耗尽后,再逆向利
用胞内的。在培养最后阶段,由于细胞裂解,大量磷酸盐被
释放到培养基中,甚至超过Chu13的初始浓度,这并不影响
藻生长及烃性质。有报道表明,磷过量时会显著增加烃合成
量,这可能是由于培养基中氮/磷比改变引起的,氮/磷比
能影响各种藻类的脂类含量。当氮/磷比为1∶4时,有利于烃
类产物积累,而氮/磷比为 1∶0.5时,既有利于生物量积累,
也有利于烃类产物积累。这个结果表明,氮/磷比在生物量
积累和烃类积累方面有着十分重要的作用,以及利用一步
培养来达到高生物量和烃类产物积累的可能性[12]。
其他营养盐对葡萄藻生长的影响也有一些报道。酸性
亚硫酸盐浓度为 0~lmmoL/L时,对葡萄藻生长没有不良影
响,这些酸性亚硫酸盐被氧化为硫酸盐并作为硫源被藻体
利用,藻体生长速度与以硫酸盐为硫源的对照组基本相同;
当酸性亚硫酸盐浓度高于1mmoL/L时,会对藻体产生毒害
作用,2.0mmoL/L时,表现出明显的抑制作用,藻体 24h内
变白,说明对叶绿素有毒害作用,但这些条件下代谢积累的
烃类,其结构没有显著的差别[13]。培养条件的整体优化方面,
用反应表面法(RSM-responsesurfacemethodology)研究了
磷酸二氢钾、硝酸钾、硫酸镁和柠檬酸铁对布朗葡萄藻
(SAG品系)生长和烃类产物的影响。其最优浓度分别为
0.0195g/L、0.05g/L、0.02g/L和0.0185g/L时,可产生0.65g/L
的生物量和50.65%的烃类[14]。
B.brauniA(编号 357)的最适生长温度为 25℃,高于此
温度,生长迅速下降,生长温度的上限位于28~30℃;B.brauni
UK和B.brauniJAP品系在 25℃时生长速率也最大[15],而 B.
brauniChina1,温度对其生物量的影响是 23℃>20℃>25℃>
27℃>30℃[5]。B.brauniJAP的脂质含量基本不受温度影响
(p>0.05),B.brauniCHN1和 B.brauniUK在 25℃时的脂质
含量高于30℃条件下的(P<0.05);32℃条件下,除了三酰甘
油,葡萄藻胞间几乎所有脂类合成都受到了显著抑制,三烯
醇脂肪酸的含量明显低于25℃条件下的[15]。可见,温度对葡
萄藻生长的影响具有种属特异性,通常最适合其生长的范
围是23~25℃。
藻体的颜色受光强影响,高光强培养可以增加类胡萝卜
素/叶绿素比率,产生橙色的藻丛;低光强培养,藻体呈现绿
色,并且这些颜色的变化是可逆的,仅依靠藻丛颜色来判断
烃类含量是不可靠的。光强也影响藻集落大小,当藻密度
低,能充分进行光合作用时,藻体集落的直径随着光强的增
加而增大;藻密度较大时,由于藻颗粒的相互遮挡使平均光
强降低,细胞集落的直径减少。集落大小主要由集落的机械
粘滞强度与反应器中水体压力两方面的平衡决定,其随光
强的变化可能是由于光强的增加有利于细胞壁物质的合
成,从而增强了集落的机械粘滞强度。另外,随着平均光强
的降低,胞外多糖和烃产量也会降低[16]。研究表明,30w/m2
和 60w/m2的处理更适合于 B.brauniCHN生长,8w/m2和
12w/m2光强条件下大部分藻细胞死亡,藻体颜色变成浅褐
色,藻细胞易聚在一起;在60~300w/m2范围内,随着光强增
大,生长率逐渐降低;300w/m2的光强条件下,大部分藻细胞
死亡,瓶底部沉积褐色藻体[5]。B.brauniUK和 B.brauniJAP
在光强为 60~300w/m2范围内生长速率没有显著差异(P>
0.05)。就脂类含量来看,B.brauniCHN在光强60w/m2和l00
条件下比光强 300w/m2条件下明显要高(P<0.05);B.brauni
UK品系在 60w/m2条件下脂质含量最高[15]。将适应较低光
强的B.brauniUTEX572置于25~72μE/m2/s的光强条件下,
藻体烃含量以及细胞中的氮和磷浓度都会有所下降,而对
于在前期接受了强光(10万勒克斯,大约140μE/m2·s)处理
的藻体,高光强下培养可以得到高的生物量(7kg/m3)和烃
含量(藻体干重的 50%),这是由于低光强培养的藻体在高
光强条件下有光抑制现象,而藻体经强光预处理后则会避
免[17]。在持续光照下,得到生物量是光暗周期培养(12L/12d)
的2倍,烃量增加了4倍[11]。
初始 pH值 6.0~8.5范围内培养 B.brauniSAG30.81和
B.brauniLB572,均能较好地生长,pH值 6.0获得的生物量
最高,分别是 0.77g/L和 1.9g/L,培养期间的 pH值变化是
8.0~8.8,这是由于光合作用引起的CO2或者是 H2CO3的溶
解造成的;pH值对烃含量的影响不大,不同 pH值条件下,
B.brauniSAG30.81、B.brauniLB572的烃含量范围分别是
25%~31%(W/W)和 38%~41%(W/W)。通常情况下,pH值
在酸性到中性范围内比在碱性范围内生长得要好,但pH值
在6~9范围内,对生物量和烃含量影响均不大[4]。接种前,培
养基的pH值一般被调整到7.4~7.6之间,在活跃生长阶段,
pH值会规律性地增加,随后会稍微降低。pH值的增加是光
合作用CO2的溶解造成的。指数生长阶段以及 CO2分压高
的培养基多会出现类似pH值变化[12]。
1mg/L的 NaF对 B.brauniA(编号 357)的生长有明显
促进作用,藻的生物量由 0.71mg/L增加到 0.89mg/L。当
NaF浓度提高到 0.25mg/L时,生物量下降到低于未加 NaF
的对照水平。可见,0.25mg/L的NaF明显抑制藻生长[18]。
不同的藻株,对盐度的耐受性不同。B.brauniUK在含
有 0.50moLNaCl的培养基中生长速率迅速下降(P<0.05),
而对于 B.brauniJAP和 B.brauniCHN来说,其盐度耐受性
是0.15moL的 NaCl;B.brauniCHN的脂质含量不受盐度的
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影响(P<0.05),B.brauniUK和 B.brauniJAP,在盐度达到
0.5moL时,脂质含量明显下降(P<0.05)[15]。研究表明,葡萄
藻代谢的烃类、糖类、脂肪酸、类胡萝卜素的含量和组成多
受不同盐度的影响。盐度增加,极性脂肪酸的比例发生变化,
其中不饱和脂肪酸比饱和脂肪酸含量更高,己糖尤其是半
乳糖的量会减少,这是因为 UDP-半乳糖参与了渗透调节
化合物的合成。盐度还引起的一个显著变化是渗透调节物
α-laminaribose(o-β-D-glucopyranosyl-[1-3]-α-D-glucop-
yranose)量的增加,它在Gotingen株的浓度要低于Austin株
的,这表明Austin株有更高的盐耐性。在5~34mmoL/L的盐
度条件下,棕搁酸的含量增加了 1.7~2.5倍,油酸的含量增
加了 2倍;在盐度为 85mmoL/L时,藻体中的类胡萝卜素,
尤其是叶黄素含量增加了2倍;根据生物量,代谢物质变化
以及藻体适应性,最终得出5~17mmoL/L的盐度范围内较
好[19]。
关于细菌对葡萄藻生长的影响已有部分研究,例如无
菌条件下,化学种 A分别与 Flavobacteriumaquatile、Corynebac-
teriumaquatile、Azotobacterchroococum、Pseudomonasoleovorans共
培养。选择这些微生物基于不同原因,F.aquatile和C.aquatile
是常见的和葡萄藻共培养的菌,A.chroococum能固定氮,P.
oleovorans能降解烃。当对这些培养物进行富 CO2的通气培
养时,只有F.aquatile使藻量和烃量高于无菌培养条件下的,
而P.oleovorans导致藻量和烃量显著降低。其他研究表明,杆
状菌和棒状杆菌多能促进烃的合成,能使烃产量从占干重
的5.6%增加到24.2%[20]。此外,细菌不仅影响藻体烃总量,也
能影响其相对含量,但细菌和藻体合成大量烃的机制没有
必然联系。在CO2缺乏的情况下,细菌呼吸作用产生的CO2
可用于藻体的光合作用,并且试验也已证明,在CO2受限的
混合培养基里培养的藻,其生物量和产烃量都有所增加。不
是所有的细菌种类都能和葡萄藻共培养,原因可能是不能
利用葡萄藻分泌的有机物质作为自身生长的营养成分或者
是对藻体有破坏性的影响。一般情况下,如果合适的细菌种
类与葡萄藻建立稳定的关系,会增加藻体的生物量和烃产
量,避免其他细菌的污染,改善CO2的供应情况。
某些特殊有机物如SC1058(1-N-苯-3-羧基-4-氧代
噌啉)对藻类产烃具有明显抑制效应,但并不影响其基础代
谢。如当SC1058浓度达5mmoL时,葡萄藻胞外烃产量下降
而胞内烃含量增加(胞外长链烃和自由脂酸分别抑制50%~
80%和 95%),但胞内自由脂酸和三酰甘油(TAG)分别增加
4倍和 7倍,可见 SC1058主要通过抑制脂酸向胞外分泌从
而抑制烃合成。
3 葡萄藻的培养方式
批式培养常用于实验室小规模培养和研究,不能用于
生产上烃的大量提取。多种生物反应器可用于微藻的持续
培养,但光渗透性差是一个限制性因素。从这方面考虑,只
有渠道薄平板反应器(thinchannelflatplatephotobioreactors)
以及窄空管状反应器(narowboretubularbioreactors)能够满
足经济的要求,并能获得高的生物量产率,不过这些反应器
往往需要较大的占地面积,这在一定程度上限制了其应
用。泡柱(Bubblecolumns)和气升式生物反应器(airliftreactors)
比起管形装置更紧凑,从而更适合较大规模培养,只是产率
会稍低[16]。相比较而言,泡柱培养比气升式培养对藻体细胞
有更小的水体压力[17],也更实用于对 CO2的大量固定以及
藻烃的合成,在合适的培养条件下,能得到 7kg/m3的生物
量,占干重 50%的烃含量。开放池反应器培养(例如水沟培
养),与密闭无菌容器培养相比,培养条件更难控制,生物量
产率低,容易混入其他藻类,更不能无菌培养。尽管存在这
些问题,但开放池反应器每单位体积能以较低的成本得到
中等水平的比面值,对于提取大量烃来说,可能是最现实可
行的[2]。
固定化培养有利于收集和重复利用藻细胞,并能减轻
水体流动压力对藻体的破坏。海藻胶(硅酸钙)固定的藻细
胞,与对照比,含有更多的叶绿素,具较强的光合活性,并有
效避免了光抑制[16];藻体生长倍增时间由游离细胞的 1.7d
延长为2.5d(由于空间障碍的影响),烃产量增加约 20%。聚
氨基甲酸乙酯泡沫胶包埋的藻体有低的光合活性和产烃
量,这可能是光限制或包埋材料的毒性影响引起的。现成泡
沫吸附的藻体集落较小,更利于烃的回收,但容易引起藻细
胞的流失。纱布固定的藻细胞,相对于其他材料有更高的生
长率、烃产率以及光合活性[2],其大规模生产的实用性有待
于进一步研究。
4 葡萄藻培养可固定CO2和处理污水
作为一种光合自养生物,葡萄藻能固定空气中的 CO2,
将太阳能 3%左右的能量转移到烃类化合物中[39]。藻类烃的
热值范围是 30000KJ/kg和 42000KJ/kg,同样转移 100MW
的热量,燃烧葡萄藻的烃类比起煤,每年能降低CO2的释放
量 1.5×105t。针对这一特点,目前正在致力于提高藻类 CO2
的固定效率以降低空气中的CO2含量。
葡萄藻可在2次处理的生活污水(STS)中正常生长,其
生长率与改良Chu13培养基中相当,烃产量为干重的40%~
53%(Chu13中为58%),并使污水中硝酸盐浓度从7.67mg/L
降到低于0.01mg/L,磷酸盐浓度降低到0.02mg/L。此外,亚
硝酸盐也被利用。生活污水对葡萄藻的持续培养也有研究,
在装 2LSTS的生物反应器中(照度 68μE/m2s,pH值 7.94,
200rpm)进行,通 1%CO2(500mL/min),控制其稀释率为
0.57,能得到每周196mg/L(干重)的生物量,烃含量为 49%,
与在 Chu13中的相当;STS中的氮浓度从 5.5mg/L降到
0.4mg/L,磷浓度从 0.08mg/L降到 0.03mg/L。这些研究表
明,将该藻产烃与处理污水相结合既可提高 CO2的固定效
率,减缓温室效应,又可一定程度上避免水质的富营养化[2]。
5 结语
藻类烃作为可再生性物质能源,其研究开发对减缓能
源短缺和环境保护具有广泛而重要的意义。自 20世纪 70
年代石油危机爆发,藻类烃作为替代能源的研究日益引起
各国的重视,我国在“21世纪议程”中明确提出加速替代石
油的无污染、可再生能源的研究开发。目前的研究多集中在
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!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
(上接第 33页)
实产量分别为 27591.0kg/hm2和 30253.5kg/hm2(见表 2)。
3 结论与讨论
网纹甜瓜坐果节位与植株生长状况、主蔓摘心节位等
管理措施有关,不同品种最适宜的坐果节位也有差异,而春
季大棚立架栽培要取得高产、优质与坐果节位的高低关系
密切。“情网”网纹甜瓜坐果节位试验表明,在播种定植、肥
水管理、整枝理蔓、病虫防治等技术措施一致的基础上,坐
果节位直接影响果实产量、品质和商品性,春季栽培第 11~
13节位与第 8~10节、第 14~16节位坐果相比,第 11~13节
位果实网纹美观、糖分多、产量高、商品性好。因此,“情网”
网纹甜瓜实行春季钢质大棚立架栽培,采取单蔓整枝,每
株坐 1果,主蔓25节处摘心,顶部2条侧蔓任其生长作营养
蔓等主要技术,以第11~13节位坐果最好。
节位∥节
中心糖
度∥%
单果重∥g
小区产
量∥kg
折合产量
kg/hm2
产量位次
8~10节 14.6 1166 37.3 27591.0 3
11~13节 15.1 1292 41.3 30549.0 1
14~16节 14.3 1278 40.9 30253.5 2
注:小区产量为3次重复的平均值。
表2 春季不同坐果节位果实糖度及产量
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
(上接第 34页)
后 2~3年开花结果;丰产,七年生株产达 4.5kg,折合产
量为2227.5kg/hm2,已超过国标早实核桃类型七年生产量
(国标 1125.0kg/hm2);品质优良,壳薄,取仁易,仁色黄白,
饱满,出仁率 55.6%,食味香,无异味,品质达到国标 1级标
准;成熟早,试验7年来,每年果实开始成熟期均为7月20~
28日,可以确定该品种为适宜该地区或相同条件下推广种
植的优良品种。
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园艺博览
生理生化和优化培养条件的摸索阶段。为得到高的生物量
和产烃量,今后的研究重点是高产烃藻株的获得(寻找高产
烃的野生藻株,利用紫外诱变或遗产工程的手段改造现有
藻株)、最优化培养条件的确定、产业化培养模式的实现以
及烃合成机理的研究。
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