全 文 ：重金属对绿球藻硝酸还原酶活性的影响
邱昌恩
(湖北师范学院生命科学学院 ,湖北 黄石　 435002)
摘　要　研究 4种重金属离子(Cu2+、Cd2+、Zn2+、Pb2+)对绿球藻硝酸还原酶(NR)活性的影响。 4种重金属
离子的实验浓度分别为 0.01、0.1、1、 10、50、100、200 mg/L;0.1、 1、 5、10、50、100、 200 mg/L;0.1、1、5、10、50、
100、200 mg/L;0.1、1、10、50、100、200、400 mg/L, BG11培养基作对照。 研究结果表明:Cu2+、Cd2+分别在低
浓度 0.01、0.1 mg/L时 , 便开始抑制硝酸还原酶活性 , 随着 Cu2+、Cd2+浓度增加 , 抑制作用增强 , 酶活性逐渐
降低;当 Cu2+、Cd2+≥10 mg/L时 , NR活性检测不到。当 Zn2+、Pb2+浓度分别低于 0.1mg/L和 50 mg/L时 ,
NR活性随着培养基中 Zn2+、Pb2+浓度的增大逐渐增强;当 Zn2+、Pb2+浓度分别大于 0.1 mg/L和 50 mg/L时 ,
NR活性逐渐降低。结果提示:从 4种重金属离子对 NR活性的影响看 , 绿球藻对 Zn2+、Pb2+耐受力高 , 特别是
Pb2+, 而对 Cu2+、Cd2+的耐受能力要低些。
关键词　绿球藻;硝酸还原酶;重金属离子
中图分类号　X173　　　文献标识码　A　　　文章编号　1005-7021(2008)06-0040-04
EfectsofFourHeavyMetalIonsonNitrate
ReductaseActivityinChlorococcumsp.
QIUChang-en
(Col.ofLifeSci., HubeiNormalUniv., Huangshi435002)
Abstract　TheefectsoffourheavymetalionsCu2+, Cd2+, Zn2+, andPb2+attherespectiveconcentrationof0.01,
0.1, 1, 10, 50, 100, 200 mg/L;0.1, 1, 5, 10, 50, 100, 200 mg/L;0.1, 1, 5, 10, 50, 100, 200 mg/L;and
0.1, 1, 10, 50, 100, 200, 400 mg/Lonnitratereductase(NR)activityinChlorococcumsp.werestudiedwith
BG11 culturemediumasacontrol.TheresultsshowedthatCu2+andCd2+atrespective0.01and0.1mg/Lbeganto
inhibittheNRactivity;withtheincrementofbothconcentration, theinhibitionbecamestrongerandtheNRactivity
reduced.Whenbothconcentrationwere≥10 mg/L, theNRactivitycouldnotbemeasured.Whentheconcentration
ofZn2+andPb2+werelowerthan0.1mg/Land50mg/Lrespectively, theNRactivitygraduallystrengthenedasthe
incrementofbothconcentration.Whenbothconcentrationwerehigherthan0.1mg/Land50mg/Lrespectively, the
NRactivitygradualyreduced.Theresultssuggestedfromtheeffectsoffourheavymetalionsthattheenduranceof
Chlorococcumsp.againstZn2+andPb2+washighespecialyPb2+, whiletheirenduranceagainstCu2+andCd2+was
somehowlow.
Keywords　Chlorococcumsp.;nitratereductase(NR);heavymetalions
　　随着社会的发展 ,人们生活水平的提高 ,重金
属对水环境的污染问题日渐成为全球所关注的重
点问题 ,研究表明 ,重金属污染后对水生生物有不
利影响;重金属不仅可以通过饮用水或生活用水
直接作用于人体 ,也可以富集在鱼类 、虾等水产品
中 ,间接危害人类的身体健康。藻类是水体中的
初级生产者 ,在水生态系统中起着十分重要的作
用 ,重金属污染水体后首当其冲的受害者是藻类
　收稿日期:2008-04-23
　作者简介:邱昌恩　男 ,博士 ,副教授。主要从事藻类生物技术及环境生物学研究。
　项目来源:湖北省教育厅重点项目(D200522005);湖北省教育厅创新团队项目(T200605)
40 微生物学杂志　 2008年 11月第 28卷第 6期　JOURNALOFMICROBIOLOGYNov.2008 Vol.28 No.6
生物。因此反过来 ,利用从污染严重的水体或污
水中筛选出耐受重金属并可去除重金属的藻类 ,
并利用藻类生物技术来治理含重金属污水﹑净化
水环境成为一种值得探索的方法。作者从美国亚
里桑那州一家污水处理厂的污水中分离纯化了一
种绿球藻 , 作者已经对此藻耐受 Cu2 +、Cd2+、
Zn2+、Pb2+四种重金属离子在结构上的适应及某
些生理上的耐受机制进行了研究 ,绿球藻耐受四
种重金属离子胁迫的能力较强 [ 1 ～ 3] 。硝酸还原酶
是氮素代谢过程中的关键酶 ,它将浮游植物所吸
收的氧化态氮化合物转化为还原态的氮 ,进一步
合成氨基酸和蛋白质 ,是影响植物无机营养的特
别重要的一种酶。因此 ,本实验通过研究 Cu2+、
Cd2 +、Zn2+、Pb2+四种重金属离子对绿球藻硝酸
还原酶活性的影响 ,从而在理论上进一步佐证是
否能利用藻类生物技术将绿球藻应用于大规模处
理含 N、P及重金属污染的污水及水体中。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　试验藻种　绿球藻(Chlorococcumsp.)采
自美国亚里桑那州一家污水处理厂 ,应用微藻分
离纯化的方法分离纯化后 ,将 BG11固体培养基
上的纯藻落转接到 BG11液体培养基中 ,置于光
照培养箱中培养 ,培养温度(25±1)℃,培养的光
暗周期为 14∶10(h),光照强度 35 ～ 40 μmol·
m-2·s-1 ,获得足够生物量后用于试验 。
1.1.2　试验仪器　光照培养箱(型号 GP-01),
722S型紫外分光光度计 ,高速冷冻离心机 ,砂芯
过滤装置 ,普通离心机 ,高压灭菌锅 ,无菌操作台。
1.2　方法
1.2.1　Cu2 +、Cd2+、Zn2+、Pb2 +浓度设置和培养
条件　Cu2+、Cd2+、Zn2+、Pb2+四种重金属离子都
设置 7个浓度处理 ,以 BG11为空白对照 。分别
用 CuSO4· 5H2O(AR)、CdCl2· 2.5H2O(AR)、
Pb(NO3)2(AR)、ZnSO4· 7H2O(AR)配制 ,配后
Cu2 +浓度为 0、0.01、0.1、1、10、50、100、200 mg/
L;Cd2+浓度为 0、0.1、1、5、10、50、100、200 mg/L;
Zn2+浓度为 0、0.1、1、5、 10、 50、100、200 mg/L;
Pb2+浓度为 0、0.1、1、10、50、100、200、400 mg/L。
每个实验组 3个重复。配置方法是在 30 mL
5BG11培养基基础上 ,加入不同重金属离子浓度
的母液和不同量的去离子水和等量液体藻种
5 mL,配后总体积 150 mL/瓶 ,结果每个处理都是
在 BG11中培养 。取适量液体藻种在 4 000 r/
min离心 10 min,用 15 mg/LNaHCO3悬浮洗涤 2
次(洗去藻体上附着的培养基),然后对每个实验
组进行等量接种即绿球藻悬浮液 5 mL/瓶 。最后
放入上述光照培养箱中培养 。培养温度(25 ±1)
℃,培养的光暗周期比为 14∶10(h),光照强度
35 ～ 40 μmol·m-2· s-1 ,光周期时每天定时摇动
锥形瓶 4次 ,培养第 10 d用于实验 。
1.2.2　硝酸还原酶(NR)提取及活性测定　培养
第 10 d,每组 3个重复 ,将藻液用 0.45 μm微孔
滤膜进行抽滤 ,得藻体 ,用分析天平称鲜重 ,用液
氮研磨法提取 NR,定容提取酶液至 10 mL,然后
进行 NR活力测定。硝酸还原酶活性测定参考有
关文献 [ 4 , 5]中的方法进行。 NR酶活力以每
30min内 , NO2 -增加 1 μg为 1个酶活力单位
(U)。
1.2.3　统计分析方法　生物统计的单因子方差
分析(ANOVA)以及平均数 LSD多重比较用于检
验本研究指标间的差异。
2　结　果
2.1　Cu2+对绿球藻硝酸还原酶活性的影响
从图 1可以看出 ,当培养基中 Cu2+浓度在
0.01 ～ 1 mg/L时 ,绿球藻硝酸还原酶活性随着
Cu2 +浓度的增加 ,硝酸还原酶活性逐渐下降 ,而
且低于对照组;当 Cu2+浓度达到 1 mg/L时 ,硝酸
还原酶活性开始检测不到 ,随着 Cu2 +浓度继续上
升至实验范围最高浓度 200 mg/L,硝酸还原酶活
性都检测不到。
2.2　Cd2+对绿球藻硝酸还原酶活性的影响
从图 2可以看出 ,培养基中 Cd2+浓度在 0.1
～ 5 mg/L时 ,绿球藻硝酸还原酶活性随着 Cd2+
浓度的增加 ,硝酸还原酶活性逐渐下降 ,而且低于
对照组;当 Cd2 +浓度达到 10 mg/L时 ,硝酸还原
酶活性检测不到 ,随着 Cd2+浓度继续上升至实验
范围最高浓度 200 mg/L,硝酸还原酶活性都检测
不到。
2.3　Zn2 +对绿球藻硝酸还原酶活性的影响
416期　　　　　　　　　　　　　　邱昌恩:重金属对绿球藻硝酸还原酶活性的影响　　　　　
当培养基中 Zn2+浓度为 0.1 mg/L时 ,绿球
藻 NR活性最大;当 Zn2 +浓度大于 0.1 mg/L时 ,
绿球藻 NR活性随培养基中 Zn2 +浓度的增大而逐
渐降低 ,其中 Zn2+浓度大于 10mg/L时 , NR活性
低于对照组(结果见图 3)。
图 1　Cu2+对绿球藻硝酸还原酶活性的影响
Fig.1　TheefectsofdiferentconcentrationsCu2+on
nitratereductaseactivitiesinChlorococuumsp.
矩形图上标有相同字母表示在 0.05水平上差异不显
著 ,矩形图上面标有不同的大 、小写字母表示差异分
别达 0.01、0.05显著水平 ,下图同
图 2　Cd2+对绿球藻硝酸还原酶活性的影响
Fig.2　TheefectsofdiferentconcentrationsCd2+on
nitratereductaseactivitiesinChlorococuumsp.
2.4　Pb2+对绿球藻硝酸还原酶活性的影响
Pb2+浓度在 0 ～ 50 mg/L范围内 ,随着培养
基中 Pb2+浓度增加 ,绿球藻 NR活性逐渐上升;当
到达 100mg/L时 , NR活性急剧下降 ,而且随着
培养基中 Pb2+浓度的增加 ,绿球藻 NR活性逐渐
降低(结果见图 4)。
图 3　Zn2+对绿球藻硝酸还原酶活性的影响
Fig.3　TheefectsofdiferentconcentrationsZn2+on
nitratereductaseactivitiesinChlorococuumsp.
图 4　Pb2+对绿球藻硝酸还原酶活性的影响
Fig.4　TheefectsofdiferentconcentrationsPb2+on
nitratereductaseactivitiesinChlorococuumsp.
3　讨　论
　　硝酸还原酶(NR)是氮素代谢过程中的关键
酶 ,它将浮游植物所吸收的氧化态氮化合物转化
为还原态的氮 ,进一步合成氨基酸和蛋白质 ,硝酸
还原酶的活性受到藻细胞体内生理因素与底物
NO3-的影响 ,并对环境条件 , 如光照 、温度 、CO2
等也十分敏感 。因此 , 研究 4种重金属离子
Cu2 +、Cd2 +、Zn2+、Pb2+胁迫下绿球藻体内硝酸还
原酶活性的变化 ,可以反应绿球藻耐受此 4种重
金属离子的能力 。本研究结果表明 Cu2+、Cd2+分
别在低浓度 0.01、0.1 mg/L时 ,便开始抑制硝酸
还原酶活性 ,随着 Cu2+、Cd2+浓度增加 ,抑制作用
42 　　　　　微　生　物　学　杂　志　　　　　　　　　　　　　　　　　　28卷
增强 ,酶活性逐渐降低;当 Cu2+、Cd2 +≥10 mg/L
时 , NR活性检测不到。国外也有 Cu2 +、Cd2 +抑制
衣藻对硝酸盐的利用和 Cu2 +、Zn2+抑制栅藻 NR
活性的研究[ 6, 7] ;国内崔玮等和张亚平等的研究
结果说明 Cd2 +胁迫可以分别抑制两种豆科植物
幼苗叶片和浮萍叶片的 NR活性[ 8, 9] ;Cd2+胁迫浓
度达 200mg/L时 ,水培烤烟叶片的 NR活性为
零 [ 10] 。说明本研究结果和国内外有关研究结果
相一致 。硝酸还原酶是一种诱导酶 ,硝酸盐是其
诱导物 ,它催化硝酸盐还原为亚硝酸盐 ,钼是其组
成成分 [ 11] 。分析原因可能有二个:Cu2+、Cd2+可
能抑制绿球藻对 NO3-和 Mo2+(BG11培养基中含
Mo2 +)的利用[ 6, 8] ,从而抑制 NR的表达;绿球藻
体内可能也存在金属硫蛋白[ 12]等对 Cu2+、Cd2+
的吸附降低了它们的毒性 ,所以推测 ,在破碎细胞
时 Cu2+、Cd2 +有可能又以游离态的形式游离出
来 ,而抑制被提取出来的硝酸还原酶活性 ,这有待
于进一步考证。当 Zn2+、Pb2+浓度分别低于 0.1
mg/L和 50 mg/L时 , NR活性随着培养基中
Zn2+、Pb2+浓度的增大逐渐增强;当 Zn2 +、Pb2+浓
度分别大于 0.1 mg/L和 50 mg/L时 , NR活性逐
渐降低 。杨艳华的研究结果也说明 Pb2 +浓度在
1 000 mg/L时烤烟叶片 NR活性出现一个低于
正常活性的抗性峰 ,烤烟叶片耐受 Pb2+胁迫的能
力很高。分析原因可能以下 3点:铅离子也可能
在绿球藻细胞膜外形成沉积粒 [ 13] ,因而大大降低
了它的毒性 ,而低浓度时进入绿球藻细胞内的锌
有利于提高硝酸还原酶的活性 ,这可能与锌离子
是大多数酶的活性部位有关[ 14] ;低浓度时 Zn2+、
Pb2+可能诱导 NR的表达;而浓度过高 ,同样会抑
制 NR活性或抑制 NR的表达 。
参考文献:
[ 1] 　QiuCE, KuangQJ, BiYH, etal.ResponseofChlorococ-
cumsp.AZHBtoCopperandCadmiumStress[ J] .Bul.En-
viron.Contam.Toxical, 2006, 77:772-778.
[ 2] 　邱昌恩,毕永红 ,胡征宇.Zn2+胁迫对绿球藻生长 、生理特
性及细胞结构的影响 [ J] .水生生物学报, 2007, 31(4):
503-508.
[ 3] 　邱昌恩 ,胡征宇.Pb2+胁迫对绿球藻(Chlorococcumsp.)的
影响研究 [ J] .武汉植物学研究 , 2007, 259(5):521-526.
[ 4] 　汤章城.现代植物生理学实验指南 [ M] .北京:科学出版
社 , 1999, 152-154.
[ 5] 　李合生.植物生理生化实验原理和技术 [ M] .北京:高等教
育出版社 , 2000, 125-127.
[ 6] 　MosulénS, DomínguezMJ, VigaraJ, etal.Metaltoxicityin
Chlamydomonasreinhardti.Efectonsulfateandnitrateassim-
ilation[ J].BiomolecularEngineering, 2003, 20:199-203.
[ 7] 　BhumiNT, SuryaKM, JaiPG.Recoveryofuptakeandas-
similationofnitrateinScenedesmussp.previouslyexposedtoel-
evatedlevelsofCu2+andZn2+[ J] .J.PlantPhysiol, 2004,
161:543-549.
[ 8] 　崔玮 ,张芬琴 , 金自学.Cd2+处理对两种豆科作物幼苗生
长的影响 [ J] .农业环境科学学报 , 2004, 23(1):60-63.
[ 9] 　张建平 , 陈娟 , 胡一鸿 ,等.镉胁迫对浮萍叶片光合功能的
影响 [ J] .农业环境科学学报 , 2007, 26(6):2 027-2 032.
[ 10] 李荣春.Cd、Pb及其复合污染对烤烟叶片生理生化及细胞
亚显微结构的影响 [ J] .植物生态学报 , 2000, 24(2):238-
242.
[ 11] 潘瑞炽 ,董愚.植物生理学(第 3版)[ M] .北京:高等教育
出版社 , 2000, 53.
[ 12] 戴玲芬 , 高宏 , 夏建荣.雪松聚球藻对重金属镉的抗性和
解毒作用 [ J] .应用与环境生物学报 , 1998, 4(3):192-195.
[ 13] 周宏 , 项斯瑞.重金属铜 、锌 、铅 、镉对小形月芽藻生长及亚
显微结构的影响 [ J] .杭州大学学报 , 1998, 25(2):86-91.
[ 14] 王镜岩 ,朱圣庚 ,徐长法.生物化学(第 3版 ,上册)[ M] .北
京:高等教育出版社 , 2006, 393.
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