全 文 ：DOI:10.13925/j.cnki.gsxb.20160314 
不同氮素形态培养对枳橙幼苗硝酸还原酶活性及相关基因
表达的影响
孙敏红 1,2，卢晓鹏 1，曹雄军 1，李  静 1，熊  江 1，谢深喜 1* 
（1 湖南农业大学园艺园林学院，长沙 410128；2 中南林业科技大学林学院，长沙 410004） 
摘要：【目的】枳橙[Citrus. sinensis(L.) Osbeck×Poncirustrifoliate(L.) Raf]是柑橘的主要砧木。它因具有抗柑
橘衰退病等特性而被大力推广应用。为进一步探讨枳橙对氮素吸收利用机理，为柑橘生产上提高氮素利用
效率和科学施肥提供科学依据。【方法】本试验以枳橙为材料，采用水培方法，在 Hoagland 配方的基础上
进行调节研究了不同形态氮素配比对枳橙幼苗硝酸还原酶（NR）活性变化及相关基因表达量的影响。【结
果】研究结果表明：幼苗叶片及根系 NR 活性均随着培养时间的延长而增加，且叶片 NR 活性高于根系。其
中 2号（NO3-：NH4+=7:3）和 3号（NO3-：NH4+=5:5）处理的叶片酶活最高；1号（NO3-：NH4+=10:0）和
2号（NO3-：NH4+=7:3）处理根系的 NR 活性显著高于其他处理；进一步研究 NR 相关基因表达情况表明：
3 个基因（CisNia1、CisNia2、CisNia OA）在不同处理的枳橙幼苗体内均有表达，其中 CisNia1 和 CisNia2
分别是根系和叶片 NR 相关主效基因，二者均受到 NO3-、NH4+配比诱导，且 3 号处理（NO3-：NH4+=5:5）
下表达量最高。【结论】枳橙幼苗硝态氮代谢的主要部位在叶片，且 CisNia2 是它的主效基因，通过调节
铵硝比例可以促进其表达。
关键词：枳橙、硝态氮、铵态氮、硝酸还原酶
中图分类号：S666.4 文献标志码：A 文章编号：1009‐9980(2017)04‐0001‐08 

Effect of different nitrogen forms on nitrate reductase activity and
relative gene for Citrus sinensis (L.) Osbeck×Poncirus trifoliate (L.)
Raf
SUN Minhong1,2, LU Xiaopeng1, CAO Xiongjun1, LI Jing1, XIONG Jiang1 , XIE Shenxi1
(1 Horticulture and Landscape College, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, Hunan,
China; 2 Forestry College, Central South University of Forestry & Technology, Changsha
410004,Hunan, China)
Abstract:【Objective】 Citrus was one of the main fruit type in the world, and China was the
biggest country in citrus production. Though it was the important fruit tree in south China, the
orchard surrounding was bad. The nutrition deficiency was one of the main physiological disease.
Nitrogen was called“life element”, it plays a significant role in vital movement. At present,
grafted seedlings were used in citrus production, and each stock has different absorb and transport
ability of inorganic nutrient. Thus, it was necessary for studying the nitrogen absorb ability of the
main stock. Citurs. sinensis(L.) Osb×Poncirus trifoliate(L) Raf, the hybrid of trifoliate and sweet
orange, was one of the main stock of Citrus.and it was being used widely because its anti-aging
disease characteristic. NO3- and NH4+ were the main two inorganic nitrogen forms being absorbed
                                                              
收稿日期：2016-10-10 接受日期：2016-12-16
基金项目：现代农业（柑橘）产业技术体系(CARS-027)；国家自然科学基金(31401824)；教育部高校博士
点基金（20134320120006）
作者简介：孙敏红，女，讲师，研究方向为果树生理生态。Tel：13973311219, E-mail：
sunminhongcaddie@126.com
*通信作者 Author for correspondence. E-mail：shenxixie@126.com
网络出版时间：2016-12-28 15:04:25
网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/41.1308.S.20161228.1504.004.html
and utilized by plants. Most plants grow much better under two forms coexistence and have high
nitrogen use efficiency comparing with the one under the single nitrogen resource. But the
influence of nitrogen forms and ratio on Citrus sinensis (L.) Osbeck×Poncirustrifoliate (L.) Raf
nitrogen metabolism mechanism was unknown at present. Nitrate reductase was either induced
enzyme or rate-limiting enzyme of nitrogen absorb and transport, it plays an important role in the
metabolism process. The activity changes were affected by the different nitrogen forms.Therefore,
this research aims to study the nitrate absorption ability and mechanism of Citrus. sinensis(L.)
Osbeck × Poncirustrifoliate (L.) Raf further. Which will provide a scientific basis for improving
nitrogen use efficiency and scientific fertilization in citrus production. 【Methods】 Citrus.
Sinensis (L.) Osbeck × Poncirustrifoliate (L.) Raf, the experiment material, were planted by
hydroponic method with Hoagland nutrient solution and its adjustment solutions as cultivation
medium. Five treatments were set, they were NO1（NO3-：NH4+=10:0）, NO2（NO3-：NH4+=7:3）,
NO3（NO3-：NH4+=5:5）, NO4（NO3-：NH4+=3:7）and NO5（NO3-：NH4+=0:10）. The seedlings
which studied were planted in environmental chamber, and each treatment culture medium was
added 7umol/L C2H4N4 in solution to inhibit nitrate. The pH value of medium were 6 or so,
ventilate time was15min/3h. The different culturing time materials (0d, 20d, 40d, 60d, 80d)was
tested, with the solution adjustments, the effect of different ratio of nitrogen forms on the seedling
nitrate reductase activity and relative genes expression were studied in the experiment.【Results】
The results showed that the activity of seedling of leaves and roots were rising with the
cultivation time going by. Nitrate reductase activity of leaves were higher than roots. The leaves
NR activity of NO2（NO3-：NH4+=7:3）and NO3（NO3-：NH4+=5:5）were higher than others.While
the roots NR activity of NO1（NO3-：NH4+=10:0）and NO2（NO3-：NH4+=7:3）were significantly
higher than the other treatments; Whatever the leaves or roots, the activity of NO4（NO3-：
NH4+=3:7）and NO5（NO3-：NH4+=0:10）were all first raised and then decreased, their NR activities
of the 60d’ seedlings were the best. The treatment of NO5 was the lowest in all treats of 80d.
These were caused by the high NH4+ concentration , and the poison maybe began at 60 days later.
The related NR genes were cloned in many plants, besides in orange genome. Buy the NR genes’
function , especially the effect of different nitrogen forms were not clear in citrus. In this study,
these related NR gens expression amount was then analyzed. The Nia gens analysis showed that
CisNia1、CisNia2、CisNia OA were all tested in all treatments. CisNia1 expression amount of all
treatments were higher than the other two genes in the expression of five treatments, inferring that
it was maybe the main nitrite reductase genes in roots. CisNia2 expression was higher than others,
it maybe the leaves major nitrate reductase genes. CisNia1 and CisNia2 were all induced by the
ratio of NO3- and NH4+, and the highest expression amount appeared in NO3（NO3-：NH4+=5:5). It
means the treatment 3 was suitable for citrus nitrate absorption and metabolism.【Conclusion】
The main nitrate metabolism organ in Citrus. sinensis(L.) Osbeck× Poncirustrifoliate (L.) Raf
seedlings was leaf. CisNia2 was the major gene of leaves, its expression was promoted by the
regulation on the ratio of NO3- and NH4+, By the regulation of the main gene,the nitrogen use
efficiency of citrus could be advanced.

Key words: Citrus. sinensis(L.) Osbeck×Poncirustrifoliate(L.) Raf; Nitrate; Ammonium; Nitrate
reductas
柑橘(Citrus)是世界上重要的果树之一，居各种水果之首，我国柑橘生产位
居世界柑橘生产第一大国且发展迅猛[1、2]。虽然柑橘是我国南方的重要果树，但
大多果园立地条件较差，故缺素已成为其主要生理病害之一。而氮素在植物生命
活动中发挥着极其重要的作用，被称之为“生命元素”[3]。目前经济栽培的柑橘
园中所采用的柑橘苗均是嫁接苗木，且不同砧木对无机养分吸收及转运能力也不
尽相同，因此研究嫁接砧木对氮素的吸收和代谢能力在柑橘生产中起到非常重要
的作用。枳橙[Citurs. sinensis(L.) Osb×Poncirus trifoliate(L) Raf]是柑橘的主要砧
木类型之一，它是枳与甜橙的杂交种，国内外主要推广用于的枳橙是卡里佐
(Carrizo)和特洛亚(Troyer)，皆是华盛顿脐橙和枳杂交而来。此砧木根系发达，耐
寒抗旱，耐瘠薄，生长势较旺，较耐粗放管理，且具有抗柑橘衰退病等特性而近
些年来被大力推广应用。 
植物根部吸收的硝态氮首先在细胞质中由硝酸还原酶和亚硝酸还原酶还原
成铵，后再被谷氨酸合成酶和谷氨酞胺合成酶同化成谷氨酸和谷氨酞胺，形成天
冬氨酸和天冬酞胺，最后形成各种氨基酸和蛋白质用于植物生长发育[4]。硝酸还
原酶(Nitrate reductase, NR)既是氮素吸收、转运的诱导酶,也是限速酶,在氮素代
谢过程中具有关键作用。不同氮素形态会引起氮代谢酶的活性变化[5]，而硝酸还
原酶的活性决定了硝酸盐(无机氮)同化成有机氮化合物的速度,因此它与植物吸
收利用氮素存在密切关系[6]，也可作为作物的营养指标之一[7]。Nia 编码的 NR
是存在于胞质中可溶性的电子转运蛋白。目前 Nia 基因已在菠菜[8]、烟草[9]、拟
南芥[10]、甜菜[11]等植物上已被克隆。在柑橘甜橙二倍体基因组[12]中也可以查找
到多个硝酸还原酶相关基因，但对其功能验证尤其是氮素形态对它们表达量影响
的研究则鲜有报道。本文通过不同氮素形态处理枳橙幼苗，研究不同处理对幼苗
体内硝酸还原酶活性的影响，并从分子生物学角度探讨氮素形态对硝酸还原酶相
关基因表达量的影响，这为研究柑橘砧木氮素代谢机理提供一定的理论依据，也
对柑橘生产中氮肥的合理施用有重要的现实意义。
1. 材料与方法
1.1 试验材料及地点
本试验幼苗培养和硝酸还原酶活性测定在中南林业科技大学林学院人工气
候室和园艺实验室完成，硝酸还原酶相关基因定量表达实验在湖南农业大学柑橘
改良中心进行。选用的卡里佐枳橙种子由中国农业科学院柑橘研究所（重庆）提
供，经 5% NaClO 和 75%乙醇处理后，于垫有纱布的催芽盘中进行恒温催芽，露
白后播于灭菌的蛭石基质中，待幼苗长到 5-7 片新叶时，选取长势相似的植株移
植于 75L Hogland 营养液的黑色塑料箱中，选用黑色 KT 板（600mm×500mm）
为定值定植板，每箱定值约 60 棵幼苗，以标准 Hogland 营养液进行适应性栽培
2 周，后进行不同配方的处理。人工气候室条件为：光照时数 14h/10h，光照强
度 800µmol m-2 s-1;  昼夜温度 22 /18℃ ℃和 75%的相对湿度。 
1.2 试验方法
1.2.1 试验设计及方法
每个处理在 Hoagland 配方的基础上进行调节，营养液中总氮含量：15
mmol.L-1mol/L，其中 NO3-由 Ca(NO3)2、KNO3 和 NH4NO3 提供；NH4+由 NH4NO3、
(NH4)2SO4和 NH4H2PO4提供；1 mmol.L-1 P 由 K2HPO4提供；6 mmol.L-1 K+由 KOH
或 KNO3 提供；4 mmol.L-Ca2+由 Ca (NO3)2或 Ca(OH)2 提供；4mmol.L-1 Mg2+由
MgSO4 提供。根据不同硝态氮和铵态氮浓度共设 5 个处理：分别是处理 1（仅有
NO3-N）；处理 2（NO3-：NH4+=7:3）；处理 3（NO3-：NH4+=5:5）；处理 4 （NO3-：
NH4+=3:7）；处理 5（NH4+-N ）。所有营养液中均添加硝化抑制剂双氰胺(C2H4N4)
7 µmol.L-1 抑制硝化作用，pH 值保持在 6.0 左右，通气时间为 15min.3h-1。取培
养 0d、20 d、40 d、60d 和 80d 的枳橙幼苗，分离根部和叶部，并用液氮速冻后
立刻保存至-80℃冰箱，待用。
1.2.2 硝酸还原酶活性的测定
取培养不同时期的枳橙幼苗，将整株叶片和根系分离，各称取 0.5g 鲜样,用
离体法[13]测定不同部位硝酸还原酶活性。每处理设 3次重复。 
1.2.3 硝酸还原酶相关基因定量表达
1.2.3.1 试验取材及引物设计 
取不同处理培养 80d 的枳橙幼苗，分离根部和叶部，并用液氮速冻后立刻保
存至-80℃冰箱，待用。从甜橙基因组转录组找到已登录的序列，再用 Beacon
designer 设计引物，后送到 BIO-RAD 合成引物。详细基因引物序列见表 1。 
表 1 相对定量表达特异引物序列
Tab.1 Real-time Quantitative PCR Specific Primer Sequences 

1.2.3.2 总 RNA 的提取
取新鲜试材（根或叶）100 mg 左右，迅速放入提前用液氮预冷好的 1.5ml 无
RNAase 管中，并加入适量液氮迅速将材料研磨成粉状，采用 Takara RNAiso plus
试剂盒提取柑橘叶片，根样品的总 RNA，方法参照试剂使用说明书。将提取好
的总 RNA 采用 120v，10min，1%琼脂糖凝胶电泳观察条带，100 bp 的 plus DNA
Ladder 作对照，用 6×Loading buffer 上样，每处理 3 次重复。最后总 RNA 保存
在-80℃冰箱中。
1.2.3.3 cDNA 的合成
将提取的总 RNA 进行去 DNA 处理后，再用 cDNA 逆转录试剂盒 iScript
cDNA Synthesis Kit（Takra 公司提供）合成所需要的 cDNA。Bio-RAD 定量 PCR
仪进行表达量分析，反应体系为 20 μl，包括：Supermix（10.0 μl）+ cDNA 模板
（1.0 μl）+ ddH2O（7.5 μl）+ 上游引物（10 μmolL-1）（0.75 μl）+ 下游引物（10
μmol.L-1L）（0.75 μl）；所加目的基因引物序列见表 1，以 Actin 引物作为内参
引物。荧光定量 PCR 扩增条件为：95℃，30 s→（95℃，5s→58℃，30s）×38→65℃，
5s→95℃，5s→溶解曲线。同一基因每个处理设 3 次重复。
1.2.4 试验数据分析
数据分析与统计使用 Excel 2007 软件，Bio-Rad CFX-Manager (admin)、
SPSS16.0 统计分析数据、用 Beacon designer 软件设计定量引物。 
基因名称 登录号 引物序列
Actin-F CCAATTCTCTCTTGAACCTGTCCTT
Actin-R TGACTGATGAGAACTGCCAGAAG
CisNia1-F
Cs3g19060.1
GCTCAACATAAACTCAGTCATA
CisNia1-R GGAATATGCGTAGCCTCT
CisNIA 2 -F
orange1.1t00436.1
CACAACAAGGCAGAAGATT
CisNIA 2-R CTATAAACGCATCGGTAACAT
CisNIA OA-F
Cs7g16410.2
AACCCAAATGACAAGACAA
CisNIAOA-R GGCTGATTCAACACATAGTA
2. 结果与分析
2.1 不同氮素形态对枳橙幼苗根系硝酸还原酶活性的影响
不同氮素形态处理对枳橙幼苗根系硝酸还原酶活性大小有显著影响，从表 2
中可知，不同处理的枳橙幼苗根系 NR 活性均随着培养时间的延长变化趋势不尽
相同。其中 1 号（NO3-：NH4+=10:0）、2 号（NO3-：NH4+=7:3）和 3 号（NO3-：
NH4+=5:5）处理 NR 活性随着培养时间的延长均持续增加,80d 达到最大值，此时
1 号处理显著高于 3 号处理，但与 2 号处理无显著差异；3 号处理的 NR 活性虽
低于全硝处理但与 2 号处理无显著差异；4号（NO3-：NH4+=3:7）、5号处理（NO3-：
NH4+=10:0）则表现为前期缓慢增加后期急剧下降，均在 60d 时达到最大值，但
均显著低于 1、2、3号处理，80d 时这 2个处理的 NR 活性极显著低于其他处理
但二者间无显著差异。这说明高浓度的 NO3-的营养对枳橙幼苗根系 NR 酶活有
一定的促进作用，且 1号处理和 2号影响最为显著；高浓度 NH4+处理（4号和 5
号）的 NRA 在培养前期有一定的活性，60d 后急剧下降；这与高比例的铵态氮
离子导致根系发生毒害作用致使植株生长减弱有关，且这种毒害现象从培养 60d
后开始逐渐显现。
表 2 枳橙根系硝酸还原酶活性[μg.g-1.h-1]
Table 2. The Nitrate reductase activity of the roots of C. sinensis(L.) Osb×Poncirus trifoliate(L)
Raf[μg.g-1.h-1]
处理/天数（d） 0 20 40 60 80
1 号处理
NO3-:NH4+=10:0
5.64±0.18 6.14±0.59b 9.60±0.59b 12.15±0.71a 13.81±0.59a
2 号
NO3-:NH4+=7:3
5.64±0.18 8.61±0.59a 9.16±0.59bc 11.29±1.06b 13.61±1.07ab
3 号
NO3-:NH4+=5:5
5.64±0.18 6.65±0.83b 10.66±1.13a 12.15±0.12a 12.78±1.06b
4 号
NO3-:NH4+=3:7
5.64±0.18 6.45±0.36b 8.65±0.08c 9.12±0.59c 2.79±0.48c
5 号
NO3-:NH4+=0:10
5.64±0.18 4.56±0.23d 6.52±0.48d 8.30±0.23d 2.10±0.24c
注：表中数据为 3次重复的均值±标准差，采用 LSD 多重比较在同一测定时间的数据在 5%水平上做显著性
检测，字母不同表示有显著差异。
Note: The data in the table are the average of three repeats after treating±SD.. Based on result of LSD’s multiple
comparisons test on the data of same time, the data with different letters indicate significant differences at 5%
level. 
2.2 不同氮素形态对枳橙幼苗叶片硝酸还原酶活性的影响
不同氮素形态对枳橙幼苗叶片 NR 活性变化的影响从表 3 中可知，随着培养
时间的延长，不同处理的幼苗叶片 NR 活性均呈现不同程度的增加。其中 1号、
2号和 3号处理 NR 活性随着培养时间的延长持续增加,80d 达到最大值，此时 2
号、3 号处理显著大于其他处理；4 号和 5 号处理则表现为 NR 活性先增加后降
低，均在 60d 时达到最大值后下降,80d 时全铵处理最低。这说明较高浓度的 NO3-
营养对幼苗叶片 NR 酶活有一定的促进作用，又以 2 号和 3 号处理最为显著；较
高浓度 NH4+处理（4号和 5号）在培养期对 NR 有一定的促进作用，但 60d 后活
性下降，这与对根系的研究趋势相同，可能是高比例的 NH4+先导致根系发生毒
害作用致使植株生长减弱有关，从而影响叶片 NR 活性，且毒害现象从培养 60d
后开始逐渐显现。
表 3 枳橙叶片硝酸还原酶活性 [μg.g-1.h-1]
Table 3.The Nitrate reductase activity of the leaves of C. sinensis(L.) Osb×Poncirus trifoliate(L)
Raf [μg.g-1.h-1]
处理/天数（d） 0 20 40 60 80
1 号处理
NO3-:NH4+=10:0
5.70±0.21 4.56±0.24c 6.37±0.35c 10.66±0.59c 20.77±0.25b
2 号
NO3-:NH4+=7:3
5.70±0.21 8.18±0.35a 18.96±0.59a 20.22±0.95a 29.89±0.24a
3 号
NO3-:NH4+=5:5
5.70±0.21 8.22±0.24a 10.19±0.47b 17.35±1.06b 29.81±0.59a
4 号
NO3-:NH4+=3:7
5.70±0.21 5.66±0.23b 9.75±0.59b 19.23±0.47a 9.28±0.59c
5 号
NO3-:NH4+=0:10
5.70±0.21 5.03±0.24c 9.88±0.47b 16.83±0.59b 6.11±0.24d
注：表中数据为 3 次重复的均值±标准差，采用 LSD 多重比较同一测定时间的数据在 5%水平上做显著性检
测，字母不同表示有显著差异。 
Note: The data in the table are the average of three repeats after treating±SD. Based on result of LSD’s multiple
comparisons test on the data of same time, the data with different letters indicate significant differences at 5%
level.
2.3 不同氮素形态对枳橙根系 CisNia1、CisNia2、CisNia OA 相对表达量的影响
从图 1 可以看出,不同处理的枳橙幼苗根系中，硝酸还原酶相关的 3 个基因
CisNia1、CisNia2、CisNia OA 均有表达。其中 CisNia1 的表达量变化为随着营养
液中 NH4+比例的增加，基因表达量先增加后降低，3 号处理的表达量最高，其
次是 2 号和 4 号处理；该基因表达量在 1 号和 5 号处理之间无显著差异，但显著
低于其他处理；CisNia2 表达量在各处理中的变化趋势同 CisNia1 基因基本相同，
均是 3 号处理最高，其次是 2 号和 1 号处理，5 号处理最小。这说明一定比例
NO3-、NH4+配施诱导了 CisNia1、CisNia2 在根系中的表达。

















注：图 1，图 2 中数据为 3 次重复的平均值，数据在 5%水平上采用 LSD 多重比较显著性检测，字母不同
表示有显著差异。 
Note: The data in the picture 1 and 2 are the average of three repeats after treating. Based on result of LSD’s
multiple comparisons test on the data , the data with different letters indicate significant differences at 5% level. 
CisNia OA 在各处理中的表达量随着 NH4+比例的增加略有降低，5 号全铵处
理与 4 号处理之间无显著差异，但显著低于 1 号，2 号和 3 号处理，这说明 NH4+
抑制该基因在枳橙根系中的表达。3个硝酸还原酶相关基因中，CisNia1 在幼苗
根系中的表达量显著高于其他基因，由此推断该基因主要受到氮素形态配比的调
控。
2.4 不同氮素形态对枳橙叶片 CisNia1、CisNia2、CisNiaOA 相对表达量的影响
从图 2可以看出,不同处理的枳橙幼苗叶片中，硝酸还原酶 3个基因CisNia1、
CisNia2、CisNia OA 均有表达，且表达趋势基本一致，即随着营养液中 NH4+比
例的增加，基因表达量表现为先增加后降低。其中 CisNia2 在各处理中的表达量
图 2 不同氮素形态处理对枳橙叶片 CisNia1、CisNIA 2、
CisNia OA 的相对表达量的影响 
(1Y-5Y：处理 1-5 幼苗叶片） 
Fig1. Effect of Different Nitrogen Forms on the Relative
expression of CisNia1、CisNIA 2、CisNia OA in leaves (B)
of C. sinensis(L.) Osb×Poncirus trifoliate(L) Raf
(1Y-5Y：the plant leaves of Treat1-5）
图 1 不同氮素形态处理对枳橙根系 CisNia1、CisNIA 2、
CisNia OA 的相对表达量的影响 
（1G-5G：处理 1-5 幼苗根系） 
Fig1. Effect of Different Nitrogen Forms on the Relative
expression of CisNia1、CisNIA 2、CisNia OA in rootsof C.
sinensis(L.) Osb×Poncirus trifoliate(L) Raf
(1G-5G：the plant root of Treat1-5）
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Cis Nia1 Cis Nia OA Cis Nia2
1Y
2Y
3Y
4Y
5Y
b e
b
a
c
d
d
b
a
c eb
a
b c
0
2
4
6
8
Cis Nia1 Cis Nia OA Cis Nia2
1G
2G
3G
4G
5G
c d
d
b
a
c
d
a b b
a
b c cd d
显著高于其他基因，说明该基因主要受到铵硝比例诱导，各处理排序为 3 号>2
号>4 号>5 号>1 号。CisNia1 基因同样是 3 号处理表达量最高，5 号最低，其他
几个处理无显著差异。CisNia OA 表达量表现为：3 号> 2 号>4 号>1 号>5 号处理，
这说明一定比例铵硝配施诱导了枳橙幼苗叶片硝酸还原酶相关基因 CisNia1、
CisNia2、CisNIA OA 的表达，且 3 号处理下这 3 个基因的表达量均显著高于其他
处理。
3. 讨论
3.1 不同氮素形态对枳橙幼苗硝酸还原酶活性的影响
在植物体内,硝酸还原酶（NR）主要存在于根和叶部细胞的胞质中,少部分可
能存在于生物膜上,如叶绿体外膜等[14]。影响 NR 活性的因素有很多，不同氮素
形态处理会引起该酶活性的显著变化，但研究结果不尽相同。在小麦[15]、菠菜[16]、
水稻[17]等植物上的研究表明两种氮素营养共存时的 NR 活性比单一 NO3-营养高，
氮素代谢强，其活性也随 NH4+比例的增加而降低。但 Gashaw 等[18]研究认为：
NH4+对 NR 活性既有促进又有抑制,如陈煜等[14]认为全硝营养显著增加大豆 NR
活性，混合培养次之，全铵最差；而胡润芳等[19]在大豆上的研究刚好相反即认
为全铵培养对大豆叶片 NR 活性效果显著好于混合氮素处理和全硝培养。李宪利
等[20]（1997）研究表明：NO3-能显著提高 NRA，但高浓度的 NH4+对 NR 也无抑
制作用。
本试验的研究结果表明，不同氮素形态对枳橙幼苗叶片和根系的 NR 活性影
响显著，二者变化趋势基本一致，均表现为一定比例 NH4+的氮素营养对 NR 活
性的促进效果好于单一态氮营养，高浓度 NH4+处理（4 号和 5 号）在培养前期
对 NR 活性有一定的促进作用，后期则产生抑制；单一氮素营养中，全硝处理
NR 活性显著大于全铵培养，2 号处理（NO3-：NH4+=5:5）、3 号处理（NO3-：
NH4+=5:5）叶片和根系 NR 活性均显著高于其他处理，这与以往许多报道结果相
似[21]。
本研究还发现：各处理后期叶片 NR 活性均高于根系，这是因为大部分植物
吸收的 NO3-中，90%是在叶片被还原和同化所致[22]。因此根系中 NO3-主要通过
木质部运输至叶片进行同化，虽然导致叶片硝酸盐含量增加，但同时叶片较高的
NR 活性又可有效的降低叶片硝酸盐积累。故高浓度的硝态氮施用并不会造成果
树叶片硝酸盐积累。 
3.2 不同氮素形态对枳橙幼苗硝酸还原酶相关基因表达量的影响
硝酸还原酶相关基因的表达受到众多因子的调控,如 NO3- [23]、谷氨酰胺[24]、
NO2-[25]、碳代谢产物[26]等。其中 NO3-对 NR 的调控研究较多如拟南介[27]、玉米
[28]、油菜[29]等,均认为 NO3-能诱导植物硝酸还原酶的表达。曹云等[30] (2007)在水
稻上的研究认为混合氮素营养既增加 NR 活性又增强了 NR 基因的表达,促进水
稻对 NO3-的同化利用,进一步增加了氮素在植株叶片的积累同化。
植物体内通常有多个硝酸还原酶基因。目前 NR 的相关基因主要有 2个，即
Nia1 和 Nia2，前者受 NADH 的特异性诱导表达，后者的表达以 NAD(P)H 为底
物[31]。不同的 NR 基因对植物硝酸还原酶活性的贡献率不一样。Wilkinson 等[32]
的研究表明：拟南介的 Nia1 和 Nia2 对叶片硝酸还原酶活性的贡献分别为 10%和
90%。本实验用定量分析检测也有相似结果，不同氮素形态处理枳橙幼苗对
CisNia1、CisNia2、CisNia OA 表达量的影响时发现,根系中 CisNia1 的表达量高
于其他两个基因，说明在枳橙幼苗根系体内,CisNia1 可能是硝酸还原酶相关基因
中的主效基因，且受到不同氮素形态配比调控。而叶片则表现为 CisNia2 的表达
量高于其他两个基因，即叶片硝酸还原酶的主效基因是 CisNia2。无论是叶片或
是根系均表现为一定浓度铵硝配比溶液可以促进 NR 基因的表达，其中以 3 号处
理（NO3-：NH4+=5:5）为最高。
4. 结论
  本试验中，枳橙幼苗根系硝酸还原酶活性显著高于叶片，说明硝态氮代谢
的主要部位在叶片，对 3 个相关基因的定量表达分析可知，CisNia2 是叶片的主
效基因，而 CisNia1 可能是根系硝酸还原酶相关基因中的主效基因，且都可通过
调节铵硝比例可以促进其表达。 
    近年来从分子水平上研究硝酸还原酶的调节机制已成为氮代谢研究中的热
点。本章研究了不同氮素形态处理下枳橙幼苗 NR 活性的变化特点，并通过对
NR 相关基因序列设计引物，进一步研究这些基因的表达特性,旨在了解枳橙 NR
调节表达机制,为后续通过基因工程手段提高柑橘 NR 活性研究打下基础。
 

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