全 文 ：生命科学仪器 2011 第9卷/8月刊
研究简报
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摘要 用褐藻酸钙对小新月菱形藻进行固定化培养实验，测定不同胶粒大小、胶珠密度、CaCl2浓度及不同接种量对该
藻的影响，比较了自由化生长与固定化细胞的生长曲线。小新月菱形藻在褐藻酸钙凝胶中仍具有呼吸和光合作用的能
力。球径为3.5mm，CaCl2浓度为2%时，细胞生长快，每50mL培养液中加入200个胶珠时细胞生长量大，接种量不能低
于104个细胞/mL。与游离的小新月菱形藻相比，固定化小新月菱形藻生长慢，但生长周期长。
关键词 小新月菱形藻；固定化；生长
小新月菱形藻固定化培养初步研究
陈书秀1 王虎2
（1 山东东方海洋集团有限公司 山东烟台 264003 2 烟台海融生物技术有限公司 山东烟台 265600）
作者简介
陈书秀（1983—），女，硕士，主要从事微藻生理生化研究，邮箱：chenshuxiu124@163.com。
小新月菱形藻(Nitzschia closterium f.minutissima)
俗称“小硅藻”，是我国较早培养和应用的单胞藻
饵料，其个体小，繁殖快，脂肪含量高，环境适应
能力强，可作为理想的保健食品，在海水养殖业中
占有重要地位。目前小新月菱形藻主要采用继代法
来进行保存，该方法由于数次接种容易导致藻种污
染或者藻种的遗传漂变，近几年固定化藻类的研究
正在迅速发展，在能源生产、污水处理和种质保存
等领域有很大的应用前景，尤其是在保重和次级代
谢产物的生产方面，引人瞩目[1]。本文研究了固定化
条件对小新月菱形藻生长的影响。
1 材料与方法
1.1实验材料：小新月菱形藻(Nitzschia closterium
f.minutissima)
1.2试验步骤：
1.2.1载体的制备：称取海藻酸钠3g，在开水浴中慢
慢搅动(约1h)溶人100 mL蒸馏水中，配成3％
(W/V)的凝胶溶液，加人2gNaC1，煮沸消毒备
用。以凝胶溶液与鲜藻体积比为4：1的比例接
种藻种，充分搅匀后制成胶～藻混悬液，用注
射器吸取混悬液，滴入CaC12 溶液中，约30min
后形成固化的海藻酸钙胶珠。用消毒海水洗涤
3遍后，按各试验的要求培养于100mL的三角烧
瓶(50mLf/2培养液)中。
1.2.2 实验设计
1 .2 .2 . 1 胶珠直径试验：在实验室无菌条件
下，将藻细胞与3%海藻酸钠以体积比1:4混合，在
2％CaC12溶液中用不同型号的注射器针头4.5#、
6#、7#分别制备不同直径的胶珠。藻接种密度为
1.74×105cells/mL，胶珠粒数为200粒，培养液体积
为50mL。每组设3个平行。
1.2.2.2接种密度试验：在实验室无菌条件下，分
别将不同密度的藻细胞与海藻酸钠混合，在2％CaC12
溶液中利用6#针头制备成胶珠，粒数为200个，培养
液体积为50mL。最终密度为1.75×103、1.75×104、
1.75×105、1.75×106，每组设3个平行进行培养。实
验开始后每隔4d测定其细胞密度。并在此期间定期观
察了各组间的差异。
1.2.2.3 CaC l2浓度试验 分别配制1％、2％、
3％、4％CaC12溶液，灭菌备用。在无菌条件下，
将一定密度的微藻藻液与海藻酸钠混合（体积比为
1:4），用6#注射器针头，分别滴入不同浓度的CaC12
溶液中形成胶珠，胶珠个数为200个，用消毒海水
洗涤3遍后，培养于100mL的三角烧瓶(50mL培养液)
中，每组设3个平行。
1.2.2.4 胶珠密度试验：胶珠密度定义为相同的
藻初始接种总密度，相同培养液(体积l00mL)中，三
角瓶中胶珠的数量。将海藻酸钠一微藻混合液用6#
针头滴于2％的CaC12溶液制备成胶珠，分别设有数
量为100、200粒、300粒的固定化组，每组设3个平
行进行培养。
2 结果与讨论
固定化小新月菱形藻培养4天后在小球内形成气
泡，部分胶球上浮，8天左右小球颜色为褐色，球内
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形成菌落，小球大部分沉到瓶底。
2.1 胶球直径对固定化细胞生长的影响（见图1）
从图1可以看出，开始时6#针头制作的胶球细
胞生长较快，8d后4.5#针头制作的胶球细胞开始迅
速增长。可能由于4.5#针头制作的胶珠个体小，若
制作相同数量的胶珠，最初单位体积内接种的细胞
量相对较少，从而导致了较长的延缓期。但从总的
生长趋势来看，针头越小，胶珠直径越小，细胞的
生长量越大。胶珠直径越大，所产生的扩散传质阻
力越大，胶珠内细胞所需营养不足，积累的代谢产
物增多，细胞生长环境恶化，同时胶珠内部的光照
不足[2]，所以这些不利条件使得大直径的固定化小
新月菱形藻生长受阻，又因胶珠越小，制备速度越
慢，一般选用6#针头。24天时更换培养液，藻细胞
继续生长。
2.2 接种量对固定化细胞生长的影响（见表1）
从表1可以看出，接种量越大，其生长量越大。
但从生长率来看，初始接种量低于104个细胞/mL或
高于105个细胞/mL时，生长率较低。所以在对小新
月菱形藻进行固定化培养时初始接种量最好控制在
104-105个细胞/mL。
2.3 CaCl2浓度对固定化细胞生长的影响
为获得处于固定化状态的微藻，首先应保证
固定化胶珠本身具有一定的强度，力粒度和孔隙度
等，以防止固定化胶珠散落，同时保证微藻生长过
程中底物和代谢物及时进出胶珠，维持微藻处于较
好的生长条件[3]。从表2可以初步看出，CaCl2浓度较
低时，细胞生长率较高，其中2%的浓度组高于1%的
浓度组生长率。
2.4 胶珠密度对固定化细胞生长的影响
从表3可以看出，胶珠密度越小，细胞生长率
越高，其中200粒/50mL的实验组稍高于100粒/50mL
实验组的生长率。当胶球密度过高时，培养液中的
营养盐消耗较快，胶珠之间遮光严重，使得光照不
足，从而引起藻细胞衰老和死亡[4]。胶珠密度过低则
使其对外界环境的变化比较敏感，细胞易受损伤，
生长速率较慢[4]。从本实验结果来看小新月菱形藻固
定化培养时的最佳胶珠密度为200粒/50mL。
2.5 固定化培养与自由化培养比较
采用6#针头，2%CaC l2，在含50mL培养液的
100mL三角瓶中放置200个胶珠，小新月菱形藻有较
好的生长速率，按此条件将小新月菱形藻进行固定
化培养，比较游离和固定化的小新月菱形藻的生长
情况，如图2表明，游离生长的速率明显高于固定化
细胞的生长速率，但固定化的细胞生长周期长。细
胞固定化后，生长较缓慢，可能是营养物质和光线
进入胶珠收到一定程度的影响所阻碍的缘故[1]，但在
实验周期内，一直处于不断的生长阶段，表明固定
A
培养天数
0 5 10 15 20 25 30
细
胞
密
度
(×
细
胞
密
度
(×
10
4 c
el
ls/
m
L
)
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
4.5#
6#
7#
图 1 胶珠大小对固定化小新月菱形藻生长的影响
表1 不同接种量对固定化小新月菱形藻细胞生长的影响
表2 CaCl2浓度对固定化小新月菱形藻细胞生长的影响
表3 胶珠密度对固定化小新月菱形藻细胞生长的影响
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化小新月菱形藻具有较长的生长周期，有利于进行
种质保存。
综上所述，胶粒大小、不同接种量、CaCl2浓
培养天数
0 5 10 15 20 25 30
细
胞
密
度
(×
细
胞
密
度
(×
10
4 c
el
ls/
m
L)
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
自 由化培养
固定 化培养
图 2 小新月菱形藻自由生长与固定化细胞的生长曲线
度及胶珠密度对小新月菱形藻固定化细胞产生了显
著的影响，选择适宜条件可以提高生长速率及生长
量。通过对自由化细胞及固定化细胞生长曲线的比
较，小新月菱形藻可以采用固定化细胞的方式进行
保存，保存时间的长短还需要进一步的实验验证。
参考文献
[1] 张继红，马志珍. 三角褐指藻固定化培养的初步研究[J].
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[2] 李英敏，杨海波，张欣华等. 叉鞭金藻固定化培养的初
步研究[J]. 生物学杂志，19（6）：25-27.
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分变化[J]. 中国水产科学，2010,17（2）：274-280.
Study on the immobilization culture of marine microalga
Nitzschia closterium f.minutissima
Chen Shuxiu1 Wang Hu2
(1 Shangdong Oriental Ocean Group CO.LTD.，Yantai 264003；
2 Yantai Hairong Biology Technology Co. Ltd，Yantai，265600)
Abstract Nitzschia closterium f.minutissima was immobilized in alginate beads. The effects of different immobilized con-
ditons on the growth of the algae were tested.Among the immobilized conditions including the bead size, density, the con-
centration of CaCl2 and initial incoculation,the optimal immlbilized conditions for facilitating the growth of Nitzschia clo-
sterium f.minutissima were detemined. The growth curves of free living cells and immobilized cells were compared. The
results showed that immobilized cells still had the ability of photosynthesis and respiration. The cells growth was largest
when the cell density of microalga was more than 1×104cells/mL, the concentration of CaCl2 2%, the heads’diameter
was 3.5 mm and 200 beads were added to 50 mL liquid culture medium. Compared with the free Nitzschia closterium
f.minutissima, the immlbilized Nitzschia closterium f.minutissima had slower growth rate, but longer growth period.
Keywords Nitzschia closterium f.minutissima；Immobilization；Growth