全 文 ：不同光照条件对小新月菱形藻和等鞭金藻 8701生长及生化成分的影响
石　娟 ,潘克厚
(中国海洋大学 水产学院 , 海水养殖教育部重点实验室 , 山东 青岛 266003)
摘要:研究了小新月菱形藻(Nitzschia closterium f.minutissima)(MACC/ B228)和等鞭金藻 8701(Isochrysis galbana
Parke 8701)(MACC/ H060)在 4种光照条件下的生长情况 ,以及不同光强下 、不同时期收获的藻细胞中总脂和碳水化合
物含量的变化。结果表明 , 小新月菱形藻在光强 70μmol·s-1·m-2时细胞分裂频率(μ)最大 , 最适光强70～ 140 μmol·s-1
·m-2;260 μmol·s-1·m-2光强能导致细胞分裂频率变慢 ,指数期缩短。等鞭金藻 8701在光强 140 μmol·s-1·m-2时μ值
最大 , 260 μmol·s-1·m-2下略有降低。 2种藻均在低光下脂肪含量多 ,小新月和等鞭金藻脂肪含量分别占干重的 25.5%
～ 35.3%和 28.3%～ 37.5%;而碳水化合物含量少 , 分别占干重的 5.5%～ 18.2%、3.9%～ 11.4%;在高光强下相反。
不考虑光照条件的影响 , 2种藻细胞内碳水化合物的含量均在静止期达到最大 ,分别占干重的 18.98%和23.32%。小新
月菱形藻在 70 μmol·s-1·m-2光强下的指数期细胞有最大的脂肪含量 , 等鞭金藻的最高脂肪含量出现于光强 20 μmol·
s-1·m-2下指数末期的细胞中。二者在光强 140μmol·s-1·m-2下生长且进入静止期时均可获得较大生物量 , 同时细胞
的脂肪和碳水化合物的含量也处于较高水平。
关键词:小新月菱形藻;等鞭金藻 8701;光强;总脂;碳水化合物
中图分类号:Q949.2　　文献标识码:A　　文章编号:1005-8737-(2004)02-0121-08
收稿日期:2003-08-11;　修订日期:2003-11-21.
基金项目:山东省科技攻关项目(022110104);青岛市科技攻关项目(02-2-KJ-YJ-26).
作者简介:石　娟(1979-),女 ,硕士研究生 ,从事海洋微藻生理及分子生物学研究.E-mail:sjcjp@sina.com
通讯作者:潘克厚.E-mail:khpan@mail.ouc.edu.cn
　　海洋微藻作为优良的天然饵料被广泛应用于水
产养殖 ,是多种软体动物 、甲壳类幼体和浮游动物
(如轮虫)的主要食源 [ 1-3]。微藻的饵料价值与许多因
素有关 ,包括细胞大小 、细胞壁的可消化程度和细胞
内容物的生化组成[ 4] ,尤以后者最为重要 [ 5-6]。很早就
有人注意到环境因子的改变对微藻生长及生化成分
的影响[ 7-8] ,后续研究相继阐述了各种微藻在不同
的培养基配方[ 9-10] 、不同的培养方式[ 11-12]以及不
同的 温 度[ 13-15] 、光 强[ 16-19] 、通 气 量[ 20] 、 盐
度[ 21-22] 、pH[ 23] 、光周期[ 24] 和光质[ 25] 下细胞内生
化成分的变化。
新月菱形藻和等鞭金藻因富含多不饱和脂肪酸
EPA 、DHA 而在水产养殖中广泛应用 ,是多种养殖
生物的优良饵料 。先前的研究认为不饱和脂肪酸的
含量是影响微藻饵料价值的最主要因子 ,但总脂和
碳水化合物作为供能物质 ,对养殖生物的生长发育
同样起决定作用[ 26] 。本研究以青岛近海分离出的
两种海洋单胞藻 -小新月菱形藻(Nitzschia
closterium f. minutissima)和 等 鞭 金 藻 8701
(Isochrysis galbana Parke 8701)为研究对象 ,研究不
同光照条件对藻细胞生长繁殖的影响 ,以及不同光
强下 、不同时期收获的藻细胞中总脂和碳水化合物
含量的变化 。这 2种藻藻体微小 ,而且都是低温生
态类型 ,特别适合我国北方海水养殖动物育苗前期
的饵料培养。本研究旨为优化其培养条件 ,获得产
量及营养价值均较高的微藻提供参考 。
1　材料与方法
1.1　材料
2种藻均取自中国海洋大学水产学院微藻种质
库(MACC),为纯种培养。小新月菱形藻(Bacillario-
phyceae, 硅藻纲)编号为 MACC/B228 , 等鞭金藻
8701(Prymmesiophyceae ,普林藻纲)编号为 MACC/
H060 。
1.2　方法
1.2.1　培养与收获　培养用海水为青岛近海自然
海水 ,盐度 31 , pH 8.1 ,海水经脱脂棉过滤 ,烧开灭
菌 。藻种先接入 1 000 mL 三角瓶中不充气培养 ,每
瓶约 600 mL ,培养条件见表 1 ,每天摇瓶数次 。
第 1 1卷 第 2 期
2 0 0 4 年 3 月
中 国 水 产 科 学
Journal of Fishery Sciences of China
Vol.11 　No.2
March 　 2 0 0 4
表 1　两种藻的培养条件
Table 1　Culture conditions of two species of microalga
藻类名称
Species
培养基 Medium
体积 Volume/ L 配方 Formula
盐度
Salinity
温度/ ℃
Tem perature
初始 pH
Ini tiated pH
是否充气
Aerat ion
光强/(μmol·s-1·m-2)
Light intensi ty
小新月菱形藻
Nitz schia closterium
f.minut issima
0.6L
2L
f/ 2[ 27] ;N 、P 、Si加倍
f/ 2;N 、P、Si加倍
31[ 29]
31
21±1
21±1
8.1
7.3±0.2
No
Yes
40
＊
等鞭金藻 8701
Isochrysis galbana
Parke 8701
0.6L
2L
f/ 2;N、P 加倍[ 28]
f/ 2;N 、P加倍
25[ 30]
25
21±1
21±1
8.1
7.3±0.2
No
Yes
40
＊
＊:指设 4组 ,光照强度分别为 20 、70 、140 、260μmol·s-1·m-2.
＊:Four groups.T he light intensit ies are 20 , 70 , 140 and 260μmol·s-1·m -2 , respectively.
　　培养到指数生长期的藻接入容积为 3 L 的三角
瓶中 ,瓶内盛有 1.8 L 培养液 ,每瓶倒入藻液 200
mL ,按 1∶10的比例接种 。培养条件见表 1。
光照条件:使用国产 40 W 日光灯管 ,通过增减
日光灯管的数目和调整三角瓶与日光灯管的距离来
确定每组的光照强度 ,测量值为三角瓶瓶底中心位
置的光强 。4组光强分别为 20 、70 、140和 260 μmol
·s-1·m-2 ,持续光照 24 h。每种藻每组设 3 个重
复。
培养的藻每日取样用血球计数板计数 ,分别在
其指数期 、指数末期和静止期收获(表 2)。先取藻
液测干重 ,其余离心 ,小新月菱形藻 4 ℃,离心速率
3 500 g ,5 min;等鞭金藻 8701 4 ℃,离心速率 2 000
g ,5 min ,去上清 ,用浓度为 0.5 mol/L 的甲酸胺重
悬浮细胞 ,洗掉多余盐分 ,再离心 ,彻底除上清 ,细胞
沉淀转入称量瓶 ,立即冷冻干燥 ,干藻粉置于-20
℃保存待生化成分分析(1星期内)。
表 2　两种藻的收获时间
Table 2　Harvested time of two microalga
收获时间
Harvested t ime
小新月菱形藻
Nitz schia closterium f.minut issima
No.1 No.2 No.3 No.4
等鞭金藻 8701
Isochrysis galbana Parke 8701
No.1 No.2 No.3 No.4
指数期 Exponent ial phase/ d 4 4 4 4 4 4 4 4
指数末 Late exponent ial phase/ d 8 6 6 6 8 6 6 6
静止期 S tationary phase/ d 10 10 10 10 11 11 11 11
注:No.1～ No.4光照强度分别为 20 、70 、140 、260μmol·s-1·m-2.
Note:The ligh t intensi ties are 20 , 70 , 140 and 260μmol·s-1·m-2 , respectively.
1.2.2　干重　各 2×100 mL 藻液离心 ,除上清 , 0.
5 mol/L 甲酸胺洗掉剩余盐分 ,再离心 , 5 000 g , 10
min ,彻底去上清 ,无菌去离子水重悬浮细胞沉淀 ,
转入预先烘干(80 ℃,20 h)称重的 Eppendorf管 , 80
℃,24 h ,再称重。
1.2.3　总脂　20 mg 干藻粉用氯仿-甲醇-水(体
积比 5∶10∶4),反复提取(5×5 mL),直到提取液无
色。离心(5 000 g ,5 min),合并上层溶液 ,加入氯仿
-水(体积比 1∶1),使最终的溶剂体积比为 1∶1∶
0.9 ,静置分层。液体分为上部的水-甲醇层和下部
的氯仿层[ 31] 。
移出上层液体 ,氯仿层在氮气保护下转入特制
的预先烘干(80 ℃, 6 h)称重的薄壁小旋转蒸发瓶
中 ,用真空旋转蒸发仪蒸干氯仿 ,再称重。
1.2.4　碳水化合物　提取总脂后剩余的水-甲醇
层先浓缩至原体积的一半 ,去离子水定容至 10 mL ,
用改良的苯酚-硫酸法[ 32]测糖(单糖和寡糖)含量。
总脂提取后剩余的藻粉残渣真空干燥 ,转入旋盖试
管 ,加 5 mL 浓度为 0.5 mol/L 硫酸 ,100 ℃下水解4
h ,冷却至室温 ,离心(5 000 g , 5 min)。上清液用改
良的苯酚-硫酸法测定糖含量(多糖)[ 31] 。藻细胞
的碳水化合物含量等于 2个测定值之和。
122 中 国 水 产 科 学 第 11 卷
2　结果
2.1　生长情况
小新月菱形藻和等鞭金藻 8701 在弱光(20
μmol·s-1·m-2)下 ,细胞分裂频率(μ)[ 34]显著低于
其他 3组(表 3),但其指数生长期并未因此延长 ,所
以在进入静止期时细胞数目明显低于其他组(图 1 ,
图 2)。
表 3　不同光照条件下微藻的生长
Table 3　Growth of microalgae at different light intensity
藻　　名
Species
微藻细胞分裂频率μ(24h)＊ Cell division rate μ(24h)＊
20μmol·s-1·m-2 70μmol·s-1·m-2 140μmol·s-1·m-2 260μmol·s-1·m-2
小新月菱形藻 Nitz schia closterium f.minut issima 0.262±0.012a 0.392±0.014c 0.367±0.026bc 0.347±0.002b
等鞭金藻 8701 Isochrysis galbana Parke 8701 0.245±0.012a 0.359±0.004b 0.412±0.004c 0.407±0.012c
＊数据经方差分析和 Duncan多重比较,同一行中标有不同字母的数值之间差异显著(P <0.05).
＊All data w ere subjected to one-w ay ANOVA and Duncan s multiple range test s.Values wi th di fferent let ters w ithin the same line are signif icant ly
dif ferent f rom each other(P<0.05).
　　表 3显示 ,小新月菱形藻在光强 70 μmol·s-1·
m-2下生长时 μ最大(平均 0.39),最适光强 70 ～
140 μmol·s-1·m-2 ,更高的光强反而使细胞分裂变
慢。而且在高光下 ,指数生长期缩短 ,细胞老化加
快 ,特别是进入静止期后藻细胞的悬浮能力变差 ,有
活力的藻细胞所占比例明显低于 70 μmol·s-1·m-2
下生长的藻(图 1)。
图 1　不同光照条件下小新月菱形藻生长曲线
Fig.1　The growth curves of N.closterium f.minutissima
under different light intensities
　　与小新月菱形藻不同 ,等鞭金藻 8701能耐受很
高的光强 , 140 μmol·s-1·m-2时具有最大的 μ值
(0.41),260μmol·s-1·m-2时分裂频率仅略有降低
(表 3),估计其饱和光照条件当在 200 μmol·s-1·
m-2以上 ,而且在高光条件下细胞没有明显的老化
现象 ,所以最终可达到很高的细胞密度(3.07×107
～ 3.22×107 mL-1)(图 2)。
2.2　干重
光强 70 μmol·s-1·m-2以上时 ,小新月菱形藻
的藻细胞干重均为静止期>指数期>指数末期;在
各生长期 ,藻细胞干重均随光强增加而增加 ,特别是
进入静止期后更为明显。在光强 20 μmol·s-1·m-2
弱光下不同生长期的藻细胞干重变化不大 。260
μmol·s-1·m-2光照强度下进入静止期的小新月菱
形藻细胞干重达到最大值 ,平均 64.98 pg cell-1(图
3A)。
等鞭金藻 8701在前 2组光照条件下细胞干重
为静止期>指数末期>指数期 ,而后两组为静止期
>指数期>指数末期。20 μmol·s-1·m-2下生长
图 2　不同光照条件下等鞭金藻 8701 生长曲线
Fig.2　Growth curves of I .galbana Parke 8701 under differ-
ent light intensities
123第 2 期 石　娟等:不同光照条件对小新月菱形藻和等鞭金藻 8701 生长及生化成分的影响
且进入静止期后 , 藻细胞干重达到最大值 , 平均
58.51 pg·cell-1(图 4A)。
　图 3　不同光强和生长期下小新月菱形藻的细胞干重
(pg·cell-1和生物量(μg·mL-1)
Fig.3 　Cell dry weight and biomass of N.closterium f.
minutissima at different light intensities and stages
of growth
2.3　生物量
生物量(μg·mL-1)由单个细胞干重×每毫升细
胞数得到 。小新月菱形藻的生物量在整个生长周期
中均随光照强度的增加而增加(图 3B);等鞭金藻
8701在前 3组光强下与小新月菱形藻相似 ,但是当
光强更高时 ,生物量反而有所下降 ,见图 4B 。在同
一光强下 , 2种藻的生物量均为静止期>指数末期
>指数期。260 μmol·s-1·m-2光强下生长且进入
静止期的小新月菱形藻有最大的生物量 ,平均1 077
μg·mL-1;而等鞭金藻 8701 则在 140 μmol·s-1·
m-2光强下进入静止期后生物量有最大值 ,平均
989 μg·mL-1 。
　图 4　不同光强和生长期下等鞭金藻 8701 的细胞干重
(pg·cell-1和生物量(μg·mL-1)
Fig.4　Cell dry weight and biomass of I .galbana Parke 8701
at different light intensities and stages of growth
2.4　总脂及碳水化合物
小新月菱形藻在相对低的光强下(20 μmol·s-1
·m-2 、70μmol·s-1·m-2)脂肪含量多 ,可达 25.5%
～ 35.25%DW ,而碳水化合物含量少 ,除 70 μmol·
s-1·m-2静止期的为 18.19%DW 外 ,其余均在 5.
53%～ 7.42%DW;高光强下(140 μmol·s-1·m-2 ,
260μmol·s-1·m -2)则相反 ,脂肪含量减少 ,为 15.
5%～ 24.25% DW ,碳水化合物的含量增加 ,为 6.
5%～ 18.98%DW ,见图 5。进入静止期的藻细胞
总脂含量与指数末期相比变化不大 ,在其生长的适
宜光强下(70 μmol·s-1·m-2 , 140 μmol·s-1·m-2)
脂肪含量 、碳水化合物含量略有上升 ,分别为 27.
5%※28.75% DW 、21.25%※24.25% DW 。70
μmol·s-1·m-2光强下指数期的藻细胞脂肪含量最
高 ,为35.25%DW ,见图5A 。如不考虑光照条件的
影响 ,藻细胞内碳水化合物的含量为:静止期>指数
124 中 国 水 产 科 学 第 11 卷
末期>指数期 ,最大为 18.98%DW(图 5B)。
图 5　不同光强和生长期下小新月菱形藻的总脂和碳水化
合物含量
Fig.5　Percentages (dry weight basis)of total lipid and car-
bohydrate in N.closterium f.minutissima at different
light intensities and stages of growth
　　与小新月菱形藻相似 ,等鞭金藻 8701在指数末
期和静止期也表现出低光强下(20 μmol·s-1·m-2 、
70 μmol·s-1·m-2)细胞内含有较多的脂类(28.
25%～ 37.5%DW)和较少的碳水化合物(除 70
μmol·s-1·m-2静止期的为 11.37%DW 外 ,其余均
在 3.98%～ 5.99% DW);而在高光强下相反(图
6)。且进入静止期后 ,在最低及最高光强下脂肪含
量减少 , 分别为 37%※33.25%DW 、29.25%※
23.25%DW ,而在适宜光强下脂肪含量增加 ,分别
为28.25%※33.5%DW 、26.25%※31%DW 。20
μmol·s-1·m-2光强下生长且处于指数末期的藻细
胞具有最大的脂肪含量(37%DW ,图 6A)。碳水化
合物的含量除第 1 组变化不明显外 ,其他 3组均为
静止期明显高于指数期和指数末期 , 并在静止期
140 μmol·s-1 ·m-2光强的藻细胞中达到最大
23.32%DW 。如不考虑生长期 ,则随光强升高 ,碳
水化合物含量增加 ,但是当光强超过其饱和光强时 ,
碳水化合物的含量有所下降 ,如图 6B所示 。
图 6　不同光强和生长期下等鞭金藻 8701 的总脂和碳水化
合物含量
Fig.6　Percentages(dry weight basis)of total lipid and car-
bohydrate in I .galbana Parke 8701 at different light
intensities and stages of growth
3　讨论
光是单胞藻培养中影响其生长的最重要的因子
之一 。在适光范围内 ,增加光照强度可使光合作用
速度加快 ,细胞分裂速率达到最高值时的光照强度
称最适光强或饱和光强 。超过饱和光强后光和作用
减弱甚至受抑制[ 29 ,33] 。有资料表明 ,高光强下叶绿
素 a和类胡萝卜素的含量明显减少[ 35] ,藻对光的利
用效率降低 ,细胞分裂变慢 。
在本研究所设的光照条件下 ,小新月菱形藻的
光饱和点较低 ,140 μmol·s-1·m-2时即出现光抑制
现象(表 3),且高光强下倾向于提前进入静止期 ,见
图 1。等鞭金藻 8701细胞分裂频率(μ)随光强增加
而加快 ,在 140 μmol·s-1·m-2时是 20 μmol·s-1·
125第 2 期 石　娟等:不同光照条件对小新月菱形藻和等鞭金藻 8701 生长及生化成分的影响
m-2时的 1.7倍 , 260 μmol·s-1·m-2时藻细胞的分
裂频率虽出现下降趋势 ,但仍维持在较高水平(表
3),而且高光下没有提前进入静止期的迹象(图 2),
其饱和光强当在 200 μmol·s-1·m-2以上 , 比原
种[ 51]更能耐受高光。相似的结果出现在周汝伦
等[ 30]的研究中。
不同光强对细胞内主要的生化成分也有一定影
响。本研究中 ,在较低的光强下 , 2种藻的脂肪含量
多而碳水化合物含量少 ,在较高光强下则相反 ,且光
对碳水化合物的变化较脂类更为显著(图 5 、图 6)。
在对其他饵料微藻的研究中得到了相似的结
果[ 18 , 33 ,36] 。这种变化也许跟细胞内参与光和作用
的细胞器的变化有关 。已知甘油脂是类囊体膜的主
要组分 ,可与色素蛋白复合体结合 。甘油脂的相对
数量与细胞的光合活力密切相关[ 18] 。低光条件下 ,
为了增加光吸收和光的利用效率 ,类囊体膜的表面
积及其上色素蛋白复合体的数量均有 所增
加[ 37-38] ,膜脂及光和色素的合成速率维持在较高
水平。而当光强超过饱和光强时 ,细胞内光和器的
含量减少 , 光的吸收能力和利用效率随之下
降[ 37 , 39] ,膜脂合成速率较低 ,而多糖和三酰甘油等
储能物质的合成能力增加 ,细胞内碳水化合物含量
显著增高而总脂含量变化不大[ 18] 。
在相同光强下 , 2种藻静止期的培养物比指数
期的含有更多碳水化合物 , 这与球等鞭金藻
(Isochrysis galbana TK1)[ 15] 、盐生拟微绿球藻
(Nannochloropsis salina)和陆慈尔巴夫藻(Pav lova
lutheri)[ 40]的相关研究结果相似。对于光合自养的
微藻 ,在营养丰富的培养基中 ,细胞消耗碳水化合物
以满足快速生长和分裂的需要 。当培养基中某一种
或多种营养元素含量减少并成为限制性因素时 ,细
胞分裂变慢 ,此时更多的光同化碳进入到碳水化合
物或脂肪中[ 41-42] 。研究表明氮限制能够诱导藻细
胞进入静止期[ 43] ,在氮限制下 ,氨基酸合成受抑制 ,
蛋白质含量减少 ,碳水化合物和脂类含量增加 ,出现
能量积累的趋势[ 20 ,36 , 44-46] 。当把静止期的培养物
移入营养丰富的培养基中时 ,在一个短暂的延迟期
后 ,细胞内碳水化合物含量与指数期培养物的含量
相似[ 12] 。
本研究中也发现了静止期细胞内脂肪的积累 ,
但是这种现象只发生在光强为 70 μmol·s-1·m-2和
140 μmol·s-1·m-2时的培养物中 ,总的来说脂肪含
量随生长期变化不显著 ,这与 Dunstan[ 12] 、Sukenik
等[ 47] 、Harrison等[ 48] 、 Zhu等[ 15]的研究结果相似。
有报道表明 , 室内培养的新月菱形藻(Nitzschia
closterium)和球等鞭金藻(I.galbana)脂肪含量分
别在 13% ～ 20% DW[ 31 , 49] 和 10% ～ 28%
DW[ 11 , 50] , 均较本研究所选用的小新月菱形藻
(15.5%～ 35.25%,DW)和等鞭金藻 8701(23.25%
～ 37.5%DW)含量低 ,说明在适宜条件下培养可获
得高于原种的总脂含量 。
总之 ,由本研究的结果可知 ,小新月菱形藻在光
强 70 ～ 140 μmol·s-1·m-2 、等鞭金藻 8701在光强
140μmol·s-1·m-2下生长时均可获得较大的生物
量 ,同时细胞内脂肪和碳水化合物的含量也处于较
高水平 。是否此时饵料效果最好还需要进一步的实
验证实 。
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Nitzschia closterium f.minutissima and Isochrysis galbana Parke 8701
SHI Juan ,PAN Ke-hou
(College o f F isheries , Ocean University of China , Qingdao 266003 , China)
Abstract:Tw o marine microalg ae Nitzschia closterium f.minutissima(MACC/B228)and Isochrysis gal-
bana Parke 8701(MACC/H060), both isolated f rom the sea area near Qingdao , were cultured at four irra-
diance levels(20 , 70 , 140 , and 260 μmol·s-1·m-2), and harvested in the exponential , late exponential
and stationary grow th phases.The effects of i rradiance level on cell division rate (μ)and the inf luence of
light intensity and g row th phase on the gross biochemical composition , w ith emphasis on the to tal lipid and
carbohydrate , were examined.N .closterium f.minutissima had the highest μat the light intensity of
70 μmol·s-1·m-2 and its optimum light intensity is 70-140μmol·s-1·m-2.At the intensi ty of 260μmol
·s-1·m-2 , the comparative slow cell division and shorter exponential g row th phase were caused.I .gal-
bana Parke 8701 had the highest μat 140μmol·s-1·m-2 , and it could reach a very high cell density even
at 260 μmol·s-1·m-2 , though that w as near its photoinhibiting light intensity w hen μslight ly decreased.
Both of the microalgae had mo re lipid and less carbohydrate at low er irradiance , while contained less lipid
and more carbohydrate at higher irradiance.Carbohydrate accumulated in the stationary grow th phase and
its content increased w ith the increasing light intensity reg ardless of the grow th phase.The highest lipid
contents of N .closterium f .minutissima and I .galbana Parke 8701 w ere found at the exponential
phase at 70μmol·s-1·m-2 and at the late exponential phase at 20μmol·s-1·m-2 , respect ively .The high-
est carbohydrate contents of these tw o microalga were found at stationary phase at 140 μmol·s-1·m-2.
Both of them could reach a higher value of biomass at stationary phase at 140 μmol·s-1·m-2.Under the
same condition , thei r cellular lipid and carbohydrate w ere also in higher level.
Key words:Nitzschia closterium f .minut issima;Isochrysis galbana Parke 8701;light intensity;lipid;
carbohydrate
Corresponding author:PAN Ke-hou.E-mail:khpan@mail.ouc.edu.cn
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