全 文 ：高浓度 NO 对小新月菱形藻生长影响的初步研究
张正斌 , 皇华伟 , 刘春颖 , 刘莲生
(中国海洋大学海洋化学研究所 , 山东 青岛 266003)
摘　要:　以小新月菱形藻为实验对象 , 从化学角度研究了加入高浓度一氧化氮(nitric o xide, NO)对其生长的影响。结果表
明:(1)一次性加入不同浓度 NO 时 , 1.4 μmol/ L NO 对微藻生长有促进作用;7 , 14 , 28 和 42 μmol/ L 的 NO对微藻生长起抑
制作用 ,并且 NO浓度越大 , 抑制作用越明显。(2)每天一次加入不同浓度 NO时 , 1.4 ～ 42 μmol/ L 的NO 对微藻生长起不同
程度的抑制作用 ,且微藻生长周期缩短。藻的生长曲线由 S 型变成峰型;加入 42 μmol/ L NO , 在 100 h 内完全抑制了微藻的
生长。(3)通过进一步检测外加 NO在藻液中的浓度变化 , 结果表明采用 2 种不同加入方式时 , 1.4 μmol/ L NO 对藻生长分
别起促进和抑制作用 ,这是由于 NO 的不断衰变造成的。
关键词:　NO;抑制作用;影响;小新月菱形藻
中图法分类号:　P734.2　　　　　　文献标识码:　A　　　　　　文章编号:　1672-5174(2007)04-647-06
　　自 1987年生物体内源一氧化氮(NO)合成机制被
发现及其生理特征得到证实以来[ 1-2] , NO引起了科学
界的广泛关注。1992年 NO因其独特的生物活性被美
国《科学》杂志评为该年度的“年度分子” 。1998年 , Ig-
narro 、Murad和 Furchgot t由于发现 NO 是心血管系统
的 1种信号分子的杰出研究 ,因此荣获了诺贝尔生理/
医学奖 。NO在生物体中发挥着独特而多样性的功能 ,
因此成为生物化学 、生理学 、病理和药理学等领域的研
究热点和前沿课题之一。近年来 ,NO在海洋浮游植物
体系中的研究也引起了海洋科学家的关注 , 张正斌
等[ 3]研究了 NO对微藻生长影响的规律和化学特征 ,
发现不同浓度的 NO对微藻的生长分别起促进或抑制
作用 ,并提出两种“NO 阈”的观点 ,即一种是促进微藻
生长的阈值 ,约为 nmol级甚至更低 ,另一种抑制微藻
生长的阈值 ,为μmol级或更大 。张正斌等[ 4]还分别在
实验室微藻培养体系和大亚湾大型海水池的藻类养殖
生态系中 ,在微藻生长达到最大值之前检测到 NO ,并
首次测定了海洋生态系中 NO浓度的日变化曲线。
目前 ,关于外源低浓度 NO 对生物体系的促进作
用所做研究较多[ 3-7] ,而外源高浓度 NO对微藻生长影
响的研究 ,特别是对“高浓度 NO”阈值的影响规律和机
理 ,及其与“低浓度”NO 阈值的差异的研究还不够深
入。因此开展高浓度 NO 对海洋微藻作用规律的研
究 ,有助于了解 NO对海洋浮游植物的作用机制 ,也可
能为赤潮消亡机理提供新的思路 。
1　实验部分
1.1 仪器装置
(1)光学显微镜(Nikon ALPHAPHOT YS , Japan),配
合血球计数板用于测量藻细胞密度。
(2)全自动电子分析天平(Sarto rius ,北京),精确度为
0.1 mg 。
(3)7230型可见分光光度计(上海精密科学仪器有限
公司 ,上海)。
(4)HPG-280B型光照培养箱(哈尔滨市东联电子技术
开发有限公司 ,哈尔滨)。
(5)pH 计(Fisher Scientif ic ,USA)。
(6)85-2 型恒温加热搅拌器:国华电器有限公司 ,青
岛。
(7)在 ISO-NO M ark ⅡNO测定仪(World precision in-
struments(WPI), Inc., Sarasota , USA)上利用计时电
流法检测 NO 。NO测定仪的信号通过 DUO18 数据获
取系统(WPI , Inc., Sarasota , USA)转化到 PentiumⅢ
计算机上 。
(8) ISO-NOPMC NO 微芯片传感器(WPI , Inc.,
USA ,2005.5):ISO-NOPMC 是三电极体系 ,包括工作
电极碳微电极 、Ag/AgCl参比电极和铂辅助电极 。
1.2 NO 饱和溶液的制备[ 8]及加入方式
在17 mL 的小玻璃瓶中加入 10 mL 用石英蒸馏器

通讯作者:E-mail:roseliu@ouc.edu.cn
基金项目:国家自然科学基金(40076020, 40376020);国家自然科学重大基金项目(40490263);国家十五重点基础研究发展计划项目
(2001CB409703);教育部博士点基金(20030423007)资助
收稿日期:2006-09-19;修订日期:2007-04-04
作者简介:张正斌(1935～ 2007-04),教授 ,博导。
　 第 37卷　第 4期 　
2007年 7月　
中 国 海 洋 大 学 学 报
PERIODICAL OF OCEAN UNIVERSIT Y OF CHINA
37(4):647～ 652
July , 2007
二次蒸馏的高纯水 ,通高纯度氮气(99.999%)以除氧 ,
通氮气的时间为 30 min ,再通入纯 NO(99.9%)气体 ,
30 min 后达到饱和 ,其浓度为 1.4×10-3 mol/ L。此饱
和溶液一般可保留 3 h ,在无光 、密封无氧 、冷藏条件下
曾稳定保存 8 h 。
1.3 微藻的培养
实验选用小新月菱形藻(Nitzschia closterium f .
minut issima),由中国海洋大学微藻中心提供。在 f/2
培养液中进行培养 ,达到指数生长期便可作为藻种进
行接种 。用来培养微藻的海水采自青岛鲁迅公园涨潮
时(盐度约为 32.00),经 0.45 μm 醋酸纤维滤膜过滤 、
煮沸消毒 ,待冷却后充分摇动以恢复溶解气体含量 ,分
别按 f/2 、f/10和 f/20 3种配方加入营养物质 ,配制成
相应的培养液 ,调节 pH 值为 8.10±0.05 后待用。培
养器皿为经高压灭菌的 250 mL三角烧瓶 ,每个瓶中加
入150 mL 培养液后 ,按 3∶1的比例(150 mL 培养液:
50 mL 藻液)加入藻液 ,置于光照箱中静置培养。培养
条件为:明暗周期为 14∶10(L/D);光照方式:日光灯;
光照强度约 8 000 lx;温度为(20±0.5)℃。每 3 h 摇
瓶 1次 ,以保持藻液中的溶解气体含量。连续定时取
样测定。每组实验重复 2次。
在具体的藻培养实验按一次性加入和每天定时加入
1次2种加入方式进行。在接种微藻之后 ,立即用微量注
射器加入一定体积的NO饱和溶液 ,使培养液中NO的起
始浓度分别为 0(对照样),1.4 ,7 ,14 ,28 ,42μmol/L。
1.4 测定方法
1.4.1藻细胞密度测定 　　光密度值的测定:以接种
时刻为初始时间 ,以后每次取出 8.00 mL藻液 ,立即加
入 15%(V/V)的福尔马林溶液固定 ,在 7230G 型可见
分光光度计上测定此混合物的吸光值。以蒸馏水为空
白 ,比色皿厚度为 3 cm ,在 500 nm 波长下测定。
藻细胞密度的测定:将不同吸光值的微藻液根据
具体情况进行适当的稀释 ,取 5.00 mL 充分摇匀的藻
液 ,加入 2.50 mL 15%(V/V)的福尔马林溶液固定 ,然
后取一滴藻液置于血球计数板上 ,在光学显微镜(Nikon ,
Japan)下对藻细胞进行计数。每个样品做 2个平行样 ,
取其平均值 ,然后换算成相应的藻细胞密度(藻细胞密
度=藻数×104个/cm3)。实验发现藻细胞密度与其光
密度值(OD)存在良好的线性关系[ 3 ,7-8] 。作培养时间
(h)与藻细胞密度的关系图 ,得到不同条件下藻的生长
曲线 。
1.4.2 外加 NO在藻液中的浓度变化[ 9 , 10] 　　在 ISO-
NO M ark ⅡNO测定仪上利用计时电流法检测 NO(检
出限为 4.2×10-10mol/L ,相对标准偏差为 6.30 ×
10
-3)。NO 测定仪的信号通过 DUO18数据获取系统
转化到 Pentium Ⅲ计算机上 。
1.5 统计方法
采用 t检验 ,在 0.05水平测定 2组平均值间的显
著性差异 。
2　结果与讨论
2.1 外源高浓度 NO对小新月菱形藻生长的影响
2.1.1 一次性加入不同浓度 NO下 ,小新月菱形藻的生
长曲线　　按照 1.3中微藻的培养方式对小新月菱形
藻进行培养实验 ,观察一次性加入不同浓度(1.4 ～ 42
μmol/ L)NO对小新月菱形藻生长的影响情况 ,所得实
验结果如图 1所示 。从图中可以看出 ,无论在f/2 , f/10
还是在 f/20培养液中 ,(1)1.4 μmol/ L NO 对小新月
菱形藻的生长表现出一定的促进作用。(2)7 ～ 28
μmol/L NO对微藻的生长起不同程度的抑制作用 ,并
且 NO浓度越大 ,抑制作用越强 。(3)42 μmol/L NO
对微藻生长的抑制作用最为显著(P <0.05)。当加入
NO浓度>14 μmol/L ,小新月菱形藻的生长受到的明
显抑制 ,使微藻生长周期缩短 ,甚至完全停止生长 、死
亡。比较图 1(a)与(b),(c)可以看出 ,在实验的时间范
围内微藻的生长后期不存在生长最大值 ,生长曲线持
续增大 ,说明在不同的配方中 ,NO 对微藻生长的影响
是不同的 ,这可能是在 f/2中所含营养盐浓度较高所
致。在 f/20培养液中 , 42μmol/L NO对藻的生长抑制
作用相比于另 2种配方较弱 ,此现象还需进一步研究 。
图 1　一次性加入不同浓度 NO 下 ,小新月菱形藻的生长曲线
Fig.1　The grow th curves of Nitzschia closterium f.minutissima in media to which NO in different concentrations was added only once
(a)在 f/ 2中 ,小新月菱形藻的生长曲线;(b)在 f/ 10中 ,小新月菱形藻的生长曲线;(c)在 f/ 20中 ,小新月菱形藻的生长曲线
(a)f/ 2 media;(b)f/10 media;(c)f/ 20 media
648 中　国　海　洋　大　学　学　报 2 0 0 7 年
　　藻的生长状况不仅与 NO浓度有关 ,还与培养液中
营养盐水平密切相关[ 11-14] 。图 2是分别在 f/2 , f/10 ,
f/20 ,f/50培养液配方中一次性加入 1.4 μmol/L NO
时 ,小新月菱形藻的生长曲线 。从实验结果来看 ,同样
是加入 1.4 μmol/L 的 NO ,在 f/2配方中不仅微藻的
生长速率明显大于其它配方 ,而且反映终止生物量的
藻细胞密度最大 ,相应的指数生长期也最长。
图 2　一次性加入 1.4 μmol/ L 的 NO 时小新月菱形藻
在不同的配方中的生长曲线
Fig.2　The grow th curves of Nitzschia closterium f.minutissima in
different media when 1.4×10-6 mol·L-1of NO was added only once
2.1.2每天 1次加入不同浓度 NO下 ,小新月菱形藻的
生长曲线　　按照 1.3中微藻的培养方式对小新月菱
形藻进行培养实验 ,观察每天 1次加入不同浓度(1.4
～ 42 μmol/L)NO对小新月菱形藻生长的影响情况 ,实
验结果如图 3(a ～ c)所示。从图中可以看出 , 在 f/2 、
f/10和 f/20培养液中每天加入一次不同浓度的 NO ,对
小新月菱形藻的生长均有抑制作用 ,并且加入 NO 浓
度越大 ,抑制作用越强;42μmol/L NO在 100 h内完全
抑制了微藻的生长 , 产生毒性作用 , 这与抑制 “NO
阈”[ 3]的观点基本一致 。比较图 3(a), (b)和(c)还发
现 ,同样是每天加入1次 14μmol的 NO , f/2培养液中
在 120 h后藻细胞密度开始下降 ,而在 f/10和 f/20培
养液中则分别是 96和 72 h。可见每天加入 1次不同
浓度的 NO 时 ,培养液中的营养盐水平越低 ,微藻的生
长越容易被抑制。
仔细观察在不同培养液中小新月菱形藻的生长曲
线发现:微藻的生长曲线随加入 NO 浓度的增大而发
生改变 ,由 S型转变为峰型( ),甚至水平直线型。
这组峰型曲线有如下特征:(1)加入 NO浓度越大 ,微
藻的生长曲线的峰值越小。如在图 3(a)中 ,加入 14 ,
28和 42 μmol/L NO后 ,微藻生长的峰值分别是 294×
104 , 117×104和 62×104 cell·cm-3 。(2)加入 NO 浓度
越大 ,峰值出现的时间越早。如图 3(a)所示 ,分别每天
加入一次 14 ,28和 42 μmol/L NO ,相应各组微藻生长
曲线的峰值分别在第 24 , 72和 120 h出现 。比较图 3
(a)～ (c),还可以看出峰型曲线的数目以 f/20 中最多 ,
f/10中次之 , f/2中最少。这表明在给定 NO浓度条件
下 ,随着营养盐浓度的降低 , NO所起的作用越来越明
显 ,出现峰型曲线的数目也愈多。
图 3　每天一次加入不同 NO浓度下 , 小新月菱形藻的生长曲线
Fig.3　The grow th curves of Nitzschia closterium f.minutissima in media to which NO in different concentrations was added once a day
(a)在 f/ 2中 ,小新月菱形藻的生长曲线;(b)在 f/ 10中 ,小新月菱形藻的生长曲线;(c)在 f/ 20中 ,小新月菱形藻的生长曲线
(a)in f/ 2 media;(b)in f/ 10 media;(c)in f/ 20 media
2.2 一次性加入 1.4μmol/L NO下 ,NO在小新月菱形
藻藻液中的衰变曲线
对比上述 2 种不同加入方式发现 ,同样加入 1.4
μmol/L NO ,为什么分别对微藻生长起促进和抑制作
用?为解释此现象 ,作者在小新月菱形藻培养过程中
加入 1.4 μmol/L NO ,同时监测藻液中 NO 浓度和藻
细胞密度变化 ,以不添加 NO 的作为对照样 ,每 5 h测
定 1次 ,实验结果如图 4所示。从图中可以看出 ,在藻
液中 NO浓度越高衰变越快 ,随着 NO浓度的降低 ,其
衰变速率逐渐减慢 ,这与文献报道是一致的[ 15] 。由图
4还可以看出 ,刚开始加入 1.4 μmol/L NO ,对小新月
菱形藻生长起抑制作用 ,藻细胞密度低于对照样;随着
6494期 张正斌 ,等:高浓度 NO对小新月菱形藻生长影响的初步研究
NO浓度的不断减小 ,对微藻的生长逐渐起促进作用 ,
当 NO 浓度减小到 10-8 ～ 10-9mol/ L 时 ,添加 NO 组
的藻密度迅速增加 ,一直呈指数增长的趋势 ,并且在 20
h后超过对照样 。因此 ,一次性加入 1.4 μmol/ L NO ,
首先对藻生长起高浓度下的抑制作用 ,随着藻液中 NO
浓度由 μmol级不断衰减到 nmol级 ,又对藻生长起低
浓度下的促进作用 ,从整体上来看促进作用大于抑制
作用;而每天加入 1次1.4 μmol/L NO时 ,高浓度 NO
对微藻生长的抑制作用处于支配地位。
图4　NO在小新月菱形藻藻液中的衰变以及藻细胞密度的变化
Fig.4　NO decline in algae solution and the algae grow th
curves w ith/without NO adding
2.3 多次加入 1.4μmol/L 的 NO ,小新月菱形藻的生长
曲线
每 12 h加入 1次 1.4 μmol/ L NO ,同时每 2 h 测
定藻液中藻细胞密度和 NO 浓度变化 ,所得实验结果
见图 5。结果发现 ,小新月菱形藻的生长为曲线呈台阶
型。当向藻液中加入 1.4 μmol/L 的 NO时 ,藻细胞密
度基本保持不变。随着藻液中 NO 浓度的不断衰减 ,
藻细胞密度开始增加 ,当藻液中 NO 浓度衰变到 10-8
～ 10-9mol/ L 时 ,藻细胞生长速率才明显加快;当 12 h
后再加入 1.4μmol/L NO 时 ,藻细胞密度再次几乎保
持不变 ,随着藻液中 NO浓度的衰变 ,藻细胞的增殖速
度又开始加快。
藻细胞生长的台阶型曲线与可能加入 NO的浓度
有一定关系 。在刚加入 1.4 μmol/L NO时 ,在高浓度
“NO 阈值”范围内 ,所以起初抑制了藻细胞的生长。但
是随着 NO 浓度衰变到促进微藻生长的低浓度“NO 阈
值”范围内 ,藻生长速率加快 ,藻细胞数目明显增加。
小新月菱形藻生长的台阶型曲线可能是 NO对浮游植
物生长的两个“阈值”作用的体现。但这仅仅对 NO 作
用下微藻生长曲线呈台阶型的 1个推测 。众所周知 ,
在微藻正常生长的过程中 ,藻细胞分裂速率随着温度
和昼夜等外界环境改变而发生变化 ,藻细胞密度也能
出现台阶型上升的趋势 ,而本文实验中所出现的台阶
型曲线是通过加入外源高浓度 NO 所得到的 。因此 ,
对于多次加入 NO与小新月菱形藻生长的台阶型曲线
之间的关系 ,还需要进一步的研究 。
图 5　NO 在藻液中衰变曲线及相应的藻生长曲线
Fig.5　The curves of NO decline in algae solution
and the algae g rowth
2.4 关于外源高浓度 NO对微藻作用机制的讨论
NO 是小分子化合物 ,具有顺磁性 ,扩散能力强 ,高
脂溶性等特点 ,极易穿过细胞膜而扩散到而扩散到机
体的各部位。本研究已表明 ,外加高浓度 NO 在培养
液中的衰变很快 ,并且迅速对小新月菱形藻的生长产
生重要影响 ,这是 NO 性质的充分体现。外源高浓度
NO 对小新月菱形藻的作用与其在培养液中的衰变有
关 ,但是外源高浓度 NO 对小新月菱形藻的作用机制
还不是很清楚 。从化学角度来考虑 ,NO与微藻作用似
乎符合扩散-吸附-反应过程[ 16] :藻细胞被 1 层扩散边
界层包围着 ,由细胞半径决定其有效厚度。扩散层的
有效厚度相当于球形细胞的半径 ,而且与藻类细胞有
同样的表面球形半径[ 17] 。往培养液中加入 NO后 ,NO
及其在溶液中的各种存在形式通过扩散作用穿过这 1
层到达细胞表面 ,然后再与细胞表面发生吸附-交换作
用进入细胞内部 ,同时与细胞膜 、胞内各部分发生生物
化学反应 , 最终对藻的生长产生促进或抑制作用。
Leshem[ 18]从生物学角度出发 ,认为低浓度 NO 促进植
物生长的作用 ,可能是通过促进细胞壁松驰而促进细
胞的扩展 , 作用于膜的磷脂双分子层 ,增强膜的流动
性 ,促进生长。高浓度 NO与超氧阴离子(·O2-)、过氧
亚硝酸盐作用导致膜渗漏 ,NO还可能扩散进入胞质溶
胶 ,攻击其中的关键酶类 ,从而产生破坏性影响 。高浓
度NO对微藻生长的影响可能是复杂的化学/生物学
共同作用的结果 ,其明确的作用机制还有待进一步研
究。
实验中每天加入 1次不同浓度 NO ,藻的生长曲线
形状由 S 型转变为峰型( )和基本上属“水平直
650 中　国　海　洋　大　学　学　报 2 0 0 7 年
线”型 。这表示:不同 NO 浓度作用下 ,对藻类生长有
不同的影响机理 ,可能同时存在 2 种效应;(a)较低浓
度NO对藻生长有促进作用;(b)较高 NO 浓度对藻类
生长有抑制作用 。峰型曲线表示出这两类作用的综合
结果 。
3　结论
(1)采用一次性加入方式时 ,1.4μmol/L NO对小新月
菱形藻生长起促进作用 , 7 , 14 , 28和 42 μmol/ L NO 对
藻生长产生抑制作用 ,并且 NO浓度越大 ,抑制作用越
强。
(2)每天加入 1次 NO ,所加不同浓度的 NO均抑制小
新月菱形藻的生长 , NO 浓度越大 ,抑制作用越强;42
μmol/L NO可完全抑制藻的生长。
(3)外加高浓度 NO对微藻的生长起 2种相互竞争而
又相互关联的作用。一次性加入 1.4 μmol/ L 的 NO ,
起初抑制了微藻生长 ,随着藻液中 NO 浓度衰变大约
10-8 ～ 10-9 mol/L ,在促进微藻生长的“NO 阈值”范
围 ,因此表现出促进作用 。本文首次对两类不同 NO
阈值做了进一步的讨论 ,上述抑制-促进作用 ,是“高浓
度NO阈值”区的特征;在低浓度 NO 阈值区主要特征
是促进作用。
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6514期 张正斌 ,等:高浓度 NO对小新月菱形藻生长影响的初步研究
Study on the Effects of High Nitric Oxide Concentration
on the Growth of Nitzschia closterium f .minutissima
ZHANG Zheng-Bin , HUANG Hua-Wei , LIU Chun-Ying , LIU Lian-Sheng
(The Institute of Marine Chemistry , Ocean University of China , Qingdao 266003 , China)
Abstract:　This paper studies the ef fects of high concentration nit ric oxide (NO)on the g row th of Nitzschia
closterium f .minutissima in chemistry.The resuets showed that(1)When adding NO only once , 1.4μmol/L NO
promo ted the grow th of Nitzschia closterium f.minutissima., whereas 7 , 14 , 28 and 42μmol/L NO inhibit-
ed the microalgae grow th.(2)When adding NO once a day , 1.4 ～ 42μmol/L NO inhibited the grow th of mi-
croalgae to dif ferent extents.The S-curve of alg ae grow th w as t ransfo rmed to a double-peak curve.42μmol/L
NO completely inhibi ted the microalgae grow th in 100 hours.(3)The concentration change in f/2 was detected
af ter the addi tion of 1.4 μmol/L NO.Because the NO concentration continuously decreased , 1.4 μmol/L NO
could promote or inhibit the microalgae g row th , depending on how i t w as added.
Key words:　Nitric Ox ide (NO);inf luencing;inhibition;microalgae
责任编辑　徐　环
(上接 666页)
Absorption of Aqueous Oil by Beach Sand and Analysis of the Effective Factors
SUN Juan1 , ZHENG Xi-Lai1 , WU Jun-Wen2
(1.Key Lab of Marine Environmental Science and Ecology , Ministry of Education , Ocean University of China , Qingdao 266100 , China;
2.Central Marine Environmental Monitoring Station of Xiamen , SOA , Xiamen 361008 , China)
Abstract:　Based on the field investigations of natural geog raphy and hydro-geologic conditions , sand and seawater
w ere sampled at Shilaoren Bathing Beach of Qingdao , and their major physical and chemical properties were analy zed.
The kinetic equat ions and isotherms of aqueous oil on sand samples were obtained and the ef fective factors w ere evaluat-
ed w ith the distributions of temperature , salini ty and pH in the coastal surface area taken into account.The results
show that the equilibrium adso rbed dissolved oil w as 90 ～ 110 mg/kg ;the equilibrium period w as 14 ～ 16 hours , and
Henry type adsorption iso therm can be used to explain the process.Moreover , the sorption mechanism w as believed to
be physical through thermodynamic calculation.By further analysis of the isotherm , it w as discovered that oil could be
released from the sandy beach when the aqueous oil concentration was low er than certain values , causing secondary pol-
lution.
Key words:　sand;aqueous oil;sorption
责任编辑　庞　
652 中　国　海　洋　大　学　学　报 2 0 0 7 年