全 文 ：　[ 收稿日期] 2001-07-17　　　[ 修回日期] 2002-01-15
＊[ 基金项目] 广东省重点科技攻关项目(粤科字9872005-01);
广东省高等学校重点科研项目(2000年 1月-2002年 12月)
■通讯作者:岑颖洲
Tel:020-85223420;E-mail:tqinyz@jnu.edu.cn
[ 文章编号] 　1000-4718(2002)07-0851-02
麒麟菜中蕨藻红素抗肿瘤活性研究＊
杨宜婷1 , 　岑颖洲1■ , 　肇静娴2 , 　狄静芳2
(暨南大学 1化学系 , 2组织移植与免疫教育部重点实验室 , 广东 广州 510632)
　　[ 摘　要] 　目的:探讨把蕨红藻素(caulerpin)发展成为抗肿瘤药物的可能性。方法:检测 caulerpin 对细胞株
HL60 的细胞毒作用及诱导细胞凋亡作用。结果:Caulerpin 对 HL60 细胞有一定的细胞毒和细胞诱导凋亡作用。结
论:Caulerpin具有发展成为抗肿瘤药物的可能性。
[ 关键词] 　蕨藻红素;药物筛选试验 , 抗肿瘤;细胞凋亡
　　[ KEY WORDS] 　Caulerpin;Drug screening assays , antitumor;Apoptosis
　　[ 中图分类号] 　R979.1　　　[文献标识码] 　A
　　在海洋独特的生态环境中 , 海藻属于被吞食的弱者 , 海
藻为了对付海洋食草动物的大量吞食以维持自身的生存繁
衍 ,往往体内会产生一些能促进自身大量快速繁殖的生长激
素类物质。本文从海藻麒麟菜中提取分离得到蕨藻红素
(caulerpin),并对其进行结构鉴定。国内外的一些报道表明 ,
caulerpin 具有明显的促进植物生长的活性[ 1 , 2] 。 而关于
caulerpin抗肿瘤活性方面的报道较鲜见。本文以人类早幼粒
细胞白血病细胞株HL60 为受试细胞 ,探讨把 caulerpin发展成
为抗肿瘤药物的可能性。
材　料　和　方　法
1　实验设备
国产 X4 熔点测定仪;Nicolet-5DX F-T 红外光谱仪;JE-
OL JMS-DX-300 质谱仪 、JEOL FX-90;BKUKER Am-400核
磁共振仪;二氧化碳细胞培养箱 , NBA-311 型日本TABAI ES-
PEC;倒置显微镜(显微注射系统), TMD-MO188 型 , 日本
Nikon;荧光显微镜 , TMD 型 , 日本 Nikon;标准型超净工作台 ,
JJt-1300 型 ,北京半导体设备一厂;血细胞计数板 ,细胞培养
瓶 , 25 mm2 , 美国 Corning;6 孔细胞培养板德国Greiner。
2　实验材料
HL60细胞株 , 香港中文大学生理系提供;caulerpin , 暨南
大学化学系提供 ,由麒麟菜 Eucheuma muricatumn 中分离得到 ,
caulerpin贮存液实验前用 DMSO 稀释至实验浓度 100倍 , 过滤
除菌 , -20℃保存;放线菌酮(cycloheximide , CHX),美国 CalBio
-chem;二甲基亚砜(dimethylsulfoxide , DMSO), 美国 Nov-
abiochem;碘化丙啶(propidium iodide , PI), Hoechst 33342 , 美国
Sigma;RPMI-1640 细胞完全培养液(加 10×104U/ L的青霉素
及 100 mg/L链霉素),美国 GibcoBRL。
3　Caulerpin的提取分离及鉴定
　　麒麟菜 Eucheumamuricatumn 1993 年 5月采自我国西沙海
域 ,由中科院青岛海洋研究所夏邦美教授鉴定。 将样品 1.7
kg ,切碎后用 95%的乙醇室温浸提 3 次 ,减压浓缩浸提液至粘
稠状 , 加入少量水 , 用乙酸乙酯萃取。萃取液减压浓缩后先
经硅胶 H 真空柱层析 , 石油醚/乙酸乙酯梯度洗脱 ,收集 30%
-35%的洗脱部分 ,再经硅胶 H 柱快速层析 , 二氯甲烷/乙酸
乙酯洗脱得 caulerpin 1.03 g。 Caulerpin 为橙红色立方晶体 ,
mp:319-319.5℃, 通过元素分析 , FABMS 以及[ 13C] -NMR、
[ 1H] -NMR谱(实验数据如表 1)推导并确定其结构式如下:
Fig 1　The molecular formular of caulerpin
图 1　Caulerpin的分子结构式
表 1　Caulerpin的 NMR实验数据
Tab 1　The NMR experiment data of caulerpin
Number δH(10-6) δC(10-6)
1 , 1′ 7.59 111.56
2 , 2′ 7.25 122.66
3 , 3′ 7.18 119.91
4 , 4′ 7.47 118.01
5 , 5′ — 127.09
6 , 6′ — 112.08
7 , 7′ — 126.01
8 , 8′ — 138.36
9 , 9′ — 142.32
10 , 10′ — 133.54
11 , 11′ — 166.07
12 , 12′ 3.70 51.41
NH 12.55 —
4　实验分组
4.1　阴性对照组　加入 10 μL DMSO。
4.2　Caulerpin对 HL60细胞作用组　加入 caulerpin 10 μL , 终
浓度分别为 10-6、10-7 、10-8 mol/ L。
4.3　阳性对照组　加入 10 μL CHX, 终浓度为 5 mg/ L。
·851·中国病理生理杂志　Chinese Journal of Pathophysiology　2002 , 18(7):851-852
各组分别做 6个平行孔。
5　加入受试化合物培养
取对数生长期 HL60 细胞 , 常规计数 , 用 RPMI 1640 完全
培养液制成 1.0×109/ L的细胞悬液 , 按每孔1 mL接种至 6 孔
细胞培养板中 ,加入不同浓度各组受试化合物 10 μL后 , 置于
37℃, 5% CO2细胞培养箱中培养 , 24 h后取样观察。
6　PI染色荧光显微镜观察细胞毒作用
6.1　PI染色方法　取培养24 h , 吹打均匀的各孔悬液 0.5
mL , 分别置于 5 mL试管中 ,加入 PI 40μL(终浓度为 2 mg/L),
旋涡混匀器轻轻混匀后 ,室温避光静置 10 min。
6.2　荧光显微镜观察　调整滤光片 , 激发光 488 nm , 散射光
610 nm。取干净血细胞计数器 , 加入 30 μL染色后的细胞悬
液 ,使之充满计数板和盖玻片之间的间隙 , 以发出强红色荧
光的细胞为阳性细胞。随机计数 500 个细胞 , 按下式计算出
死亡细胞所占百分率:细胞死亡率 =阳性细胞数/500×
100%。
7　Hoechst 33342 染色荧光显微镜观察细胞凋亡作用
7.1　Hoechst 33342染色方法　取培养 24 h 吹打均匀的各孔
细胞悬液0.5 mL分别置于 5 mL试管中 , 加Hoechst 33342 10μL
(终浓度 1 mg/mL),轻轻混匀后 , 室温避光静置 10 min。
7.2　荧光显微镜观察　调整滤光片 , 激发光 330 nm , 散射光
488 nm。取干净血细胞计数板 , 加入 30 μL染色后的细胞悬
液 ,使之充满计数板和盖玻片间的间隙。根据凋亡细胞形态
学特征 , 出现胞核片断化 、凋亡小体视为阳性细胞。随机计
数 500个细胞 , 并按下式计算细胞凋亡率:
细胞凋亡率=凋亡细胞数/500×100%
8　统计学处理
实验数据均以 x±s 表示 , 统计学分析采用 SPSS 软件包
的 χ2检验。
结　　果
表 2　Caulerpin的细胞死亡率和细胞凋亡率
Tab 2　The cell death rate and the cell apoptosis rate induced by
caulerpin (%. x±s.n=6)
　Group Cells death rate(%) Cells apoptosis rate(%)
Negative control 0.9±0.2 　　1.2±0.2
(10 mL/L DMSO)
Positive control 19.2±1.4 68.3±4.5
(5 mg/L CHX)
10-6 mol/L caulerpin 6.7±0.4＊ 3.5±0.4＊
10
-7
mol/L caulerpin 6.1±0.4＊ 3.2±0.4＊
10-8 mol/L caulerpin 2.8±0.4＊ 1.7±0.3
　＊ P<0.01 vs negative control.
讨　　论
根据当前肿瘤治疗的研究 , 抗肿瘤药物是通过其细胞毒
和诱导细胞凋亡作用而产生的。理想的抗肿瘤药物应该具
有肿瘤特异性的诱导细胞凋亡作用。虽然有关恶性肿瘤的
发生机制目前尚末完全阐明 , 但勿庸置疑的是 , 在肿瘤形成
的过程中 ,细胞数目的增加是其突出的特点 , 这可能是由于
细胞增殖的增加和细胞死亡的减少 , 或二者兼有。以往认为
肿瘤的发生主要与恶性转化细胞的细胞周期调节障碍导致
细胞过度增殖有关 , 但近年研究认为 , 细胞凋亡可能是肿瘤
发生和发展的重要因素[ 3] 。肿瘤生长速率取决于肿瘤细胞
的凋亡率和增殖率的动态平衡[ 4] 。因此可以设想 , 肿瘤细胞
特异性的细胞诱导凋亡将是治疗恶性肿瘤的一种有效策略。
本实验采用 PI 染色来检测细胞死亡的数量[ 5] 。正常活
细胞对染料有拒染性 , 红色荧光较少 , 凋亡细胞呈弱红色荧
光 ,死细胞由于有很强的 PI嗜染性 , 呈现强红色荧光。镜下
观察 PI高染细胞 , 视为死亡细胞。采用 Hoechst 33342 荧光标
记法来检测细胞凋亡的数量[ 5] 。细胞凋亡是一种不同于坏
死的死亡形式。加入荧光染料Hoechst以后 ,凋亡细胞由于膜
通透性的改变 , 可摄取 Hoechst染料 , 后者与 DNA结合 , 在紫
外光下呈蓝色荧光。正常细胞可摄取少量 Hoechst荧光染料 ,
坏死细胞则不能摄取 , 故在荧光显微镜下 , 可观察到正常细
胞的细胞核呈弥散均匀荧光。 而镜下观察到核内浓染致密
块状荧光的小体积细胞 ,可视为凋亡细胞。
在本实验系统中 , CHX 显示出较好的诱导细胞凋亡作
用 , 24 h 凋亡率可达 70%, 而阴性对照(1.0% DMSO)组24 h的
凋亡率只有0.9%。这证明了本实验系统的可信赖性。从上
表可看出 , caulerpin 对 HL60细胞具有一定的细胞毒和诱导细
胞凋亡作用 ,而且 caulerpin 的作用强度在一定范围内与药物
浓度呈正相关。这表明 caulerpin 具有发展成为抗肿瘤药物的
可能性。然而 ,与 CHX 相比 , caulerpin 的细胞诱导凋亡作用较
弱 ,这点不利于把它发展成为理想的抗肿瘤药物。其原因可
能有两个:① Caulerpin 纯度低 , 通过进一步纯化可解决此问
题;②由 caulerpin本身的化学特性所决定 , 对它进行化学修饰
可能是解决此问题的方法之一。
[ 参　考　文　献]
[ 1] 　Michael FR, John HC , John GS.The green algal pigment
caulerpin as a plant growth regulator[ J] .Phytochemistry ,
1987 , 26(3):619-620.
[ 2] 　徐效华 ,苏镜娱.Caulerpin 的分离鉴定及生物活性[ J] .
中山大学学报(自然科学版), 1996 , 35(2):64-66.
[ 3] 　Kerr JFR , Harmon BV , Winterford CM.Apoptosis:its signfi-
cance in cancer and cancer therapy[ J] .Cancer , 1994 , 73:
2013-2016.
[ 4] 　Lipponen P K , Aaltomaa S.Apoptosis in bladder cancer as
related to standard prognostic factors and prognosis [ J] .J
Pathol , 1994 , 173(4):333-339.
[ 5] 　张亚历 ,姜　泊 , 周殿元.程序化细胞死亡常用研究方
法[ A] .见:姜　泊 , 张亚历 , 周殿元 , 主编.分子生物学
常用实验方法[ M] .北京:人民军医出版社 , 1996.170-
183.
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