全 文 ：小连翘总提取物及各化学部位体外抗肿瘤活性的研究
段静雨 1 ,王健慧1 ,阮金兰 2
(1.徐州医学院药学系 , 江苏 徐州 221004;2.华中科技大学同济医学院药学院 ,湖北 武汉 430030)
摘要:目的　研究小连翘乙醇总提取物(HETTE)及各化学部位对小鼠体外肿瘤细胞 S180增殖的抑制作用 , 筛
选小连翘抗肿瘤主要活性部位。方法　以小鼠肿瘤细胞 S
180
作为实验用细胞株 , 采用 MTT法对 HETTE、乙酸乙
酯可溶部位(F002A)、乙酸乙酯不溶部位(F002B)、丙酮部位(F003)和甲醇部位(F004)进行抗肿瘤活性研究。结
果　HETTE及各化学部位均具有抑制小鼠肿瘤细胞 S180增殖的作用 , 其中以 F004作用最强 , 其次为 HETTE、
F002A、F002B, 抑制作用最弱的是 F003。结论　HETTE及各化学部位有抗肿瘤活性 , F004作用最强 , 为小连翘主
要活性部位。
关键词:小连翘;药物筛选试验 ,抗肿瘤;化学部位
中图分类号:R285　　文献标识码:A　　文章编号:1000-2065(2007)01-0028-03
TheantitumoreffectsofHypericumerectumThunbtotalextractionand
itschemicalfractionsinvitro
DUANJing-yu1 , WANGJian-hui1 , RUANJin-lan2
(1.DepartmentofPharmacy, XuzhouMedicalColege, Xuzhou, Jiangsu221004, China;2.SchoolofPhamacy, Tongji
MedicalColegeofHuazhongUniversityofScienceandTechnoogy, WuHan, Hubei430030, China)
Abstract:Objective　TostudytheinhibitoryefectsofHypericumerectumThunbtotalextraction(HETTE)andits
chemicalfractionsonthegrowthoftumorcelS180 ofmiceinvitro, soastoscreenthemainanti-tumoractivefraction.
Methods　ThetumorcelS180 ofmicewasadoptedastheexperimentalcellstrain.HETTEanditsfourfractions, inclu-
dingaceticetherdissolvedfraction(F002A), aceticetherundissolvedfraction(F002B), acetonefraction(F003)and
methanolfraction(F004), werestudiedbyusingtheclassicalantitumorscreeningmethod(MTTmethod).Results　
HETTEandthefourfractionswerealfoundtohaveinhibitedthegrowthofS180 cell.TheeffectofF004 (themethanol
fraction)toppedthelist, strongerthanthatofHETTE, F002A, F002BandF003 inorderofpotency.Conclusion　
HETTEandthefourfractionsalhaveantitumoreffects, F004isthemostactivefraction.
Keywords:HypericumerectumThunb;drugscreeningassays, anti-tumor;chemicalfraction
　　小连翘(HypericumerectumThunb)系藤黄科金
丝桃属植物 ,有抗溶血 、利尿 、收敛等作用 ,用于治疗
月经不调 、消化道出血 、吐血 ,外用治疗外伤出血 、疔
疮肿毒 、毒蛇咬伤等 [ 1] 。但有关小连翘生物活性的
研究却少见报道 。本研究采用体外抗肿瘤筛选经典
方法———四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT
法)[ 2] ,以小鼠肿瘤细胞 S180作为实验用细胞株 ,观
察小连翘乙醇总提取物(HETTE)及 4个化学部位
对肿瘤细胞增殖的抑制作用 ,为深入研究与开发该
植物药用价值奠定实验基础。
1　材料和方法
1.1　主要仪器和试剂　CO2培养箱为美国 FORMA
公司产品;全自动酶标分析仪为 MultiskanAscent
V1.23产品;倒置生物显微镜由南京江南光电(集
团)股份有限公司生产。
四甲基偶氮唑盐(MTT)为 Sigma公司产品;二
甲基亚砜(DMSO)由江苏南兴助剂厂生产;胎牛血
清 、RPMI1640培养基均购于 GIBCO公司;5 -FU
为上 海旭 东海普 药业有 限公 司生 产 , 批 号
20031004,配制成 5 mg/L备用;聚维酮(polyvidone,
PVP)由天津科密欧化学试剂开发中心生产;其余试
剂均为国产分析纯 。
1.2　药材　本研究所用小连翘系 2003年 7月采自
湖北省建始土家族民族自治县 ,经建始县药品检验
所王从荣副主任药师鉴定品种为藤黄科金丝桃属植
物小连翘 。
1.3　实验用细胞株　小鼠肿瘤细胞 S180 ,由华中科技
·28· 徐州医学院学报　ACTA　ACADEMIAE　MEDICINAE　XUZHOU　2007, 27(1)
大学同济医学院药学院新药开发实验室传代培养。
1.4　方法
1.4.1　HETTE的制备　取 27.3 kg小连翘地上部
分 ,粉碎成 20目粗粉 ,用 95%乙醇 350 kg浸泡(约
2天),加热回流 1.5 h,滤过 ,继续用 75%乙醇加热
回流提取 2次 ,每次 1h,将 3次提取液合并 , 50℃减
压回收乙醇 ,浓缩成浸膏 ,得 HETTE5 300g。
1.4.2　小连翘各化学部位的制备 　取 HETTE
5 013.5g,用硅藻土拌样 , 自然风干后 , 装硅藻土
柱 ,依次用石油醚 、乙酸乙酯 、丙酮 、甲醇洗脱 ,分别
回收溶剂 , 得乙酸乙酯部位 (aceticetherfraction,
F002)、丙酮部位(acetonefraction, F003)、甲醇部位
(methanolfraction, F004)。F002部位静置出现沉淀
物 ,将溶液部分取出 ,沉淀物用乙酸乙酯洗涤 ,乙酸
乙酯洗涤液与取出的溶液部分合并 ,得乙酸乙酯可
溶部位(aceticetherdisolvedfraction, F002A)、乙酸
乙酯不溶部位 (aceticetherundissolvedfraction,
F002B)。
1.4.3　样品溶液的制备 　取 HETTE、F002A、
F002B、F003、F004浸膏适量 ,水浴蒸干后 ,真空抽干
至干粉。分别加 2倍量 PVP,无水乙醇适量研成包
合物 ,水浴蒸干并真空抽至干粉 ,加生理盐水配成
低 、中 、高 3个剂量组 ,浓度(生药)分别为 250 g/L、
750g/L、1 500 g/L,备用。
1.4.4　实验分组　分 PBS组 、5-FU组及 HETTE、
F002A、F002B、F003、F004的低 、中 、高剂量组(每组
n=8)。
1.4.5　MTT法检测 HETTE及各化学部位对小鼠
S180肿瘤细胞增殖的作用 [ 3] 　将接种 S180肿瘤细胞
大约 1周的种鼠颈椎脱臼处死后抽取腹腔积液约
0.5ml,加入 Hanks液洗 2遍后 ,用完全培养基将细
胞稀释至 1×109 /L。消化 、收集对数生长期的 S180
肿瘤细胞 ,混悬于 5%胎牛血清的 RPMI-1640培养
液中 ,计数细胞并将其稀释至 1×109 /L。培养板每
孔加入上述细胞 190μl,共加 136孔;另外设空白对
照孔 8个 ,只加完全培养基 200μl,不加细胞。将培
养板置于 37℃、5% CO2的培养箱中连续培养 24h。
将 HETTE、F002A、F002B、F003、F004低 、中 、高 3个
剂量组溶液分别加入 8个孔中 ,另将 5-FU及 PBS
分别加入 8个孔中。随后在 37℃、5% CO2的培养
箱中连续培养 48 h,然后每孔加入 10 μl5 g/L的
MTT溶液 ,继续培养 4 h。仔细地吸去上清液 ,每孔
加入 150 μlDMSO,置于微型振荡仪上振荡 1 min,
在 570nm波长处用酶标仪测得光密度(D)值 ,计算
细胞增殖抑制率。抑制率 =(1-样品 D值 /对照组
D值)×100%。
1.5　统计学处理　计量数据用 x±s表示 ,组间比
较采用 t检验 , P<0.05为差异有显著性 。
2　结　果
由表 1可以看出 , HETTE及各化学部位体外抗
肿瘤作用试验的 D值均低于 PBS组。除 F002A低
剂量组和 F003高剂量组外 ,其余各组 D值与 PBS
组 D值比较均有显著性差异(P<0.05或 <0.01)。
在抑制小鼠 S180肿瘤细胞的增殖中 , F004的抑制率
最高 、抑制作用最强 ,其他依次为 HETTE、F002A、
F002B,抑制肿瘤生长作用最弱的是 F003。对抑制
作用最强的甲醇部位来说 ,低剂量组和中剂量组的
抑制率高于 5-FU组(P<0.01)。
表 1　HETTE及其化学部位体外抗肿瘤作用
试验结果(n=8)
组　别 D值　　 抑制率(%)
PBS组 0.3802±0.0590 0
5-FU组 0.1869±0.0920＊＊ 50.84
HETTE组
　低剂量 0.1290±0.0289＊＊ 66.07
　中剂量 0.1480±0.0242＊＊ 61.07
　高剂量 0.1340±0.3520＊＊ 64.76
F002A组
　低剂量 0.3790±0.0419 0.32
　中剂量 0.1380±0.0511＊＊ 63.70
　高剂量 0.2670±0.0421＊＊ 29.77
F002B组
　低剂量 0.3050±0.0601＊ 19.78
　中剂量 0.1780±0.0487＊＊ 53.18
　高剂量 0.2070±0.0536＊＊ 45.55
F003组
　低剂量 0.2250±0.0937＊＊ 40.82
　中剂量 0.2410±0.0221＊＊ 36.61
　高剂量 0.3580±0.0601 5.84
F004组
　低剂量 0.0508±0.0254＊＊## 83.64
　中剂量 0.0540±0.0114＊＊## 85.80
　高剂量 0.1340±0.0421＊＊ 64.76
　　与 PBS组比较:＊P<0.05, ＊＊P<0.01;与 5 -FU组
比较:##P<0.01
3　讨　论
HETTE及其各化学部位体外抗肿瘤作用试验
中 ,除 F002A低剂量组和 F003高剂量组外 ,其余各
组 D值均明显低于 PBS组(P<0.05或 <0.01),表
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明 HETTE及其各化学部位对小鼠 S180肿瘤细胞的
增殖均有抑制作用。对抑制作用最强的甲醇部位来
说 ,低剂量组和中剂量组的抑制率高于 5-FU组(P
<0.01),提示 F004为小连翘抗肿瘤的主要活性部
位 。
从初步抗肿瘤试验结果的量效关系可见 ,几乎
每个样品高剂量组的肿瘤细胞增殖抑制率普遍较
低 ,原因可能在于本实验所用样品为 HETTE及其各
化学部位 ,其中均含有多种化学成分 ,既有一些能促
进肿瘤细胞增殖的物质 ,也存在抑制肿瘤细胞增殖
的物质 。当样品浓度增加时 ,促进肿瘤生长的物质
和抑制肿瘤生长的物质含量均增大 ,此时 ,促进肿瘤
生长占有较大的优势 ,因此其肿瘤细胞增殖抑制率
反而降低 ,这是中草药起双向调节作用的一种体现 。
再者 ,本实验所用样品是一种包合物 ,当浓度增大
时 ,溶液黏度过大 ,溶解度降低 ,影响肿瘤细胞对药
物的摄取 ,因此抑制作用反而降低。
小连翘属藤黄科金丝桃属植物 ,该属植物有抗
抑郁 、抑制中枢神经 、抗病毒 、抗肿瘤 、抗菌等作
用 [ 4-5] 。特别是本属植物贯叶连翘 ,以其良好的抗
抑郁 、抗 HIV病毒 、抗肿瘤等作用引起了普遍关
注[ 6] 。由于近年来世界范围内的大规模开发应用 ,
贯叶连翘药源十分紧张 ,资源已近枯竭 。本研究根
据植物亲缘关系 ,对同属植物小连翘的乙醇总提取
物及其各化学部位进行了体外抗肿瘤作用的初步研
究 ,以期为进一步深入研究小连翘成为贯叶连翘的
替代物种奠定实验基础 。
参考文献:
[ 1] 　《全国中草药汇编 》编写组.全国中草药汇编(下册)[ M] .北
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[ J] .林产化工通讯, 2000, 34(1):22-27.
收稿日期:2006-06-21　修回日期:2006-09-20
本文编辑:吴　进
基因放射性核素反义治疗肾癌的体内外实验研究＊
杨文发 1 ,郑骏年 2 ,柳兴明1 ,陈家存 2 ,方　毅 1 ,王祥波1 ,汪　辉 1 ,杨　斌 1
(1.徐州医学院附属连云港医院泌尿外科 , 江苏 连云港 222002;
2.徐州医学院附属医院泌尿外科 ,江苏 徐州 221002)
摘要:目的　探讨 Ki67基因放射性核素反义治疗对人肾癌细胞生长及凋亡的影响。 方法　人工合成 Ki67
基因反义核酸(ASODNs),氯胺 -T法 125I标记 ASODNs(125I-ASODNs)。 ①体外实验:125I-ASODNs(10.0 μmol/
L、2.59 MBq/L)转染人肾癌 786-0细胞 ,采用免疫组化 、Westernblot检测 Ki67表达;免疫组化 TUNEL法检测细
胞凋亡。以 ASODNs(10.0 μmol/L)为对照。 ②动物实验:建立 786 -0细胞 BALB/C-nu裸鼠模型 , 125 I-
ASODNs治疗组瘤体注射 0.1 ml125I-ASODNs(7.4MBq/L、10 nmol), ASODNs治疗组瘤体注射 0.1 mlASODNs
(10 nmol), 连续 4天。药物处理后第 6天取瘤组织检测肿瘤体积 、Ki67表达 、细胞凋亡。结果　①体外实验:125I
-ASODNs治疗组肾癌细胞 Ki67表达阳性率 [ (21.5±1.2)%]降低 , Ki67蛋白 [ (49.9±4.5)%]降低 ,细胞凋亡
率 [ (28.9±1.3)%]升高 ,与 ASODNs治疗组 [ (29.9±0.4)%、(82.1±1.9)%、(15.7±0.5)%]比较差异有显
著性 (P<0.01)。②动物实验:125I-ASODNs治疗组小鼠肿瘤体积(mm3)(76.1 ±22.9)减小 , Ki-67表达率 [
(20.8±1.0)%]下降 , Ki-67蛋白量 [ (58.6 ±2.9)%]降低 , 肿瘤细胞凋亡率 [ (24.9 ±2.0)%]升高 , 与
ASODNs治疗组 [ (185.7±37.7)、(29.2 ±1)% 、(79.7 ±3.4)% 、(17.8±1.9)%]比较差异有显著性(P<
0.01)。结论　Ki67基因放射性核素反义治疗较单纯反义治疗具有更强的阻抑肾癌细胞 Ki67基因表达 、抑制增
殖 、促进凋亡作用。
关键词:肾癌;反义寡核苷酸;放射性核素;Ki67基因
中图分类号:R737.11　　文献标识码:A　　文章编号:1000-2065(2007)01-0030-04
·30· 徐州医学院学报　ACTA　ACADEMIAE　MEDICINAE　XUZHOU　2007, 27(1)
＊ 基金项目:江苏省卫生厅医学科技发展基金(H2000153);江苏省高校自然科学基金(02KJD320030)