全 文 ：分离与提取
2016年第 42卷第 6期(总第 342期) 209
DOI:10． 13995 / j． cnki． 11 － 1802 / ts． 201606037
响应面法优化微波辅助提取长茎葡萄蕨藻中
蕨藻红素
向江波1，2，邓建朝1，杨贤庆1 * ，李来好1，戚勃1，胡晓1，荣辉1，杨少玲1
1(中国水产科学研究院 南海水产研究所，农业部水产品加工重点实验室，国家水产品加工技术研发中心，广东 广州，510300)
2(上海海洋大学 食品学院，上海，201306)
摘 要 文中采用响应面微波提取法对长茎葡萄蕨藻中蕨藻红素的提取工艺进行研究。单因素和 Box-Behnken
设计实验结果表明:微波功率、乙醇浓度、料液比、萃取时间、萃取温度对长茎葡萄蕨藻中蕨藻红素提取率有显著
影响。优化的提取工艺为微波功率 200 W，乙醇体积分数为 85%，料液比为 1∶ 30 (g∶ mL)，萃取时间为 20 min，
萃取温度为 45℃，在此条件下长茎葡萄蕨藻中蕨藻红素提取率为 91. 9%，模型的 Ｒ2 = 98. 4%。与未经微波处理
的传统方法超声法、回流法和水浴法相比，微波处理最高可使长茎葡萄蕨藻中蕨藻红素提取率提高 79. 8%，超声
法、回流法和水浴法蕨藻红素的提取率分别为微波提取的 71. 8%、85. 69%和 55. 77%，且提取时间长，消耗溶剂
大。
关键词 长茎葡萄蕨藻;蕨藻红素;微波辅助提取;响应面提取法
第一作者:硕士研究生(杨贤庆研究员为通讯作者，E-mail:yx-
qgd@ 163． com)。
基金项目:国家自然科学基金项目(21205138);广东省海洋渔
业科技与产业发展专项(A201401C02);广东省科技计划项目
(2013B021100013) ;中央级公益性科研院所基本科研业务费专
项(2014YD05，2010TS17);中央级公益性科研院所基本科研业
务费专项(2014YD05，2010TS17，2014TS24)
收稿日期:2015 － 09 － 24，改回日期:2015 － 12 － 22
广阔的海洋占地球面积的 70% 以上，蕴藏着丰
富的生物资源。海藻是海洋生物资源的重要组成部
分［1 － 2］。近年来众多报道表明很多海藻成分复杂，除
富含维生素、矿物质、氨基酸及糖类外，还含有多糖、
蛋白质、不饱和脂肪酸和多萜类等活性物质。多年研
究表明海藻具有护肤美容，抗菌消炎，抗肿瘤，抗病
毒，抗衰老，减肥消脂和增强免疫力等一系列功
能［3 － 5］。长茎葡萄蕨藻藻是海藻的一种，长茎葡萄蕨
藻中含有能被人体良好利用的活性物质蕨藻红
素［6］。蕨藻红素，一种双吲哚生物碱，是一种重要的
抗氧化和抗炎症的生物活性成分。据相关文献［7］报
道，蕨藻红素具有良好的延缓花朵衰老，延缓果实成
熟，除草剂，脱草剂，竞争性抑制生长激素等功效。因
此，蕨藻红素的提取能够很大程度的提升长茎葡萄蕨
藻的价值。
近年以来，微波提取技术已经在天然活性产物领
域被广泛采用，微波具有很强的穿透力，而且能和一
些水分子、有机物质等极性分子相互作用，进而造成
植物细胞壁内部压力增加，这个压力的增加导致植物
细胞壁的破碎，促进植物内部物质的释放，提高单位
质量的提取率。传统提取方法主要依靠热传递，与传
统项目相比，微波提取具有低耗能、耗时少等优势特
点，与此同时，微波还具有高效率，易操作等优势。因
此，微波提取被广泛应用于生化提取工艺中［8 － 10］。
响应面分析法(ＲSM)作为优化实验条件和工艺参数
的有效方法，缩短了试验时间，它的回归方程具有更
高的精密度，并且能够探究多个变量之间的关系，已
经在化学工程，生物工程，食品工程等领域广泛广泛
采纳［11 － 12］。目前，蕨藻红素的提取工艺参数主要是
通过正交试验获取［13］。但是正交试验不能精确探究
出多因素之间的相互关系，文中以南海长茎葡萄蕨藻
为研究对象，在单因素实验的基础上，应用响应面分
析法(ＲSM)对长茎葡萄蕨藻中的蕨藻红素的微波提
取工艺进行优化，以得到最佳的蕨藻红素提取工艺。
1 材料与方法
1. 1 材料与试剂
长茎葡萄蕨藻藻，隶属绿藻门(Chlorophyta)、蕨
藻科 (Caulerpaceae)、蕨藻属 (Caulerpa)，拉丁名为
C. lentillifera。采于南海，晾晒后装入封口袋密封，带
回实验室作为后续实验的样品。色谱纯甲醇，美国
Sigma-Aldrich;乙醇 广州化学试剂厂(分析纯);实验
用水均符合 GB /T6682 一级水的标准。
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210 2016 Vol. 42 No. 6 (Total 342)
1. 2 仪器
常压微波辅助合成萃取仪(MAS-Ⅱ)，上海新仪
器微波化学科技有限公司;真空泵(AP-9925)，天津
奥特赛恩斯仪器有限公司;超纯水机(MILLIQ)，美国
Millipore有限公司;旋转蒸发仪(ＲE-2000A)，上海亚
荣生化仪器厂;(HH-4)数显恒温水浴锅，常州奥华仪
器有限公司;(SB25-12DTD)超声波清洗机，宁波新芝
生物科技股份有限公司;分析天平，瑞士 Mettler-Tole-
do 公司;高速万能粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公
司;Agilent1100 高效液相色谱仪(配有 DAD 检测器)
美国 Agilent 公司。
1. 3 实验方法
1. 3. 1 提取工艺
将采集的长茎葡萄蕨藻用清水超声清洗干净，除
去泥沙等杂质，45 ℃烘干，粉碎后过 60 目筛子，称取
一定量的海藻，用一定体积的乙醇在一定的微波条件
下提取，过滤，乙醇定容，高效液相色谱测试。
1. 3. 2 测定方法
1. 3. 2. 1 蕨藻红素的液相条件
色谱条件:色谱柱为 Athena C18-WP，4. 6mm ×
250mm，5μm;流动相甲醇-0. 2%冰乙酸(体积比 80 ∶
20);检测器 88232UV 紫外检测器;检测波长 315
nm;流速 0. 8 mL /min;柱温 30℃;进样量 20 μL［14］。
1. 3. 2. 2 蕨藻红素的提取率计算方法
采集的长茎葡萄蕨藻经过清洗、干燥、粉碎后，准
确称取 3. 0 g，在一定条件下微波提取，提取溶液定容
至 100 mL，由高效液相色谱仪测得蕨藻红素的峰面
积 A。根据响应面实验设计得出的蕨藻红素的提取
的最优工艺组合，在最优的工艺组合下，等量的长茎
葡萄蕨藻经过微波提取后，测定目标峰峰面积;将滤
渣进行二次提取，测定目标峰峰面积;如此重复操作，
直至提取物中目标峰面积接近为零，表明长茎葡萄蕨
藻中的蕨藻红素已提取完全。将多次提取的目标峰
峰面积相加 Amax即为 3. 0 g长茎葡萄蕨藻中的蕨藻红
素总量，各单工艺条件下提取一次的蕨藻红素的目标
峰峰面积为 A，得出各提取条件下蕨藻红素的提取率
(提取率 = A /Amax)
［13］。
1. 3. 3 单因素实验
参考有关文献中蕨藻红素的提取条件，选定微波
功率、乙醇浓度、料液比、萃取时间、萃取温度进行单
因素实验，分别对单个因素选 5 个水平，来考察单因
素对长茎葡萄蕨藻中蕨藻红素的提取率的影响。
1. 3. 3. 1 微波功率对蕨藻红素提取率的影响
准确称取清洁干燥过的样品 3. 0 g，按照料液为
1∶ 30 (g∶ mL)、90%的乙醇在萃取时间 15 min、萃取
温度为 45℃、分别在微波功率 100、200、300、400 和
500 W下进行萃取，提取液经抽滤后，定容至100 mL，由
高效液相色谱法测定蕨藻红素的峰面积，计算出提取
率，以 3 次实验平均值来表示提取率，试验结果如图
1 所示。随着微波功率的升高蕨藻红素的提取率依
次升高，在升高至 200 W之后，蕨藻红素的提取率是
随着微波功率的升高反而下降，因此选取 200 W 为
最优微波功率。
图 1 微波功率对蕨藻红素提取率的影响
Fig. 1 The effect of power on the caulerpin extraction rate
1. 3. 3. 2 乙醇浓度对蕨藻红素提取率的影响
准确称取清洁干燥过的样品 3. 0 g，按照料液比
为 1∶ 30 (g∶ mL)、萃取时间 15 min、萃取温度 45 ℃、
微波功率 200 W，分别在乙醇体积分数为 60%、70%、
80%、90%和 100%进行萃取，提取液经抽滤后，定容
至 100 mL，由高效液相色谱法测定蕨藻红素的峰面
积，计算出提取率，以 3 次实验平均值来表示提取率，
实验结果如图 2 所示。随着乙醇浓度的升高蕨藻红
素的提取率依次升高，在升至 90%之后，蕨藻红素的
提取率是随着乙醇浓度的升高反而下降，因此选取乙
醇浓度 90%为最佳萃取浓度。
图 2 乙醇浓度对蕨藻红素提取率的影响
Fig. 2 The effect of ethanol concentration
on the caulerpin extraction rate
1. 3. 3. 3 料液比对蕨藻红素提取率的影响
准确称取清洁干燥过的样品 3. 0 g，按照萃取时
分离与提取
2016年第 42卷第 6期(总第 342期) 211
间 15 min、萃取温度为 45℃、微波功率 200 W、乙醇浓
度 90%，分别在料液比 1∶ 20、1∶ 30、1∶ 40、1∶ 50 和 1∶
60 (g∶ mL)进行萃取，提取液经抽滤后，定容至 100
mL，由高效液相色谱法测定蕨藻红素的峰面积，计算
出提取率，以 3 次实验平均值来表示提取率，实验结
果如图 3 所示。随着料液比的升高蕨藻红素的提取
率依次升高，在升高至 1 ∶ 40 (g ∶ mL)之后，1 ∶ 50
(g∶ mL)和 1∶ 60 (g∶ mL)对提取率的影响变化不显著
(P ＞ 0. 05)［15］。考虑到提取成本及后续纯化难度，
最优料液比以 1∶ 30 (g∶ mL)为宜。
图 3 料液比对蕨藻红素提取率的影响
Fig. 3 The effect of solid-to-liquid ratio on the
caulerpin extraction rate
1. 3. 3. 4 萃取时间对蕨藻红素提取的影响
准确称取清洁干燥过的样品 3. 0 g，按照料液比
1∶ 30 (g∶ mL)、萃取温度为 45 ℃、微波功率 200 W、
乙醇体积分数 90%，萃取时间选取 5、10、15、20 和
25 min 5 个点，提取液经抽滤后，定容至 100 mL，由
高效液相色谱法测定蕨藻红素的峰面积，计算出提
取率，以 3 次实验平均值来表示提取率，实验结果
如图 4 所示。由图 4 可见，随着萃取时间的增加蕨
藻红素的提取率依次升高，当萃取时间达到 20 min
时提取率达到最大值，之后随着萃取时间的增加，
蕨藻红素的提取率降低，因此选取 20 min 为最佳萃
取时间。
图 4 萃取时间对蕨藻红素提取率的影响
Fig. 4 The effect of extraction time on the
caulerpin extraction rate
1. 3. 3. 5 萃取温度对蕨藻红素提取率的影响
准确称取清洁干燥过的样品 3. 0 g，按照料液比
1∶ 30 (g∶ mL)、萃取时间 20 min、微波功率 200 W、乙
醇体积分数 90%，萃取温度 选取 30、40、50、60 和
70 ℃5 个点，提取液经抽滤后，定容至 100 mL，由高
效液相色谱法测定蕨藻红素的峰面积，计算出提取
率，以 3 次实验平均值来表示提取率，实验结果如图
5 所示。随着温度的升高蕨藻红素的提取率依次升
高，当温度达到 40 ℃时提取率达到最大值，因此选取
40 ℃为最佳萃取温度。
图 5 萃取温度对蕨藻红素提取率的影响
Fig. 5 The effect of temperature on the caulerpin
extraction rate
2 结果与讨论
2. 1 因素的选择及方案
综合 1. 4 的单因素试验结果，固定料液比 1 ∶ 30
(g∶ mL)，微波功率 200 W，根据 Box-Benhnken 的中
心组合试验设计原理［16］，选取对长茎葡萄蕨藻蕨藻
红素提取影响较显著的萃取温度 T、乙醇浓度 C、萃
取时间 t这 3 个因素(分别以 A、B和 C)，采用 3 因素
3 水平的响应面分析方法确定最佳提取工艺条件，试
验因素和水平设计见表 1。
表 1 响应面分析因素与水平表
Table 1 Factors and levels of response
surface methodology
水平
A
(萃取温度)/℃
B
(乙醇体积分数)/%
C
(萃取时间)/min
－ 1 35 85 17
0 40 90 20
1 45 95 23
2. 2 响应面实验结果
在单因素实验的基础上，以微波温度 T = X1、乙
醇浓度 C = X2、微波时间 t = X3为自变量，以长茎葡萄
蕨藻中的蕨藻红素的提取率 Y 为响应值，进行响应
面分析实验。实验结果见表 2。
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212 2016 Vol. 42 No. 6 (Total 342)
表 2 响应面分析实验及实验结果
Table 2 Experiments and the experimental results
of response surface methodology
编码 Std X1 X2 X3 响应值 1(Y)
1 － 1 － 1 0 72. 42
2 1 － 1 0 92. 50
3 － 1 1 0 88. 23
4 1 1 0 71. 52
5 － 1 0 － 1 73. 07
6 1 0 － 1 70. 21
7 － 1 0 1 72. 85
8 1 0 1 74. 31
9 0 － 1 － 1 73. 73
10 0 1 － 1 75. 61
11 0 － 1 1 78. 04
12 0 1 1 72. 90
13 0 0 0 84. 23
14 0 0 0 82. 31
15 0 0 0 85. 02
16 0 0 0 86. 21
17 0 0 0 84. 91
表 2 响应面分析实验及实验结果中，实验 1 ～ 12
为析因实验，13 ～ 17 为中心实验，其中区域的中心点
为实验零点，析因点为自变量 X1、X2、X3所构成的三
维顶点，其中零点实验重复 5 次，用以估计实验误差，
对数据进行 ANOVA分析，分析结果见表 3，3 个因子
X1、X2、X3经过拟合得到的回归方程为:Y = 84. 54 +
0. 25 × X1 － 1. 05X2 + 0. 68 × X3 － 9. 2 × X1 × X2 + 1. 08
× X1 × X3 － 1. 76X2 × X3 － 2. 91 × X1
2 － 0. 45 × X2
2 －
9. 01 × X3
2，由表 3 的分析结果可知，整体模式极为显
著(“Pr ＞ F”值 ＜ 0. 001);失拟项不显著(“Pr ＞ F”
值 = 0. 629 4 ＞ 0. 05)，说明拟合回归方程对试验的
拟合性良好。模型的 Ｒ2 = 98. 44%，说明实验方法是
可靠的。
图 6 ～图 8 准确的给出了各个影响因子相互作
用的等值线分析图和响应面的 3D 图，从响应面的等
值线和响应面的最高点可以看出，在所选的范围内是
存在极值的，既是等高线最小椭圆的中心点，也是响
应面的最高点。图 6 表明，单个 X1和 X2都对响应值
有很大的影响，但是作用在一块时时对提取率的影响
没那么大，并且 X2对响应值 Y 的影响是高于 X1的。
X1和 X2在编码值 0 以上都得到了很好的响应值，这
与 ANOVA分析的实验结果是基本一致的，图 7 表
明，X1和 X3的相互作用比较强，编码值较大的 X1和
X3反而却导致响应值 Y值减少，这也与 ANOVA的分
析结果是吻合的。图 8 表明，X3在编码值为 0 跟编码
值在 0 上下浮动对响应值 Y的影响是微小的，X1在编
码值以上时，响应值 Y是增加的，X1与 X3的相互作用
也较强，经过 Design-expert 分析出最大响应值(Y)时
对应的编码值是 X1 = 1. 00，X2 = － 1. 00，X3 = 0. 195。
与之对应的长茎葡萄蕨藻中蕨藻红素的最佳提取条
件是 X1 = 45 ℃，X2 = 85%，X3 = 20. 195，理论提取的
最佳值为 92. 01%。
表 3 响应面 ANOVA的分析结果
Table 3 The response surface of ANOVA analysis results
来源模型 平方和 均方 F值 P值 Prob ＞ F
Model 764. 36 9 84. 93 48. 95 ＜ 0. 000 1 显著
X1 0. 49 1 0. 49 0. 28 0. 610 2
X2 8. 88 1 8. 88 5. 12 0. 058 1
X3 3. 74 1 3. 74 2. 15 0. 185 6
X1X2 338. 27 1 338. 27 194. 97 ＜ 0. 000 1
X1X3 4. 69 1 4. 69 2. 71 0. 144 0
X2X3 12. 33 1 12. 33 7. 11 0. 032 2
X1 2 35. 77 1 35. 77 20. 61 0. 002 7
X2 2 0. 87 1 0. 87 0. 100 0. 100 2
X3 2 342. 16 1 342. 16 197. 21 ＜ 0. 000 1
残差 12. 15 7 1. 74
失拟项 3. 93 3 1. 31 0. 64 0. 629 4 不显著
纯误差 8. 22 4 2. 05
中心总和 776. 51 16
为了验证响应面提取蕨藻红素的可行性，采用响 应面得到的最优值的提取条件去进行长茎葡萄蕨藻
分离与提取
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图 6 Y = f(X1，X2)的响应面和等高线分析图
Fig. 6 The response surface and contour maps
of Y = f(X2，X3)
图 7 Y = f(X1，X3)的响应面和等高线分析图
Fig. 7 The response surface and contour
maps of Y = f(X2，X3)
图 8 Y = f(X2，X3)的响应面和等高线分析图
Fig. 8 The response surface and contour maps
of Y = f(X2，X3)
中蕨藻红素的验证试验，同时考虑到实际的操作性和
生产的便利，以料液比 1 ∶ 30 (g∶ mL)，微波功率 200
W，萃取温度 45℃，乙醇浓度 85%，萃取时间 20 min。
3 次平均实验得到实际的平均提取率为 91. 9%，3 次
试验相对标准偏差(ＲSD)分别为 0. 479%，0. 486%，
0. 457%，重现性好。与理论值相差 0. 11%。因此得
出结论，用微波辅助提取响应面优化长茎葡萄蕨藻中
的蕨藻红素是可行的，得到的蕨藻红素的提取是具有
实际应用价值的。
2. 3 其他提取方法
准确称取清洁干燥过的样品 3. 0 g，加入相应体
积 85% 的乙醇，按照表 4 的条件分别用超声、回流和
水浴加热提取方法提取长茎葡萄蕨藻中的蕨藻红素，
3 次实验取平均值，实验结果如表 4 所示，超声法、回
流法和水浴法蕨藻红素的提取率分别为微波提取的
71. 8%、85. 69%和 55. 77%，且提取时间长，消耗溶
剂大。
表 4 其他提取蕨藻红素的方法
Table 4 Other extraction methods of caulerpin
方法 温度 /℃
料液比
(g∶ mL)
时间
提取率 /
%
超声法 45 30 20 min 65. 98
回流法 45 60 2 h 78. 75
水浴法 45 30 20 min 51. 25
3 结论
本实验在单因素实验的基础上，将响应面法应用
于微波提取长茎葡萄蕨藻中蕨藻红素的提取实验中，
实验结果表明，微波萃取温度、萃取时间和乙醇浓度
的平方项对长茎葡萄蕨藻中的蕨藻红素提取影响显
著，说明萃取温度、萃取时间和乙醇浓度对长茎葡萄
蕨藻中的蕨藻红素的提取不是简单的线性关系。回
归方程和回归方程的分析以及验证试验的结果表明，
此方法合理可行，得到长茎葡萄蕨藻中蕨藻红素的最
佳提取条件为:料液比 1 ∶ 30 (g ∶ mL)，微波功率
200 W，萃取温度 45 ℃，乙醇浓度 85%，萃取时间
20 min，长茎葡萄蕨藻中的蕨藻红素的实际提取率为
91. 9%。
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cauperpin from Caulerpa lentillifera by response surface method
XIANG Jiang-bo1，2，DENG Jian-chao1，YANG Xian-qing1* ，LI Lai-hao1，
QI Bo1，HU Xiao1，ＲONG Hui1，YANG Shao-ling1
1(National center for aquatic products processing technology research and development，Key laboratory
of the ministry of agriculture of aquatic products processing，South China Sea Fisheries Ｒesearch Institute，
Guangzhou 510300，China)
2(Food college，Shanghai ocean university，Shanghai 201306，China)
ABSTＲACT The extraction technology of caulerpin from the Caulerpa lentillifera was studied． The microwave ex-
traction and response surface methodology (ＲSM)were applied． According to the single factor and Box-Behnken de-
sign，the microwave power，ethanol concentration，the ratio of solid to liquid，extraction time，extraction temperature
shows significant effects;the optimized extraction technology parameters are:microwave power 200 W，90% ethanol
as extraction solvent，material-liquid ratio of 1∶ 30 (g∶ mL)，extraction time 20 minutes and the extraction temperature
45 ℃ ． Under the above conditions，the extraction rate of caulerpin from the caulerpa lentillifera is 85% ． The model’
s square of Ｒ2 is 98． 4%，the experimental results indicate that the optimized extraction of caulerpin from the caulerpa
lentillifera by microwave assistant extracting and response surface methodology (ＲSM)is feasible． It provides a theo-
retical basis for improving the extraction rate of caulerpin．
Key words Caulerpa lentillifera;caulerpin;microwave extraction;response surface methodology (ＲSM)