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HPLC检测南海蕨藻中的蕨藻红素



全 文 :第 30卷 第 1期 暨南大学学报(自然科学版) Vol.30 No.1
2009年 2月 JournalofJinanUniversity(NaturalScience) Feb. 2009
 
[收稿日期 ]  2008-07-10
[基金项目 ]  国家自然基金项目(20472024, 20772047);广东省自然科学基金研究团队项目(039213)
[作者简介 ]  吴思超(1983-),女 ,硕士研究生 , 研究方向:天然产物.通讯作者:岑颖洲 ,教授 电话:(020)85223420, E-mail:ofx@jnu.edu.cn
HPLC检测南海蕨藻中的蕨藻红素
吴思超 1 ,  江海燕 1 ,  许少玉 1 ,  庄伟强 1 ,  李药兰2 ,  伍秋明 3 ,  岑颖洲 1
(暨南大学 1.生命科学技术学院化学系;2.药学院中药与天然产物研究所;3.测试中心 , 广东 广州 510632)
[摘 要 ]  建立南海大型经济海藻总状蕨藻的主要有效成分蕨藻红素的高效液相色谱(HPLC)定量分析检测方
法.取干燥蕨藻加体积分数 95%乙醇 80℃加热回流 3次 , 回流时间为 3h,固液比为 1∶20.减压浓缩得蕨藻乙醇提
取物浸膏 , 精密称取浸膏 , 甲醇 10ml定容.采用 DiscoveryC18(4.6mm×150 mm, 5μm)反相柱 , DAD检测器.检测
波长 315 nm,进样 20 μL, 流动相为甲醇和水(质量分数 1‰三氟乙酸)梯度洗脱 , 流速 1.0 mL/min.蕨藻红素在
1.006 ~ 10.06 μg范围内呈良好的线性关系 , r=0.9999, 平均回收率为 98.0%, RSD=0.92%.测得所采集的干燥
总状蕨藻中蕨藻红素的质量分数为 19.93 mg/g.该方法灵敏﹑可靠﹑准确性高 , 可用于同属海藻的蕨藻红素的定
量分析检测.
[关键词 ]  蕨藻红素; 高效液相色谱; 检测
[中图分类号 ]  R284.2  [文献标识码 ]  A  [文章编号 ]  1000-9965(2009)01-0092-04
Foundationofmethodofcaulerpininfernalgaeof
SouthChinaSeameasuredbyHPLC
WUSi-chao1 ,  JIANGHai-yan1 ,  XUShao-yu1 ,  ZHUANGWei-qiang1 ,
 LIYao-lan2 ,  WUQiu-ming3 ,  CENYing-zhou1
(1.DepartmentofChemistryofLifeScienceandTechnology;2.InstituteofTraditionalChineseMedicine&NaturalProducts,
ColegeofPhamacy;3.CenterofExperimentalTechnologyofJinanUniversity, Guangzhou510632 China)
[ Abstract]  Aquantitativeanalysismeathodforthedeterminationofisestablishedinthispapercauler-
pininFernAlgaeofSouthChinaSeabyHighPerformanceLiquidChromatography(HPLC).Drying
Caulerpawasextractedwith95%ethanolbyheatingcircumfluencein80 ℃for3timesandtherefluxing
timeof3h, andtheratio1∶10.Thentheethanolextractwasgotbyvaccuumconcentrationanddissolved
with10 mlmethanol.HPLCwasperfomedonDiscoveryC18(4.6 mm×150 mm, 5 μm), DADdetctor.
Thedetectionwavelenghwas315nm, themobilephasewasmethanolandwater(qualityscore1‰TFA),
velocityofflowwas1.0mL/min, injectionvolumewas20μL.Thecontentofcaulerpinshowedgoodline-
arityintherangeof1.006 ~ 10.06μg, r=0.9999.Theaveragerecoverywas98.0%, RSD=0.92%.
TheresultsshowedthatpergramdryFernAlgaecontained19.93mgcaulerpin.Thequantitativeanalysis
meathodissensitive, reliableandselective, andcanbeusedforthedetectiveofculerpinexistinginalgae.
[ Keywords]  caulerpin; highperformanceliquidchromatography; determination
  海洋的面积约占地球表面积的 70%, 由于海洋
生物的生态环境与陆地生物的迥然不同 ,这两类生
物的体内生物合成过程差别很大 ,所以海洋天然产
物与陆地天然产物的化学成分与生物活性往往差别
甚大.例如 ,在海洋独特的生态环境中 ,海藻属于被
吞食的弱者 ,海藻为了对付海洋食草动物的大量吞
食以维持自身的生存繁衍 ,有些海藻的体内会产生
一些能促进自身大量快速繁殖的生长激素类物
质 [ 1] .这类物质就有可能开发为刺激许多农作物
(包括浆果作物)生长和成熟的植物生长调节剂.国
内外已有文献报道表明 ,蕨藻红素(caulerpin)具有
显著的促进植物增长的作用 [ 2] ,另外还有报道 ,该
化合物还具有较好的抗肿瘤活性 [ 3] .迄今为止 ,国
内外还未见有对蕨藻红素的检测方法的相关文献报
道.由于蕨藻红素是总状蕨藻的主要活性成分之
一 ,为了进一步研究和开发这种颇具开发应用前景
的天然植物增长激素 ,本文建立了一种能准确测定
南海蕨藻中的蕨藻红素含量的 HPLC定量分析检测
方法.
1 实验部分
1.1 实验材料
甲醇(色谱纯),天津市化学试剂一厂;二重蒸
馏水(质量分数 1‰三氟乙酸).甲醇 ,乙醇 ,石油
醚 ,乙酸乙酯均是分析纯 ,购自天津市化学试剂一
厂.
总状蕨藻:广东海洋大学吉宏武等人在南海湛
江海域采集海藻样品 ,由青岛海洋研究所范晓鉴定
其生物种属.
1.2 主要仪器
HP1100系列高效液相色谱仪 ,包括 1311A四
元泵 , 1313自动进样器 , 1316A柱温箱 , 1314紫外—
可见检测器 , 1315BDAD;Agilent化学工作站.德国
BRUKER公司 EQUINOX-55型红外光光谱仪;
BrukerDaltonicsAPEXⅡ 4.70型号的 FT-ICRMS
高分辨质谱;500MHz超导核磁共振仪(德国 Bruker
公司);0.45 μm, 25mm微孔滤膜(上海市新亚净化
器件厂);高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限
公司);电子天平 (上海精天电子仪器有限公司);
UV-2102PC-型紫外分光光度计(尤尼柯仪器有
限公司 );HHS型数显恒温水浴锅(上海博讯实业
有限公司医疗设备厂);RE-52AAB旋转蒸发仪
(上海鹏嘉科技有限公司);SHZ-D型循环水式多
用真空泵(巩义市英峪予华仪器厂).
1.3 蕨藻红素标准品的制备
将新鲜的藻体用乙醇浸泡 ,乙醇提取物减压浓
缩后用乙酸乙酯萃取 , 萃取物经硅胶柱 (10 ~ 40
μm)减压柱层析 , V(石油醚)/V(乙酸乙酯)梯度淋
洗 ,再经硅胶柱梯度洗脱 , V(石油醚)/V(乙酸乙酯)
=7 /3的洗脱部分经乙醇重结晶提纯 ,得橙红色晶
体 , mp.为 319 ~ 320℃.通过波谱技术确定其结构.
1.4 对照品溶液的配制
精密称取蕨藻红素标准品适量 ,加甲醇配制成
50.3 mg/L的蕨藻红素对照品储备溶液.
1.5 样品溶液的制备
取粉碎后的干燥总状蕨藻 5 g,精密称定 ,置于
100 mL圆底烧瓶中 , 精密加体积分数 95%乙醇
50 mL在 80 ℃下水浴回流 2 h.减压浓缩得总状蕨
藻乙醇提取物的浸膏 ,精密称取浸膏 10.5 mg,用甲
醇定容于 25 mL容量瓶中.用 0.45 μm纤维素滤头
过滤 ,作为样品溶液.
2 方法与结果
2.1 结构鉴定方法与结果
通过 MS和 13C-NMR谱测定样品的相对分子
质量和结构.
MS以及 13C-NMR谱确定其分子式为 C24 H18
N2O4 ,相对分子质量为 398.质谱数据显示正离子
峰 [ M+H] +为 399,负离子峰 [ M-H] -为 397,所
以确定相对分子质量为 398.由于在 13C-NMR谱
上只显示 12个共振信号 ,恰为分子式中含碳数的一
半 ,同时 1H-NMR谱上的氢质子共振信号 ,也表明
该化合物为对称性分子 ,红外光谱 3 383 cm-1单一
尖峰以及 1 265 cm-1强吸收峰说明存在仲胺 ,其中
3 383cm-1为 νN-H, 1 265cm-1为 νC-N.1 688 cm-1
(νC=O)说明存在羰基 , 1 059cm-1为 νs, C-O-C.3 055
cm-1(νs, =C-H)、1 629 cm-1及 1 487 cm-1 (骨架振
动)说明存在芳香环.1H-NMR中 δ为 7.18、7.25、
7.47、7.59的 4个峰构成 abcd偶合系统 ,为邻二取
代苯环上 4个氢的特征 ,从而进一步确定分子中吲
哚结构的存在.值得注意的是 δ为 12.55的质子.
因为此化合物呈中性 ,所以位于如此低场的质子一
定是吲哚环氮上的氢.此氢原子受分子内氢键的影
响而向低场位移 ,所以分子中的羧酸甲酯必位于吲
哚环所连环的邻位上.通过与有关文献的该化合物
的光谱数据比较 ,确定该化合物为蕨藻红素 ,经结合
高效液相等仪器分析结果 ,该样品的纯度达到 99%
以上.其化学结构如图 1.
图 1 蕨藻红素
93 第 1期 吴思超 ,等:HPLC检测南海蕨藻中的蕨藻红素
2.2 检测波长的确定
取配好的蕨藻红素标准品溶液 ,于 200 ~ 400
nm进行紫外扫描 ,结果显示蕨藻红素对照品溶液在
315nm波长处有最大吸收峰 ,故选择 315 nm为测
定波长.
2.3 色谱条件
分别吸取上述对照品溶液和样品溶液 20 μL,
注入液相色谱仪 ,测定蕨藻红素的峰面积 ,按外标法
计算其含量.
分别以甲醇与水(质量分数 1‰三氟乙酸)按一
定比例的混合液作为洗脱剂作等度洗脱(V(甲醇)∶
V(水)=90∶10、70∶30、50∶50),结果发现用 90∶10
的洗脱剂洗脱时在 4 ~ 5 min就出峰 ,分离效果较
好 ,其它配比则长时间不出峰 ,分离效果不好.结合
蕨藻红素标准品和总装蕨藻乙醇粗提物 ,用甲醇与
水按一定配比的洗脱剂作梯度洗脱 ,出峰时间延后
20 ~ 30 min,分离效果则更为理想.总状蕨藻醇提
物高效液相分离谱图如图 2.
色谱条件:DiscoveryC18色谱柱 (4.6 mm×150
mm, 5μm);流动相甲醇与水(质量分数 1‰三氟乙
酸)梯度洗脱 , 洗脱条件为甲醇与水的配比在 30
min内由 10∶90变为 90∶10;流速 1.0 mL· min-1;
柱温:室温;检测波长 315nm.
图 2 总状蕨藻醇提物谱图
2.4 标准品的标准曲线与线性范围
精密吸取蕨藻红素标准品溶液(50.3 mg/L)2、
6、10、15、20 μL,注入液相色谱仪 ,按上述条件测定
峰面积 ,以峰面积对进样量(mg/L)进行回归 ,峰面
积为纵坐标 Y,样品质量浓度(mg/L)为横坐标 X作
标准曲线.结果表明蕨藻红素进样量在 1.006 ~
10.06 μg有良好的线性关系 ,蕨藻红素的线性回归
方程为 Y=50.165X-5.322, r=0.9999.该方法最
低检测限(按 S/N=3计)为 8ng.
2.5 精密度试验
精密吸取上述标准品溶液 ,连续进样 5次 (20
μL),测定峰面积 , RSD=0.22% (n=5),表示仪器
精密度良好.
2.6 提取条件的考察
分别比较乙醇体积分数 30%、 50%、 70%、
90%, 95%和无水乙醇对总状蕨藻的提取效果.取相
同海藻样品 5份 ,每份 10 g,分别加入 10倍量的不
同溶剂 , 80 ℃加热回流 2 h;将提取液滤过 ,采用
HPLC测定蕨藻红素的质量分数 ,结果测得其质量
分数(以每 g总状蕨藻乙醇提取浸膏中含有的蕨藻
红素质量比计 , 以下同此)分别为 9.90、 11.32、
14.51、16.77、 18.23、18.31 mg/g,表明无水乙醇的
提取效果最好.但从工艺提取制备成本考虑 ,应选
用体积分数 95%乙醇作为提取溶剂.
分别比较 50、70、90 ℃的体积分数 95%乙醇水
浴提取对总状蕨藻的提取效果.取相同海藻样品 3
份 ,每份 10g,分别在不同温度下提取 2h,提取液滤
过 ,测定蕨藻红素的质量分数.结果测得其质量分数
分别为 15.68、17.32、18.81 mg/g,表明水浴提取温
度为 90℃时其提取效果最佳.
在乙醇提取单因素研究结果的基础上 ,采用
L9(33)正交方法对提取工艺参数进行优化 ,正交试
验因素水平及实验结果与分析见表 1与表 2.
表 1 正交试验因素水平表
水平 次数A
t/h
B
固液比
C
1 1 1 1∶10
2 2 2 1∶15
3 3 3 1∶20
表 2 正交试验结果
试验号 A B C w(蕨藻红素)/(mg·g-1)
1 1 1 1 9.91
2 1 2 2 13.53
3 1 3 3 15.60
4 2 1 2 18.10
5 2 2 3 18.57
6 2 3 1 18.22
7 3 1 3 19.83
8 3 2 1 19.36
9 3 3 2 18.75
K1 0.130 0.159 0.158
K2 0.183 0.171 0.168
K3 0.193 0.175 0.177
R 0.063 0.016 0.022
94 暨南大学学报(自然科学版) 第 30卷
  由极差分析结果可知 , 正交优化条件为
A3C3B3 ,即蕨藻红素最佳提取工艺参数为在体积分
数 95%乙醇 80 ℃条件下加热回流 3次 ,回流时间
为 3h,固液比为 1∶20.在该条件下重复试验测得提
取浸膏里蕨藻红素质量分数为 19.93mg/g.
2.7 稳定性试验
取供试品溶液 ,按以上色谱条件 ,于 0、2、4、6、
8、10、16h,测定峰面积 ,结果 RSD=0.72%(n=7),
显示样品在 16h内稳定.
2.8 重复性试验
取在最佳工艺条件下提取得到的样品 6份 ,分
别精密称定 ,按方法提取进 20μL并测定峰面积 ,计
算蕨藻红素质量分数 ,结果该批样品中含蕨藻红素
平均值为 19.93 mg/g(即每 g总状蕨藻乙醇提取浸
膏中含 19.93 mg蕨藻红素), RSD=0.62%(n=6),
表明该方法重现性良好.
2.9 加标回收试验
采用加样回收法 ,精密称取已测知蕨藻红素质
量分数的总装蕨藻乙醇粗提物样品 6份 ,分别精密
加入不同质量的蕨藻红素对照品 ,测定其质量分数 ,
计算回收率 ,结果见表 3.本法具有良好的回收率.
表 3 加样回收试验结果
样品中蕨
藻红素的
质量 /mg
加入蕨藻红
素对照品
质量 /mg
回收质
量 /mg
回收
率 /%
平均回
收率 /% RSD/%
19.13 10.09 28.42 97.3
19.29 11.07 29.96 98.7 97.9  0.75
19.12 10.05 28.53 97.8
19.14 18.51 38.29 99.2
19.46 18.77 38.13 98.3 98.4  1.13
19.33 18.89 37.34 97.7
19.22 22.67 40.59 96.9
19.40 23.10 42.16 99.2 97.8  0.89
19.38 23.45 41.67 97.3
3 讨论
(1)迄今为止 ,还没有检索到应用 HPLC定量
检测蕨藻内蕨藻红素的方法的相关报道 , 本文所建
立的高效液相色谱检测条件为:DiscoveryC18色谱
柱 (416 mm×150mm, 5μm),检测波长 315 nm,进
样 20 uL,洗脱液为甲醇和水梯度洗脱 ,洗脱条件为
甲醇与水的配比在 30 min内由 10∶90变为 90∶10,
流速 1.0mL/min,该条件下蕨藻红素的出峰时间为
19.426min.
(2)在所确定的检测条件下测定样品中的蕨藻
红素 ,方法简单 、快捷 、容易操作.系统适用性实验 、
方法的专属性和方法确证实验表明 ,该方法专属性
强 ,精密度和准确度高 ,重现性较好 ,可满足样品的
分析测定要求.
(3)根据对蕨藻红素的有关研究报道 [ 4-5] ,蕨
藻红素无毒性 ,具有显著的促进植物生长的活性 ,是
一种具有开发前景的天然的植物生长激素 ,其广泛
存在于南海蕨藻中 ,生物来源十分丰富 ,而且含量较
高(约占藻体干品的 1%左右).蕨藻是中国南海的
资源十分丰富的经济海藻 ,所以深入开展南海蕨藻
的高值化深加工综合利用研究 ,对充分利用海洋资
源发展沿海地方经济及保护海洋生态环境都具有特
殊的意义 [ 6] .本文所建立的测定南海蕨藻内的蕨藻
红素含量的 HPLC检测法 ,为蕨藻红素的研究及开
发提供了一种具有实际应用价值的快速 、准确的分
析手段.
[参考文献 ]
[ 1]  黄丽波.海藻中植物生长激 Caulerpin的研究进展
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greenalgacaulerpa[ J] .Phytochemistry, 1987, 26(1):
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[责任编辑:黄建军 ]
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