全 文 ：　
第４３卷　第８期　
２０１３年８月
中 国 海 洋 大 学 学 报
ＰＥＲＩＯＤＩＣＡＬ　ＯＦ　ＯＣＥＡＮ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ　ＯＦ　ＣＨＩＮＡ
４３（８）：０４９～０５３
Ａｕｇ．，２０１３
一株微绿球藻的分离鉴定和生长特性分析
杨秀艳，朱葆华，李　赟，潘克厚
（中国海洋大学教育部海水养殖重点实验室，山东 青岛２６６００３）
摘　要：　从海南红树林底泥中分离得到微藻，经形态学及分子生物学鉴定，该微藻与微绿球藻属的海生椭球藻的亲缘关
系更近。比较培养基中不同营养盐浓度、盐度、氮源及氮浓度、磷浓度、ｐＨ 和温度对分离微绿球藻生长的影响。结果表
明，该分离微藻在盐度３０和７４．８ｍｇ／Ｌ　ＮａＮＯ３（氮质量浓度为１２．９１ｍｇ／Ｌ）、６．６ｍｇ／Ｌ　ＫＨ２ＰＯ４（磷质量浓度为１．７０５ｍｇ／
Ｌ）、ｐＨ＝６．０的ｆ／２培养基，２６°Ｃ下培养，培养７ｄ的细胞密度最高可达５　５９０×１０４个／ｍＬ，相对生长率为０．７８６　１。与微绿
球藻的相关报道进行比较分析，表明该分离藻是一低氮、低磷、较耐酸性环境的速生微绿球藻株系。
关键词：　海南；分离；鉴定；微绿球藻；影响生长
中图法分类号：　Ｑ１７５　　　　　文献标志码：　Ａ　　　　　文章编号：　１６７２－５１７４（２０１３）０８－０４９－０６
　  基金项目：国家海洋局能源专项（ＧＨＭＥ２０１１ＳＷ０３）；广东省教育部产学研结合项目（２０１１Ａ０９０２０００７３）资助
收稿日期：２０１２－０７－０５；修订日期：２０１３－０３－１９
作者简介：杨秀艳（１９８５－），女，硕士生。Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｖｊｉａ１２２１＠１６３．ｃｏｍ
　 通讯作者：Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｘｓｄｌｗｌ＠ｏｕｃ．ｅｄｕ．ｃｎ
　　微绿球藻属于绿藻门绿藻纲绿球藻目绿球藻属，
是在海水及淡水环境中均广泛分布的单细胞微藻，由
于易培养、细胞壁薄、营养丰富等特点，广泛作为水产
苗种培育的饵料微藻［１－３］。由于该藻种高不饱和脂肪
酸特别是二十碳五烯酸 （Ｅｉｃｏｓａ　ｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ　Ａｃｉｄ，
ＥＰＡ）含量丰富，目前常作为重要的ＥＰＡ源微藻受到
广泛重视［４－５］。但是由于微绿球藻细胞小、生长速度缓
慢、容易被污染及通过传统的光合自养培养体系难以
获得高的生物量等特点而限制了该藻种的规模化生
产［６］。分离筛选具有快速生长能力以及高脂肪酸尤其
是高不饱和脂肪酸含量的微绿球藻具有重要的应用前
景。本研究在对一株分离微绿球藻株进行鉴定的基础
上，通过优化培养基营养盐和培养条件，对该株微绿球
藻的生长特性进行了分析，以期为该微藻株系的广泛
应用提供一定的理论依据。
１　材料与方法
１．１微藻的分离纯化
将从海南红树林采取的底泥在海水中轻轻震荡，过
滤，滤液中加入Ｎ、Ｐ（ｆ／２培养基中浓度），室温、自然光
下培养２周后，培养液颜色逐渐变成绿色。在光学显微
镜下观察并用ｆ／２海水培养液对藻液进行稀释，吸取１００
μＬ稀释后的藻液涂布在事先消毒的固体ｆ／２培养基上，
使用封口膜封口，在６．０×１０２μｍｏｌ·ｍ
－２·ｓ－１光照强
度下、２４°Ｃ，光暗比１２∶１２的培养箱中培养。４周后
固体培养基上开始出现藻落，进一步培养２周后挑取
单藻落在ｆ／２液体培养基继续培养，待藻液颜色变成
深绿色，吸取藻液少许，鲁格氏液固定，在显微镜下观
察，基于藻细胞形态进行纯度及藻种的初步鉴定。
１．２微藻的基因组的提取及１８ＳｒＲＮＡ基因扩增
在细胞学鉴定基础上，本研究提取分离藻细胞的
ＤＮＡ，扩增１８ＳｒＲＮＡ基因序列用于该分离藻的分子
鉴定。微藻基因组的提取参照杨彩霞等［７］使用的
ＣＴＡＢ法，紫外荧光分光光度计测定提取ＤＮＡ的纯度
和浓度，－２０℃保存备用。
用于扩增１８ＳｒＲＮＡ序列的引物为真 核 藻 类 的
通 用 引 物 （正 向 序 列１８Ｎ１：５′－ＧＧＡＴＣＧＡＡＴ－
ＴＣＴＡＴＣＴＧＧＴＴＧＡＴＣＣＴＧＣＣＡＧ－３′； 反 向 序 列
１８Ｎ１１Ｒ：５′－ＣＴＣＡＧＴＡＡＧＣＴＴＧＡＴＣＣＴＴＣＣＧＣＡＧ
ＧＴＴＣＡＣＣ－３′）（Ｓｏｇｉｎ，１９９０），ＰＣＲ反应体系总体积
为５０μＬ，其中超纯水２２μＬ，正反向引物各１μＬ，模板
１μＬ，２５μＬ　ＴａｑＤＮＡ聚合酶，ｄＮＴＰ，Ｂｕｆｆｅｒ混合物。
反应条件：９４℃预变性５ｍｉｎ；９４℃变性１ｍｉｎ，５５℃
退火 １ｍｉｎ，７２ ℃ 延伸 ３ ｍｉｎ　１５ 秒，２９ 个循环；
７２℃延伸６ｍｉｎ。ＰＣＲ产物经１％琼脂糖凝胶电泳检
测，采用ＺＹＭＯ　ＲＥＳＥＡＲＣＨ试剂盒回收扩增序列，经
Ｐｅａｓｙ－ｔ１Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ试剂盒进行克隆，在含有Ａｍｐ的
ＬＢ固体培养基上培养１６ｈ，挑取白色转化子，经ＬＢ液
体培养基３７℃过夜培养。采用Ｔ－载体通用引物进行
ＰＣＲ扩增，琼脂糖凝胶电泳检测，阳性克隆交由上海生
工生物工程有限公司测序。
测序所得的序列经ＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．Ｎｃｂｉ．
ｎｌｍ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）比对后，挑选最高匹配的序列信息
作为构建系统树的参考，使用ｃｌｕｓｔａｌｘ．ｅｘｅ软件进行全
中　国　海　洋　大　学　学　报 ２　０　１　３年
序列比对后，用 ＭＥＧＡ４．０的邻接法（Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－ｊｏｉｎ－
ｉｎｇ）构建系统发育树。重复２　０００次计算ｂｏｏｔｓｔｒａｐ的
值。
１．３培养条件的优化
本实 验采用 ｆ／２ 培养 基 在 光 照 为 ６．０×１０２
μｍｏｌ·ｍ
－２·ｓ－１，光暗比为１２∶１２的培养箱中进行
分离藻的培养。保持其它培养条件一致，ｆ／４、ｆ／２和ｆ
海水培养基中、不同氮源（ＮＨ４）２ＣＯ３、ＮａＮＯ３、ＮＨ４
ＮＯ３和尿素、氮浓度分别是基本培养基 ＮａＮＯ３质量浓
度０．５、１．５、２．０、２．５和３．０倍，磷浓度分别是ｆ／２基本
培养基中ＫＨ２ＰＯ４浓度的０．５、１、１．５、２．０、２．５和３．０
倍，盐度梯度为１０、２０、２５、３０、３５和４０，不同ｐＨ梯度
为５．０、６．０、７．０、８．０和９．０及培养温度等对该分离藻
生长的影响。
在以上比较的基础上进行优化培养，用于优化培
养的初始接种密度为５０×１０４个／ｍＬ，培养周期７ｄ。
实验期间。
每处理组设置３次重复，藻细胞密度统计采用血
球计数板，将３次重复实验的结果用于进行平均统计
分析。数据统计分析采用ＳＰＳＳ１７．０软件进行单因素
方差分析（ＡＮＯＶＡ），显著性水平为Ｐ＜０．０５。
２　实验结果
２．１微藻分离和种类鉴定
光学显微镜下可以看出，分离的藻细胞呈游离状
态，形状近球形，直径在２～４μｍ，单个藻细胞有一个
侧生的色素体。所有藻细胞形态基本一致，可以认为
分离微藻纯度较高。
扩增分离微藻的 １８ＳｒＲＮＡ 序列并测序，经
ＢＬＡＳＴ对所测序列进行相似性搜索，选取 ＧｅｎＢａｎｋ
中与扩增序列相似性高的序列构建系统树（见图１），结
果显示该分离藻株的１８ＳｒＲＮＡ序列与微绿球藻属的
海生椭球藻（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ　ｍａｒｉｔｉｍａ （ＡＹ６８０７０３．
１））的相应序列相似度最高，可以认为此株微藻属于微
绿球藻属的海生椭球藻。
图１　基于１８ＳｒＲＮＡ序列构建分离藻 ＨＮ０１与相似种的ＮＪ树
Ｆｉｇ．１　ＮＪ　ｔｒｅｅ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　１８ＳｒＲＮＡ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｓｅｐａｒａｔｅｄ　ｍｉｃｒｏａｌｇａ　ＨＮ０１ａｎｄ　ｉｔｓ　ｓｉｍｉｌａｒ　ｓｐｅｃｉｅｓ
２．２分离微藻的生长特性分析
２．２．１培养基营养盐浓度及盐度对分离微绿球藻生长
的影响　　将指数生长期的藻细胞分别接入ｆ／４、ｆ／２
和ｆ海水培养基中，比较营养盐浓度对分离藻生长的
影响，结果显示（见图２），培养７ｄ的微绿球藻在３个
营养盐浓度的培养密度分别为１　８３８×１０４、２　４２０×１０４
和１　８３４×１０４个／ｍＬ，ｆ／２培养基中的微绿球藻细胞密度
图２　不同培养基对分离藻生长的影响
Ｆｉｇ．２　Ｔｈｅ　ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｎｕｔｒｉｅｎｔ　ｍｅｄｉｕｍ
ｏｎ　ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　ｓｅｐａｒａｔｅｄ　ｍｉｃｒｏａｌｇａ
比ｆ／４和ｆ培养基中的细胞密度分别高出３１．７％和
３１．９％，达显著性差异水平，表明ｆ／２培养基比较理想。
基于ｆ／２培养基，设置用于分离藻培养的盐度梯
度为１０、２０、２５、３０、３５和４０，比较盐度对其生长的影
响，结果发现，分离藻在６个实验盐度下均能正常生
长，培养液颜色均逐渐加深，说明该分离藻具有相当广
泛的盐度适应性。连续培养７ｄ后统计藻细胞密度，结
果显示（见图３），在盐度３０组，微绿球藻细胞密度最
高，为３　０５１×１０４个／ｍＬ。３个低盐度组，盐度从１０增
加至２５，分离藻生长无显著差异，细胞密度均不足
２　３５０×１０４个／ｍＬ，比盐度３０组细胞密度低２３％以
上，２个高盐度组细胞密度则存在显著不同，盐度４０组
比盐度３５组细胞密度低３２％以上，这说明该分离藻对
低盐度具有较强的适应能力，比较适合的培养盐度为
３０。该盐度与实验所用海水盐度（３０～３３）相似。
２．２．２ｐＨ 对分离微绿球藻生长的影响　　将分离藻
在ｐＨ为５．０、６．０、７．０、８．０和９．０的ｆ／２海水培养基
中培养７ｄ，结果显示（见图４），实验结束时各实验组藻
０５
８期 杨秀艳，等：一株微绿球藻的分离鉴定和生长特性分析
细胞均处于稳定生长期，但各实验组藻细胞密度存在显
著差别，ｐＨ＝６．０实验组，藻细胞密度最高，为３　４３８×
１０４个／ｍＬ，ｐＨ＝５．０实验组次之，细胞密度比ｐＨ＝６．０
实验组低１０．４７％。同样是ｐＨ变化１个单位，ｐＨ＝７．０
组则比ｐＨ＝６．０组细胞密度低３７．４６％，ｐＨ＝７．０组和
ｐＨ＝８．０组无显著差异，而ｐＨ＝９．０组也比ｐＨ＝８．０
组藻细胞密度低２９．１１％，这说明该分离藻对偏酸的培
养基具有较高的适应性，该分离藻培养液的最佳ｐＨ
为６．０。
２．２．３氮源及氮浓度对分离微绿球藻生长的影响　　
本实验首先比较了（ＮＨ４）２ＣＯ３、ＮａＮＯ３、ＮＨ４ＮＯ３和尿
素作为氮源对分离藻株生长的影响。ｆ／２基本培养基
中ＮａＮＯ３质量浓度为７４．８ｍｇ／Ｌ，对应氮质量浓度为
１２．９１ｍｇ／Ｌ。为保证培养基中氮质量浓度相等，经计
算加入培养液中的（ＮＨ４）２ＣＯ３、ＮＨ４ＮＯ３和尿素的质
量浓度分别为４４．３６、３６．８９和２７．６ｍｇ／Ｌ。
保持其它条件相同，在４个氮源的ｆ／２培养基培养
７ｄ，结果显示（见图５），藻细胞密度最高的是 ＮａＮＯ３
作为氮源的培养基，达到２　６３３×１０４个／ｍＬ，其次是含
有ＮＨ４ＮＯ３和（ＮＨ４）２ＣＯ３的培养基，而尿素作为氮源
的培养基，其细胞密度最低，仅为４３７．５×１０４个／ｍＬ。
在同样的氮质量浓度下，ＮａＮＯ３作为氮源，分离藻的生
物量比以 （ＮＨ４）２ＣＯ３作为氮源高出３８％，而比 ＮＨ４
ＮＯ３作为氮源仅高９．０％。结果显示，相对于铵态氮，
硝态氮更适合该分离藻的生长。
图５　不同氮源对分离藻生长的影响
Ｆｉｇ．５　Ｔｈｅ　ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　Ｎ　ｒｅｓｏｕｒｃｅ　ｏｎ
ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　ｓｅｐａｒａｔｅｄ　ｍｉｃｒｏａｌｇａ
进一步以ｆ／２基本培养基中的ＮａＮＯ３质量浓度作
为对照，比较分别是基本培养基ＮａＮＯ３质量浓度０．５、
１．５、２．０、２．５和３．０倍的培养液对微藻生长的影响。
结果表明（见图６），藻细胞密度最高的是对照组，其细
胞密度达３　８２７×１０４个／ｍＬ，其次为０．５倍氮浓度组，
细胞密度为３　０７８×１０４个／ｍＬ。而高于对照氮浓度的
实验组，随着氮浓度的增加藻细胞密度逐渐降低，如
ＮａＮＯ３质量浓度为对照组３倍的实验组，细胞密度只
有１　６９１×１０４个／ｍＬ，比对照组细胞密度低５５．８％。
结果表明，适合该分离藻生长的最佳 ＮａＮＯ３浓度为
７４．８ｍｇ／Ｌ。
图６　不同ＮａＮＯ３浓度对分离藻生长的影响
Ｆｉｇ．６　Ｔｈｅ　ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ＮａＮＯ３ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
ｏｎ　ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　ｓｅｐａｒａｔｅｄ　ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ
２．２．４磷浓度对分离微绿球藻生长的影响　　为分析
不同浓度的磷盐对该分离藻生长的影响，本研究设置
磷浓度梯度分别是ｆ／２基本培养基中ＫＨ２ＰＯ４浓度的
０．５、１、１．５、２．０、２．５和３．０倍６个实验组，培养７ｄ，结
果显示（见图７），在 ＫＨ２ＰＯ４浓度为１．５倍实验组，分
离藻的细胞密度最高，达４　７５０×１０４个／ｍＬ，其次是
ＫＨ２ＰＯ４浓度为２倍实验组，藻细胞密度为４　００６×１０４
个／ｍＬ，ＫＨ２ＰＯ４浓度为１倍和２．５倍实验组细胞密度
分别为３　８８５×１０４和３　５９３×１０４个／ｍＬ，细胞密度均较
低的是 ＫＨ２ＰＯ４浓度为３和０．５倍实验组，分别为
１５
中　国　海　洋　大　学　学　报 ２　０　１　３年
２　９６６．７×１０４和２　７７０×１０４个／ｍＬ。分析表明，０．５和
３．０倍实验组，以及１．０和２．０倍实验组，藻细胞密度
彼此间没有显著差异，而１．５倍实验组与其它实验组
的细胞密度均有显著差异。结果表明，该分离藻的最
佳ＫＨ２ＰＯ４浓度为ｆ／２培养基中磷浓度的１．５倍，即
６．６ｍｇ／Ｌ。
图７　不同磷浓度对分离藻生长的影响
Ｆｉｇ．７　Ｔｈｅ　ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　ｓｅｐａｒａｔｅｄ　ｍｉｃｒｏａｌｇａ
２．２．５温度对分离微绿球藻生长的影响　　本研究还
在保持光照强度及光暗比相同的条件下，比较了分离
藻２２、２４、２６和２８℃４个培养温度下的生长情况。结
果表明（见图８），该分离藻细胞密度最高的是温度为２６
℃实验组，达４　０２３×１０４个／ｍＬ；２８℃实验组细胞密度
为３　０７６×１０４个／ｍＬ，比２６℃实验组低２３．５４％；而
２２和２４℃实验组细胞密度均不足２　３５０×１０４个／ｍＬ，
不仅显著低于２６℃实验组，也显著低于２８℃实验组。
由此可见，该分离藻的最优培养温度是２６℃，其对高
温的耐受力明显高于对低温的耐受力。
图８　不同温度对分离藻生物量的影响
Ｆｉｇ．８　Ｔｈｅ　ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ
ｏｎ　ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　ｓｅｐａｒａｔｅｄ　ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ
２．２．６优化培养条件下分离微藻的细胞密度和相对生
长率　　在以上实验基础上，选择优化的氮源及氮浓
度、磷浓度、ｐＨ及温度在ｆ／２自然海水培养基培养该
分离藻，培养７ｄ后，其细胞密度可达５　５９０×１０４个／ｍＬ，
相对生长率为０．７８６　１。
３　讨论
基于１８ＳｒＤＮＡ序列信息进行藻类鉴定已经有相
当广泛的报道［１７－１８］，陈丽芬等［１８］认为根据１８ＳｒＤＮＡ
序列多样性能鉴定样品的分类到种一级水平，郑俊斌
等［１９］认为其可鉴定到属以上。一般认为，１８ＳｒＤＮＡ
序列保守性较高，种类鉴定到属以下还是存在一定的
困难，为此，侯建军等［２０］建议把１８ＳｒＤＮＡ的序列信息
和形态学结合起来进行种类鉴定。本实验将分离藻株
１８ＳｒＤＮＡ序列与基因库中与其相似性最高的微绿球
藻属的３个微藻种的相应序列同时进行比对，建立ＮＪ
树，结果可以看出，３个微藻种的亲缘关系彼此之间均
相当近，而分离藻株与海生椭球藻（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ
ｍａｒｉｔｉｍａ）的亲缘关系更为接近。鉴于微绿球藻属微
藻均是绿色球形，形态信息非常单一，要更具体的明确
该分离藻的分类地位还缺乏有力的证据，因而，本研究
仅能将分离藻定为微绿球藻属的微藻。目前微绿球藻
属微藻包括形态学在内的大量报道主要是利用眼点微
绿球藻（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ　ｏｃｕｌａｔａ）获得的，没有海生椭
球藻（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ　ｍａｒｉｔｉｍａ）的研究报道，本研究
只能参考微绿球藻属其它微藻种的研究结果。
关于已有微绿球藻在优化培养条件下的最高密
度，王秀良等［８］报道为４　０００×１０４个／ｍＬ，而王丽卿等
报道仅为４９３×１０４个／ｍＬ。潘庭双等［１０］报道微绿球
藻（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ　ｏｃｕｌａｔａ）相对生长速率为０．７２４
８。本实验从海南红树林底泥分离到的与海生椭球藻
（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ　ｍａｒｉｔｉｍａ）亲缘关系最近的微藻，其
细胞密度最高可达到５　５９０×１０４个／ｍＬ，相对生长速
率最高为０．７８６　１，均高于此前报道微绿球藻属微藻的
相应数据，这说明该分离藻具有比较突出的生长特性。
陈洁等［１５］报道眼点拟微绿球藻（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ
ｏｃｕｌａｔａ）在盐度为１３．７～３３．４的条件下都能得到良好
的生长，最适生长盐度为２６．９。本实验对分离微绿球
藻培养基中营养盐浓度及培养基海水盐度进行比较的
结果显示，ｆ／２培养基最为理想，在盐度为１０～４０均
能正常生长，理想的盐度为３０。王丽卿等［９］报道，微绿
球藻（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ　ｏｃｕｌａｔａ）最适生长培养基为ｆ
培养基，但是他们实验用水为天然河口中低盐度的水，
也许ｆ培养基较高的营养盐浓度一定程度上补偿了培
养用水的低盐度。也有研究报道微绿球藻比较理想的
培养基为ｆ及２ｆ培养基，说明微绿球藻对营养盐浓度
及盐度的适应范围也相当广泛。比较而言，该分离藻
适合低营养盐浓度。
本实验结果显示，该分离藻最适的氮源是硝态氮，
这与潘庭双等［１０］的报道基本相符。已有的报道显示，
微绿球藻（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ　ｏｃｕｌａｔａ）可以很好的利用
２５
８期 杨秀艳，等：一株微绿球藻的分离鉴定和生长特性分析
尿素，但本实验的结果表明，尿素明显抑制该分离藻的
生长。张青田等［１６］报道，尿素可经尿素酶转换为氨被
微藻利用，酶活性的差异可导致对尿素利用效率的不
同。Ｔｕｒｎｅｒ和 Ｍｏｎｃｉａ等［１３－１４］也认为藻类体内的相关
酶活性可造成藻对氮源喜好和利用的差异。该分离微
藻不能很好的利用尿素可能与此株藻体内尿素酶活性
较低有关。本次实验发现在培养基中氮浓度为１２．９１
ｍｇ／Ｌ时分离藻的生物量最高。潘庭双等［５］报道的微
绿球藻的最适氮浓度是２４．６４ｍｇ／Ｌ，黄翔鹄等［１１］报道
的微绿球藻的最适氮浓度为２８．３０ｍｇ／Ｌ，该分离藻最
适氮浓度仅为已报道最优氮浓度的５０％左右。黄翔鹄
等［１１］报道，微绿球藻生长的最适磷浓度为２．０７６ｍｇ／Ｌ，
本实验培养该分离藻最适磷浓度为１．７０５ｍｇ／Ｌ。与
已有微绿球藻属微藻相关优化的氮、磷培养浓度相比，
该分离藻理想的氮、磷浓度均较低。
王秀良等［８］报道的眼点拟微绿球藻在ｐＨ＝６．２～
９．８之间有良好的生长，ｐＨ＝５．５时生长抑制。本实
验分离藻在ｐＨ＝５～９的范围内均能生长，最优ｐＨ为
６．０，相对于优化的ｐＨ 提高一个单位，该分离藻的生
长即受到显著抑制，而降低一个ｐＨ单位时，该分离藻
的生长仅受到较低的抑制，说明该分离藻对高ｐＨ更为
敏感，这也许与该分离微藻分离自红树林海区的底泥有
关，在红树林海区底泥的ｐＨ在４～８之间。海南红树林
区域海水常年的平均温度为２４～２７℃，因而本实验分离
微拟球藻在２２～２８℃均能较好的生长，这说明分离微绿
球藻的生长条件与分离海区的环境存在一定关系。
综上所述，分离自海南红树林的微绿球藻 ＨＮ０１
的最适合培养基为ｆ／２培养基，最适氮源为ＮａＮＯ３，最
适氮质量浓度为 １２．９１ｍｇ／Ｌ，最适磷质量浓度为
１．７０５ｍｇ／Ｌ，最适ｐＨ为６．０，最适盐度为３０，最适温度
２６℃。与已有的微绿球藻相关报道比较，该分离藻是
一低氮、耐酸的速生藻株。
参考文献：
［１］　审核定，黄旭雄．三种藻类对中华绒螯蟹Ｉ期蚤状幼体培育效果
的比较 ［Ｊ］．上海水产大学学报，１９９９，８（３）：２０２－２０８９．
［２］　Ｌｕｂｚｅｎｓ　Ｅ，Ｇｉｂｓｏｎ　Ｏ．Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ａｄｖａｎｔａｇｅｓ　ｏｆ　ｆｒｏｚｅｎ　ａｌｇａｅ（Ｎａｎ－
ｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ　ｓｐ．）ｆｏｒ　ｒｏｔｉｆｅｒ（Ｂｒａ　ｃｈｉｏｎｕｓｐｌｉｃａｔｉｌｉｓ）ｃｕｌｔｕｒｅ［Ｊ］．
　　 Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ，１９９５，１３３：２９５－３０９．
［３］　Ｐｏｎｉｓ　Ｅ，Ｐｒｏｂｅｒｔ　Ｉ，Ｖｅｒｏｎ　Ｂ，ｅｔ　ａｌ．Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ　ｖａｌｕｅ　ｏｆ　ｓｉｓ　Ｐａｖ－
ｌｏｖｌｐｈｙｃｅａｅ　ｆｏｒ　Ｃｒａｓｓｏｓｔｒｅａ　ｇｉｇａｓ　ａｎｄ　Ｐｅｃｔｅｎｍａｘｉｍｕ　ｌａｒｖａｅ［Ｊ］．
Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ，２００６，２５４（１－４）：５４４－５５３．
［４］　Ｐａｂｋ　Ｊ　Ｂ　Ｋ，Ｃｒａｇｃｓ　Ｒ　Ｊ，Ｓｈｈｔｏｎ　Ａ　Ｎ．Ｗａｓｈｔｅｗａｔｅｒ　ｔｒｅａｔｍｅｎｒ
ｈｉｇｈ　ａｌｇａｌ　ｐｏｎｄｓ　ｆｏｒ　ｈｉｏｆｕｅｌ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏ－
ｇｙ，２０１１，１０２（１）：３５－４２．
［５］　Ｃｈｉｓｔｉ　Ｙ．Ｂｉｏｄｉｅｓｅ　ｆｒｏｍ　ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ［Ｊ］．Ｂｉｏｌｅｃｈｎｏｌａｄｖ，２００７，２５
（３）：２９４－３０６．
［６］　刘新富，雷霁霖，刘忠强，等．真鲷饵料生物褶皱臂尾轮虫和眼点
拟微绿藻的大量培养 ［Ｊ］．海洋科学，２０００（５）：４７－５１．
［７］　杨彩霞，李赟，王娜，等．应用ＤＧＧＥ技术分析桑沟湾贝藻混养
海区细菌群落结构的季节变化 ［Ｊ］．中国海洋大学学报：自然科
学版，２０１０，４１（增刊）：１２９－１３４．
［８］　王秀良，刘晨临，张学成．ｐＨ 对眼点拟微绿球藻的生长、总脂含
量及脂肪酸组成的影响 ［Ｊ］．海洋科学，２００２，２６（５）：６３－６７．
［９］　王丽卿，黄旭雄．不同营养盐浓度下微绿球藻（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ
ｏｃｕｌａｔａ）的生长及水体中氮磷的变化 ［Ｊ］．上海水产大学学报，
２００２，１１（３）：２１５－２１８．
［１０］　潘庭双，胡贤江，侯冠军，等．氮对微绿球藻（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ
ｏｃｕｌａｔａ）生长的影响 ［Ｊ］．安徽农业科学，２００１，２９（４）：５４８－
５５５．
［１１］　黄翔鹄，李长玲，刘楚吾，等．微绿球藻（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ　ｏｃｕｌａ－
ｔａ）对氮和磷营养盐需求的研究 ［Ｊ］．海洋科学，２００２，２６（８）：
１３－１７．
［１２］　徐立，吴瑜端．有机氮化合物对海洋、浮游植物的影响 ［Ｊ］．厦
门大学学报：自然科学版，１９９５，３４（５）：８２４－８２８．
［１３］　Ｔｕｒｎｅｒ　Ｍ　Ｆ．Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｏｍｅ　ｍａｒｉｎｅ　ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ　ｗｉｔｈ　ｓｐｅｃｉａｌ
ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｔｏ　ｖｉｔａｍｉｎ　ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ　ａｎｄ　ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ　ａｎｄ
ｃａｒｂｏｎ　ｓｏｕｒｃｅｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｍａｒ　Ｂｉｏｌ　Ａｓｓ　ＵＫ，１９７９，５９：５３５－５５２．
［１４］　Ｍｏｎｃｉａ　Ｂ　Ｖ，Ｄａｒｃｙ　Ｊ　Ｌ．Ａｕｒｅｏｃｏｃｃｕｓ　ａｎｏｐｈａｇｅｆｆｅｒｅｎｃｅ：Ｃａｕｓｅ
ａｎｄ　ｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｂｒｏｗｎ　ｔｉｄｅｓ　ｉｎ　Ｕ．Ｓ．ｍｉｄ－Ａｔｌａｎｔｉｃ
ｃｏａｓｔａｌ　ｗａｔｅｒｓ［Ｊ］．Ｌｉｍｎｏｌ　Ｏｃｅａｎｏｇｒ，１９９７，４２（５）：１０２３－１０３８．
［１５］　陈洁，蒋霞敏，段舜山．眼点拟微绿球藻生长的生态因子分析
［Ｊ］．生态科学，２００２，２１（１）：５０－５３．
［１６］　张青田，董双林，胡桂坤，等．不同氮源对微藻增殖的影响 ［Ｊ］．
海洋科学，２００５，２９（２）：８－１１．
［１７］　侯建军，赖红艳，黄邦钦．几种典型藻华生物的分子分类学分析
［Ｊ］．水生生物学报，２００８，３２（５）：７１１－７１８．
［１８］　陈丽芬，章群，骆育敏，等．１８ＳｒＤＮＡ 序列分析鉴定棕囊藻香
港株Ｐ２为球形棕囊藻 ［Ｊ］．生态科学，２００３，２２（４）：３４９－３５０．
［１９］　郑俊斌，张凤英，马凌波，等．米氏凯伦１８ＳｒＤＮＡ和转录间隔
区序列分析 ［Ｊ］．上海海洋大学学报，２００９，１８（６）：６８０－６８５．
［２０］　侯建军，陈纪新，黄邦钦．赤潮生物检测的分子探针技术研究进
展 ［Ｊ］．中国公共卫生，２００４，２０（９）：１１２７－１１２９．
（下转５９页）
３５
８期 田金虎，等：海洋微拟球藻转录组在指数期和平台期的差异分析
Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ　ｇａｄｉｔａｎａｉｎ
Ｌｏｇａｒｉｔｈｍ　ａｎｄ　Ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｐｈａｓｅｓ
ＴＩＡＮ　Ｊｉｎ－Ｈｕ１，ＺＨＥＮＧ　Ｍｉｎｇ－Ｇａｎｇ２，ＺＨＥＮＧ　Ｌｉ　２，ＸＩＡＯ　Ｌｉ－Ｊｉａ３，ＬＩ　Ｊｉａｎ－Ｂｏ３
（１．Ｆｏｏｄ　Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｓｈｉｈｅｚｉ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｉｈｅｚｉ　８３２００３，Ｃｈｉｎａ；２．Ｔｈｅ　Ｆｉｒｓｔ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｏｃｅａｎｏｇｒａｐｈｙ，Ｑｉｎｇｄａｏ　２６６０６１，
Ｃｈｉｎａ；３．Ｄａｔａｎｇ　Ｓｈａｎｄｏｎｇ　Ｐｏｗｅｒ　Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｑｉｎｇｄａｏ　２６６０６１，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：　Ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｌｉｐｉｄ　ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ　ｇａｄｉｔａｎａ
ｗａｓ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ　ｂｙ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅｓ　ｗｉｔｈ　Ｉｌｕｍｉｎａ　Ｈｉｓｅｑ　２０００．Ａｆｔｅｒ　ｔｒｉｍｍｉｎｇ　ａｎｄ　ｑｕａｌｉｔｙ
ｃｈｅｃｋｉｎｇ，ａ　ｔｏｔａｌ　ｏｆ　２９　２０３ｕｎｉｇｅｎｅｓ　ｗｅｒｅ　ｏｂｔａｉｎｅｄ．Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　７　３０５ｕｎｉｇｅｎｅｓ　ｗａｓ　ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ａｔ
ｌｏｇａｒｉｔｈｍ　ｇｒｏｗｔｈ　ｐｈａｓｅ　ｗｈｉｌｅ　９　７４５ｗｅｒｅ　ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ａｔ　ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ　ｇｒｏｗｔｈ　ｐｈａｓｅ．Ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ
ｓｅａｒｃｈ　ａｇａｉｎｓｔ　ＮＣＢＩ　ｄａｔａｂａｎｋ，１３　７７５ｕｎｉｇｅｎｅｓ　ｗｅｒｅ　ａｎｎｏｔａｔｅｄ．Ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ＫＥＧＧ　ｐａｔｈｗａｙ　ｄａｔａｂａｓｅ，２３８
ｐａｔｈｗａｙｓ　ｗｅｒｅ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ｏｎ　ｗｈｉｃｈ　８１８ｕｎｉｇｅｎｅｓ　ｗｅｒｅ　ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ａｔ　ｌｏｇａｒｉｔｈｍ　ｇｒｏｗｔｈ　ｐｈａｓｅ，ａｎｄ　２４８
ｐａｔｈｗａｙｓ　ｗｅｒｅ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ，ｏｎ　ｗｈｉｃｈ　ａｎｄ　１　１４８ｕｎｉｇｅｎｅｓ　ｗｅｒｅ　ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ａｔ　ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ　ｇｒｏｗｔｈ　ｐｈａｓｅ．
Ａｌｔｏｇｅｔｈｅｒ　１９５ｕｎｉｇｅｎｅｓ　ｗｅｒｅ　ｆｏｕｎｄ　ｔｏ　ｂｅ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｌｉｐｉｄ　ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，ｏｆ　ｔｈｅｍ　５３ｕｎｉｇｅｎｅｓ　ｗｅｒｅ　ｕｐ－ｒｅｇ－
ｕｌａｔｅｄ　ａｔ　ｌｏｇａｒｉｔｈｍ　ｇｒｏｗｔｈ　ｐｈａｓｅ　ａｎｄ　４７ｕｎｉｇｅｎｅｓ　ｗｅｒｅ　ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ａｔ　ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ　ｇｒｏｗｔｈ　ｐｈａｓｅ．Ｗｉｔｈ　ｔｈｅ
ｈｅｌｐ　ｏｆ　ＣＯＧ　ｄａｔａｂａｓｅ，１１　６０４ｕｎｉｇｅｎｅｓ　ｗｅｒｅ　ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ　ｉｎｔｏ　２５ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｃａｔｅｇｏｒｉｅｓ　ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　ｍａｔｅｒｉａｌ　ａｎｄ
ｓｉｇｎａｌ　ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ，ｅｎｅｒｇｙ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ，ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，ａｎｄ　ａｍｏｎｇ　ｏｔｈｅｒｓ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：　Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ　ｇａｄｉｔａｎａ；ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ；ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ
责任编辑　朱宝象
（上接５３页）
Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　Ｓｔｒａｉｎ　ｏｆ　Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ　ｓｐ．
ａｎｄ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｉｔｓ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ
ＹＡＮＧ　Ｘｉｕ－Ｙａｎ，ＺＨＵ　Ｂａｏ－Ｈｕａ，ＬＩ　Ｙｕｎ，ＰＡＮ　Ｋｅ－Ｈｏｕ
（Ｔｈｅ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｍａｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｏｃｅａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃｈｉｎａ，Ｑｉｎｇｄａｏ　２６６００３，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：　Ａ　ｓｔｒａｉｎ　ｏｆ　Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ　ｓｐ．ｗａｓ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｍａｎｇｒｏｖｅ　ｓｅｄｉｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈａｉｎａｎ　Ｐｒｏｖ－
ｉｎｃｅ　ａｎｄ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｔｏ　Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ．ｍａｒｉｔｉｍａ．Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｆａｃｔｏｒｓ（ｎｕｔｒｉｅｎｔ　ｍｅｄｉｕｍ，ｎｉ－
ｔｒｏｇｅｎ　ｒｅｓｏｕｒｃｅ　ａｎｄ　ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｓａｌｉｎｉｔｙ，ａｃｉｄｉｔｙ
ａｎｄ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）ｏｎ　ｉｔｓ　ｇｒｏｗｔｈ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｓｔｒａｉｎ　ｇｒｅｗ　ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ　ｂｅｔｔｅｒ
ｉｎ　ｎｕｔｒｉｅｎｔ　ｍｅｄｉｕｍ　ｆ／２ｗｉｔｈ　ｓａｌｉｎｉｔｙ　３０，７４．８ｍｇ／Ｌ　ＮａＮＯ３（Ｎ　ｍａｓｓ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｗａｓ　１．７０５ｍｇ／Ｌ），６．６
ｍｇ／Ｌ　ＫＨ２ＰＯ４（Ｐ　ｍａｓｓ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｗａｓ　１．７０５ｍｇ／Ｌ）ａｎｄ　ａｔ　ｐＨ　６．０ｔｈａｎ　ｕｎｄｅｒ　ｏｔｈｅｒ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ａｔ
２６℃，ｔｈｅ　ｃｅｌ　ｄｅｎｓｉｔｙ　ｃａｎ　ｒｅａｃｈ　ａｓ　ｈｉｇｈ　ａｓ　５　５９０×１０４　ｃｅｌｓ／ｍＬ　ｉｎ　７ｄａｙｓ（ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｒａｔｅ　ｗａｓ
０．７８６　１）．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｗｉｔｈ　Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ　ｏｃｕｌａｔａ，ｔｈｅ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｍｉｃｒｏａｌｇａ　ｗａｓ　ｆａｓｔ－ｇｒｏｗｉｎｇ　ａｎｄ　ｔｏｌ－
ｅｒａｎｔ　ｔｏ　ｌｏｗ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ　ａｎｄ　ｓｏｕｒｉｓｈ　ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：　Ｈａｉｎａｎ；ｉｓｏｌａｔｅｄ；ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ；Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ　ｍａｒｉｔｉｍａ；ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｆａｃｔｏｒｓ
责任编辑　朱宝象
９５