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一株微绿球藻的分离鉴定和生长特性分析



全 文 : 
第43卷 第8期 
2013年8月
中 国 海 洋 大 学 学 报
PERIODICAL OF OCEAN UNIVERSITY OF CHINA
43(8):049~053
Aug.,2013
一株微绿球藻的分离鉴定和生长特性分析
杨秀艳,朱葆华,李 赟,潘克厚
(中国海洋大学教育部海水养殖重点实验室,山东 青岛266003)
摘 要: 从海南红树林底泥中分离得到微藻,经形态学及分子生物学鉴定,该微藻与微绿球藻属的海生椭球藻的亲缘关
系更近。比较培养基中不同营养盐浓度、盐度、氮源及氮浓度、磷浓度、pH 和温度对分离微绿球藻生长的影响。结果表
明,该分离微藻在盐度30和74.8mg/L NaNO3(氮质量浓度为12.91mg/L)、6.6mg/L KH2PO4(磷质量浓度为1.705mg/
L)、pH=6.0的f/2培养基,26°C下培养,培养7d的细胞密度最高可达5 590×104个/mL,相对生长率为0.786 1。与微绿
球藻的相关报道进行比较分析,表明该分离藻是一低氮、低磷、较耐酸性环境的速生微绿球藻株系。
关键词: 海南;分离;鉴定;微绿球藻;影响生长
中图法分类号: Q175     文献标志码: A     文章编号: 1672-5174(2013)08-049-06
   基金项目:国家海洋局能源专项(GHME2011SW03);广东省教育部产学研结合项目(2011A090200073)资助
收稿日期:2012-07-05;修订日期:2013-03-19
作者简介:杨秀艳(1985-),女,硕士生。E-mail:lvjia1221@163.com
  通讯作者:E-mail:sxsdlwl@ouc.edu.cn
  微绿球藻属于绿藻门绿藻纲绿球藻目绿球藻属,
是在海水及淡水环境中均广泛分布的单细胞微藻,由
于易培养、细胞壁薄、营养丰富等特点,广泛作为水产
苗种培育的饵料微藻[1-3]。由于该藻种高不饱和脂肪
酸特别是二十碳五烯酸 (Eicosa pentaenoic Acid,
EPA)含量丰富,目前常作为重要的EPA源微藻受到
广泛重视[4-5]。但是由于微绿球藻细胞小、生长速度缓
慢、容易被污染及通过传统的光合自养培养体系难以
获得高的生物量等特点而限制了该藻种的规模化生
产[6]。分离筛选具有快速生长能力以及高脂肪酸尤其
是高不饱和脂肪酸含量的微绿球藻具有重要的应用前
景。本研究在对一株分离微绿球藻株进行鉴定的基础
上,通过优化培养基营养盐和培养条件,对该株微绿球
藻的生长特性进行了分析,以期为该微藻株系的广泛
应用提供一定的理论依据。
1 材料与方法
1.1微藻的分离纯化
将从海南红树林采取的底泥在海水中轻轻震荡,过
滤,滤液中加入N、P(f/2培养基中浓度),室温、自然光
下培养2周后,培养液颜色逐渐变成绿色。在光学显微
镜下观察并用f/2海水培养液对藻液进行稀释,吸取100
μL稀释后的藻液涂布在事先消毒的固体f/2培养基上,
使用封口膜封口,在6.0×102μmol·m
-2·s-1光照强
度下、24°C,光暗比12∶12的培养箱中培养。4周后
固体培养基上开始出现藻落,进一步培养2周后挑取
单藻落在f/2液体培养基继续培养,待藻液颜色变成
深绿色,吸取藻液少许,鲁格氏液固定,在显微镜下观
察,基于藻细胞形态进行纯度及藻种的初步鉴定。
1.2微藻的基因组的提取及18SrRNA基因扩增
在细胞学鉴定基础上,本研究提取分离藻细胞的
DNA,扩增18SrRNA基因序列用于该分离藻的分子
鉴定。微藻基因组的提取参照杨彩霞等[7]使用的
CTAB法,紫外荧光分光光度计测定提取DNA的纯度
和浓度,-20℃保存备用。
用于扩增18SrRNA序列的引物为真 核 藻 类 的
通 用 引 物 (正 向 序 列18N1:5′-GGATCGAAT-
TCTATCTGGTTGATCCTGCCAG-3′; 反 向 序 列
18N11R:5′-CTCAGTAAGCTTGATCCTTCCGCAG
GTTCACC-3′)(Sogin,1990),PCR反应体系总体积
为50μL,其中超纯水22μL,正反向引物各1μL,模板
1μL,25μL TaqDNA聚合酶,dNTP,Buffer混合物。
反应条件:94℃预变性5min;94℃变性1min,55℃
退火 1min,72 ℃ 延伸 3 min 15 秒,29 个循环;
72℃延伸6min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检
测,采用ZYMO RESEARCH试剂盒回收扩增序列,经
Peasy-t1Cloning Kit试剂盒进行克隆,在含有Amp的
LB固体培养基上培养16h,挑取白色转化子,经LB液
体培养基37℃过夜培养。采用T-载体通用引物进行
PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳检测,阳性克隆交由上海生
工生物工程有限公司测序。
测序所得的序列经BLAST(http://blast.Ncbi.
nlm.gov/Blast.cgi)比对后,挑选最高匹配的序列信息
作为构建系统树的参考,使用clustalx.exe软件进行全
中 国 海 洋 大 学 学 报 2 0 1 3年
序列比对后,用 MEGA4.0的邻接法(Neighbor-join-
ing)构建系统发育树。重复2 000次计算bootstrap的
值。
1.3培养条件的优化
本实 验采用 f/2 培养 基 在 光 照 为 6.0×102
μmol·m
-2·s-1,光暗比为12∶12的培养箱中进行
分离藻的培养。保持其它培养条件一致,f/4、f/2和f
海水培养基中、不同氮源(NH4)2CO3、NaNO3、NH4
NO3和尿素、氮浓度分别是基本培养基 NaNO3质量浓
度0.5、1.5、2.0、2.5和3.0倍,磷浓度分别是f/2基本
培养基中KH2PO4浓度的0.5、1、1.5、2.0、2.5和3.0
倍,盐度梯度为10、20、25、30、35和40,不同pH梯度
为5.0、6.0、7.0、8.0和9.0及培养温度等对该分离藻
生长的影响。
在以上比较的基础上进行优化培养,用于优化培
养的初始接种密度为50×104个/mL,培养周期7d。
实验期间。
每处理组设置3次重复,藻细胞密度统计采用血
球计数板,将3次重复实验的结果用于进行平均统计
分析。数据统计分析采用SPSS17.0软件进行单因素
方差分析(ANOVA),显著性水平为P<0.05。
2 实验结果
2.1微藻分离和种类鉴定
光学显微镜下可以看出,分离的藻细胞呈游离状
态,形状近球形,直径在2~4μm,单个藻细胞有一个
侧生的色素体。所有藻细胞形态基本一致,可以认为
分离微藻纯度较高。
扩增分离微藻的 18SrRNA 序列并测序,经
BLAST对所测序列进行相似性搜索,选取 GenBank
中与扩增序列相似性高的序列构建系统树(见图1),结
果显示该分离藻株的18SrRNA序列与微绿球藻属的
海生椭球藻(Nannochloropsis maritima (AY680703.
1))的相应序列相似度最高,可以认为此株微藻属于微
绿球藻属的海生椭球藻。
图1 基于18SrRNA序列构建分离藻 HN01与相似种的NJ树
Fig.1 NJ tree based on 18SrRNA between separated microalga HN01and its similar species
2.2分离微藻的生长特性分析
2.2.1培养基营养盐浓度及盐度对分离微绿球藻生长
的影响  将指数生长期的藻细胞分别接入f/4、f/2
和f海水培养基中,比较营养盐浓度对分离藻生长的
影响,结果显示(见图2),培养7d的微绿球藻在3个
营养盐浓度的培养密度分别为1 838×104、2 420×104
和1 834×104个/mL,f/2培养基中的微绿球藻细胞密度
图2 不同培养基对分离藻生长的影响
Fig.2 The influences of different nutrient medium
on the growth of separated microalga
比f/4和f培养基中的细胞密度分别高出31.7%和
31.9%,达显著性差异水平,表明f/2培养基比较理想。
基于f/2培养基,设置用于分离藻培养的盐度梯
度为10、20、25、30、35和40,比较盐度对其生长的影
响,结果发现,分离藻在6个实验盐度下均能正常生
长,培养液颜色均逐渐加深,说明该分离藻具有相当广
泛的盐度适应性。连续培养7d后统计藻细胞密度,结
果显示(见图3),在盐度30组,微绿球藻细胞密度最
高,为3 051×104个/mL。3个低盐度组,盐度从10增
加至25,分离藻生长无显著差异,细胞密度均不足
2 350×104个/mL,比盐度30组细胞密度低23%以
上,2个高盐度组细胞密度则存在显著不同,盐度40组
比盐度35组细胞密度低32%以上,这说明该分离藻对
低盐度具有较强的适应能力,比较适合的培养盐度为
30。该盐度与实验所用海水盐度(30~33)相似。
2.2.2pH 对分离微绿球藻生长的影响  将分离藻
在pH为5.0、6.0、7.0、8.0和9.0的f/2海水培养基
中培养7d,结果显示(见图4),实验结束时各实验组藻
05
8期 杨秀艳,等:一株微绿球藻的分离鉴定和生长特性分析
细胞均处于稳定生长期,但各实验组藻细胞密度存在显
著差别,pH=6.0实验组,藻细胞密度最高,为3 438×
104个/mL,pH=5.0实验组次之,细胞密度比pH=6.0
实验组低10.47%。同样是pH变化1个单位,pH=7.0
组则比pH=6.0组细胞密度低37.46%,pH=7.0组和
pH=8.0组无显著差异,而pH=9.0组也比pH=8.0
组藻细胞密度低29.11%,这说明该分离藻对偏酸的培
养基具有较高的适应性,该分离藻培养液的最佳pH
为6.0。
2.2.3氮源及氮浓度对分离微绿球藻生长的影响  
本实验首先比较了(NH4)2CO3、NaNO3、NH4NO3和尿
素作为氮源对分离藻株生长的影响。f/2基本培养基
中NaNO3质量浓度为74.8mg/L,对应氮质量浓度为
12.91mg/L。为保证培养基中氮质量浓度相等,经计
算加入培养液中的(NH4)2CO3、NH4NO3和尿素的质
量浓度分别为44.36、36.89和27.6mg/L。
保持其它条件相同,在4个氮源的f/2培养基培养
7d,结果显示(见图5),藻细胞密度最高的是 NaNO3
作为氮源的培养基,达到2 633×104个/mL,其次是含
有NH4NO3和(NH4)2CO3的培养基,而尿素作为氮源
的培养基,其细胞密度最低,仅为437.5×104个/mL。
在同样的氮质量浓度下,NaNO3作为氮源,分离藻的生
物量比以 (NH4)2CO3作为氮源高出38%,而比 NH4
NO3作为氮源仅高9.0%。结果显示,相对于铵态氮,
硝态氮更适合该分离藻的生长。
图5 不同氮源对分离藻生长的影响
Fig.5 The influences of different N resource on
the growth of separated microalga
进一步以f/2基本培养基中的NaNO3质量浓度作
为对照,比较分别是基本培养基NaNO3质量浓度0.5、
1.5、2.0、2.5和3.0倍的培养液对微藻生长的影响。
结果表明(见图6),藻细胞密度最高的是对照组,其细
胞密度达3 827×104个/mL,其次为0.5倍氮浓度组,
细胞密度为3 078×104个/mL。而高于对照氮浓度的
实验组,随着氮浓度的增加藻细胞密度逐渐降低,如
NaNO3质量浓度为对照组3倍的实验组,细胞密度只
有1 691×104个/mL,比对照组细胞密度低55.8%。
结果表明,适合该分离藻生长的最佳 NaNO3浓度为
74.8mg/L。
图6 不同NaNO3浓度对分离藻生长的影响
Fig.6 The influences of different NaNO3concentration
on the growth of separated microalgae
2.2.4磷浓度对分离微绿球藻生长的影响  为分析
不同浓度的磷盐对该分离藻生长的影响,本研究设置
磷浓度梯度分别是f/2基本培养基中KH2PO4浓度的
0.5、1、1.5、2.0、2.5和3.0倍6个实验组,培养7d,结
果显示(见图7),在 KH2PO4浓度为1.5倍实验组,分
离藻的细胞密度最高,达4 750×104个/mL,其次是
KH2PO4浓度为2倍实验组,藻细胞密度为4 006×104
个/mL,KH2PO4浓度为1倍和2.5倍实验组细胞密度
分别为3 885×104和3 593×104个/mL,细胞密度均较
低的是 KH2PO4浓度为3和0.5倍实验组,分别为
15
中 国 海 洋 大 学 学 报 2 0 1 3年
2 966.7×104和2 770×104个/mL。分析表明,0.5和
3.0倍实验组,以及1.0和2.0倍实验组,藻细胞密度
彼此间没有显著差异,而1.5倍实验组与其它实验组
的细胞密度均有显著差异。结果表明,该分离藻的最
佳KH2PO4浓度为f/2培养基中磷浓度的1.5倍,即
6.6mg/L。
图7 不同磷浓度对分离藻生长的影响
Fig.7 The influences of different phosphorus
concentration on the growth of separated microalga
2.2.5温度对分离微绿球藻生长的影响  本研究还
在保持光照强度及光暗比相同的条件下,比较了分离
藻22、24、26和28℃4个培养温度下的生长情况。结
果表明(见图8),该分离藻细胞密度最高的是温度为26
℃实验组,达4 023×104个/mL;28℃实验组细胞密度
为3 076×104个/mL,比26℃实验组低23.54%;而
22和24℃实验组细胞密度均不足2 350×104个/mL,
不仅显著低于26℃实验组,也显著低于28℃实验组。
由此可见,该分离藻的最优培养温度是26℃,其对高
温的耐受力明显高于对低温的耐受力。
图8 不同温度对分离藻生物量的影响
Fig.8 The influences of different temperature
on the growth of separated microalgae
2.2.6优化培养条件下分离微藻的细胞密度和相对生
长率  在以上实验基础上,选择优化的氮源及氮浓
度、磷浓度、pH及温度在f/2自然海水培养基培养该
分离藻,培养7d后,其细胞密度可达5 590×104个/mL,
相对生长率为0.786 1。
3 讨论
基于18SrDNA序列信息进行藻类鉴定已经有相
当广泛的报道[17-18],陈丽芬等[18]认为根据18SrDNA
序列多样性能鉴定样品的分类到种一级水平,郑俊斌
等[19]认为其可鉴定到属以上。一般认为,18SrDNA
序列保守性较高,种类鉴定到属以下还是存在一定的
困难,为此,侯建军等[20]建议把18SrDNA的序列信息
和形态学结合起来进行种类鉴定。本实验将分离藻株
18SrDNA序列与基因库中与其相似性最高的微绿球
藻属的3个微藻种的相应序列同时进行比对,建立NJ
树,结果可以看出,3个微藻种的亲缘关系彼此之间均
相当近,而分离藻株与海生椭球藻(Nannochloropsis
maritima)的亲缘关系更为接近。鉴于微绿球藻属微
藻均是绿色球形,形态信息非常单一,要更具体的明确
该分离藻的分类地位还缺乏有力的证据,因而,本研究
仅能将分离藻定为微绿球藻属的微藻。目前微绿球藻
属微藻包括形态学在内的大量报道主要是利用眼点微
绿球藻(Nannochloropsis oculata)获得的,没有海生椭
球藻(Nannochloropsis maritima)的研究报道,本研究
只能参考微绿球藻属其它微藻种的研究结果。
关于已有微绿球藻在优化培养条件下的最高密
度,王秀良等[8]报道为4 000×104个/mL,而王丽卿等
报道仅为493×104个/mL。潘庭双等[10]报道微绿球
藻(Nannochloropsis oculata)相对生长速率为0.724
8。本实验从海南红树林底泥分离到的与海生椭球藻
(Nannochloropsis maritima)亲缘关系最近的微藻,其
细胞密度最高可达到5 590×104个/mL,相对生长速
率最高为0.786 1,均高于此前报道微绿球藻属微藻的
相应数据,这说明该分离藻具有比较突出的生长特性。
陈洁等[15]报道眼点拟微绿球藻(Nannochloropsis
oculata)在盐度为13.7~33.4的条件下都能得到良好
的生长,最适生长盐度为26.9。本实验对分离微绿球
藻培养基中营养盐浓度及培养基海水盐度进行比较的
结果显示,f/2培养基最为理想,在盐度为10~40均
能正常生长,理想的盐度为30。王丽卿等[9]报道,微绿
球藻(Nannochloropsis oculata)最适生长培养基为f
培养基,但是他们实验用水为天然河口中低盐度的水,
也许f培养基较高的营养盐浓度一定程度上补偿了培
养用水的低盐度。也有研究报道微绿球藻比较理想的
培养基为f及2f培养基,说明微绿球藻对营养盐浓度
及盐度的适应范围也相当广泛。比较而言,该分离藻
适合低营养盐浓度。
本实验结果显示,该分离藻最适的氮源是硝态氮,
这与潘庭双等[10]的报道基本相符。已有的报道显示,
微绿球藻(Nannochloropsis oculata)可以很好的利用
25
8期 杨秀艳,等:一株微绿球藻的分离鉴定和生长特性分析
尿素,但本实验的结果表明,尿素明显抑制该分离藻的
生长。张青田等[16]报道,尿素可经尿素酶转换为氨被
微藻利用,酶活性的差异可导致对尿素利用效率的不
同。Turner和 Moncia等[13-14]也认为藻类体内的相关
酶活性可造成藻对氮源喜好和利用的差异。该分离微
藻不能很好的利用尿素可能与此株藻体内尿素酶活性
较低有关。本次实验发现在培养基中氮浓度为12.91
mg/L时分离藻的生物量最高。潘庭双等[5]报道的微
绿球藻的最适氮浓度是24.64mg/L,黄翔鹄等[11]报道
的微绿球藻的最适氮浓度为28.30mg/L,该分离藻最
适氮浓度仅为已报道最优氮浓度的50%左右。黄翔鹄
等[11]报道,微绿球藻生长的最适磷浓度为2.076mg/L,
本实验培养该分离藻最适磷浓度为1.705mg/L。与
已有微绿球藻属微藻相关优化的氮、磷培养浓度相比,
该分离藻理想的氮、磷浓度均较低。
王秀良等[8]报道的眼点拟微绿球藻在pH=6.2~
9.8之间有良好的生长,pH=5.5时生长抑制。本实
验分离藻在pH=5~9的范围内均能生长,最优pH为
6.0,相对于优化的pH 提高一个单位,该分离藻的生
长即受到显著抑制,而降低一个pH单位时,该分离藻
的生长仅受到较低的抑制,说明该分离藻对高pH更为
敏感,这也许与该分离微藻分离自红树林海区的底泥有
关,在红树林海区底泥的pH在4~8之间。海南红树林
区域海水常年的平均温度为24~27℃,因而本实验分离
微拟球藻在22~28℃均能较好的生长,这说明分离微绿
球藻的生长条件与分离海区的环境存在一定关系。
综上所述,分离自海南红树林的微绿球藻 HN01
的最适合培养基为f/2培养基,最适氮源为NaNO3,最
适氮质量浓度为 12.91mg/L,最适磷质量浓度为
1.705mg/L,最适pH为6.0,最适盐度为30,最适温度
26℃。与已有的微绿球藻相关报道比较,该分离藻是
一低氮、耐酸的速生藻株。
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(下转59页)
35
8期 田金虎,等:海洋微拟球藻转录组在指数期和平台期的差异分析
Transcriptome Analysis of Nannochloropsis gaditanain
Logarithm and Stationary Growth Phases
TIAN Jin-Hu1,ZHENG Ming-Gang2,ZHENG Li 2,XIAO Li-Jia3,LI Jian-Bo3
(1.Food Colege of Shihezi University,Shihezi 832003,China;2.The First Institute of Oceanography,Qingdao 266061,
China;3.Datang Shandong Power Generation Corporation Limited,Qingdao 266061,China)
Abstract: The relationship between lipid accumulation and gene expression in Nannochloropsis gaditana
was investigated by sequencing the transcriptomes with Ilumina Hiseq 2000.After trimming and quality
checking,a total of 29 203unigenes were obtained.The expression of 7 305unigenes was up-regulated at
logarithm growth phase while 9 745were up-regulated at stationary growth phase.Based on the similarity
search against NCBI databank,13 775unigenes were annotated.Using the KEGG pathway database,238
pathways were constructed on which 818unigenes were up-regulated at logarithm growth phase,and 248
pathways were constructed,on which and 1 148unigenes were up-regulated at stationary growth phase.
Altogether 195unigenes were found to be involved in lipid metabolism,of them 53unigenes were up-reg-
ulated at logarithm growth phase and 47unigenes were up-regulated at stationary growth phase.With the
help of COG database,11 604unigenes were clustered into 25functional categories including material and
signal transduction,energy production and conversion,amino acid metabolism,and among others.
Key words: Nannochloropsis gaditana;transcriptome;difference analysis
责任编辑 朱宝象
(上接53页)
Isolation and Identification of a Strain of Nannochloropsis sp.
and Analysis of its Growth Performance
YANG Xiu-Yan,ZHU Bao-Hua,LI Yun,PAN Ke-Hou
(The Key Laboratory of Mariculture,Ministry of Education,Ocean University of China,Qingdao 266003,China)
Abstract: A strain of Nannochloropsis sp.was isolated from the mangrove sediment of Hainan Prov-
ince and identified to Nannochloropsis.maritima.The effects of different factors(nutrient medium,ni-
trogen resource and corresponding nitrogen concentration,phosphorus concentration,salinity,acidity
and temperature)on its growth were determined.Results showed that the strain grew relatively better
in nutrient medium f/2with salinity 30,74.8mg/L NaNO3(N mass concentration was 1.705mg/L),6.6
mg/L KH2PO4(P mass concentration was 1.705mg/L)and at pH 6.0than under other conditions.At
26℃,the cel density can reach as high as 5 590×104 cels/mL in 7days(relative growth rate was
0.786 1).Comparison with Nannochloropsis oculata,the isolated microalga was fast-growing and tol-
erant to low nitrogen and sourish environment.
Key words: Hainan;isolated;identified;Nannochloropsis maritima;effect of different factors
责任编辑 朱宝象
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