全 文 ：收稿日期:2013 － 05 － 27
基金项目:河南省高校科技创新人才项目(编号:2012HASTTT004)
作者简介:孙紫琳(1985 －)，女，河南郑州人，学士，住院医师，主要
从事分子生物学研究。
通信作者:王志举(1970 －)，男，河南郑州人，博士，教授，主要从事
分子生物学研究
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。
本文引用:孙紫琳，王志举，司金超．白黎芦醇对离体培养的大鼠海马 CA1 区神经元谷氨酸神经毒性的保护作用［J］． 新乡医学院学报，
2013，30(11):861-864．
白黎芦醇对离体培养的大鼠海马 CA1 区神经元谷氨酸神经毒性的
保护作用
孙紫琳1，2，王志举1，司金超3
(1．郑州大学基础医学院生理学教研室，河南 郑州 450001;2． 郑州市第六人民医院急诊科，河南 郑州 450013;
3．郑州大学第二附属医院神经内科，河南 郑州 450003)
摘要: 目的 研究白黎芦醇对谷氨酸神经毒性损伤的离体大鼠海马 CA1 区神经元的保护作用及其机制。方法
将 1． 5 mmol·L －1的谷氨酸加入到原代培养的新生大鼠海马 CA1 区神经元培养液中，制造神经元毒性损伤模型;将
20 μmol·L －1的白黎芦醇分别加入到原代培养正常的和兴奋性毒性损伤的海马 CA1 区神经元培养液中，观察细胞形
态和存活率变化(噻唑蓝法和 Hoechst33324 荧光染色法);Western blot 检测细胞色素 C 来反映谷氨酸对神经元的损伤
作用，同时观察白黎芦醇对抗损伤的机制。结果 谷氨酸对海马 CA1 区神经元产生强烈的兴奋性毒性，导致神经元
大量凋亡和死亡;20 μmol·L －1的白黎芦醇对正常神经元的形态和存活率均无明显影响，但能对抗谷氨酸损伤和减轻
谷氨酸的兴奋性神经毒性，同时抑制谷氨酸诱发的细胞色素 C 表达上调。结论 白黎芦醇可通过下调海马 CA1 区神
经元细胞色素 C 的表达水平，降低谷氨酸的兴奋性毒性，对神经元起到保护作用。
关键词: 白黎芦醇;海马 CA1 区神经元;谷氨酸;细胞色素 C
中图分类号:Ｒ285． 5 文献标志码:A 文章编号:1004-7239(2013)11-0861-04
Protective effects of resveratrol on the hippocampus CA1 neuron suffered from glutamate
neurotoxicity in vitro
SUN Zi-lin1，2，WANG Zhi-ju1，SI Jin-chao3
(1． Department of Physiology，School of Basic Medicine Science，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001，Henan Province，Chi-
na;2． Department of Emergency，the Sixth People s Hospital of Zhengzhou City，Zhengzhou 450013，Henan Province，China;
3． Department of Neurology，the Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450003，Henan Province，China)
Abstract: Objective To investigate the protective effects and its possible mechanism of resveratrol on the cultured
hippocampus CA1 neurons suffered from glutanate neurotoxicity in vitro．Methods The 1． 5 mmol·L －1 glutamate was added
into the culture medium of primary cultured hippocampus CA1 neurons in vitro to induce the glutamate neurotoxicity model，and
then 20 μmol·L －1 resveratrol was added into the normal and the glutamate-neurotoxicity culture medium respectively to ob-
serve the morphologic change and the viability of cells(methyl thiazolyl tetrazolium test and Hoechst33324 fluorescent stai-
ning);The cytochrome C was detected by western blot to show the injury effect of glutamate on neurons and observe the protec-
tive effects of resveratrol． Ｒesults Glutamate could produce strong excitotoxicity on CA1 neurons，and induced a large number
of neuronal apoptosis and death． 20 μmol·L －1 resveratrol had no obvious effects on the morphologic change and the viability
of neurons． However，it could against the injury induced by glutamate and lighten the excitotoxicity of glutamate． Meanwhile，it
could inhibited the up regulation of cytochrome C induced by glutamate． Conclusion The resveratrol can reduce the
excitotoxicity of glutamate by down-regulating the expression level of cytochrome C and play a protection role on neurons．
Key words: resveratrol;hippocampus CA1 neuron;glutamate;cytochrome C
白黎芦醇(resveratrol，Ｒes)是一类存在于虎杖、
黎芦、葡萄等植物中的多酚类化合物，具有抗血小板
聚集、抗氧化、抗感染及抗肿瘤等作用［1］。近来大
量研究表明，Ｒes 可显著改善脑缺血、脑创伤和帕金
森病患者的学习记忆功能障碍［2-5］，但其作用机制尚
不十分明确。谷氨酸(glutamic acid，Glu)是一种兴
奋性氨基酸，对神经元可引起强烈的神经毒性损伤，
进而引起神经元功能障碍［6］，而海马是人和动物与
学习记忆功能相关的最重要部位，特别是海马的
CA1 区。因而在本研究中，作者选择海马 CA1 区神
经元作为研究对象，观察 Ｒes 对 Glu 神经毒性损伤
·168·
第 30 卷 第 11 期
2013 年 11 月
新乡医学院学报
Journal of Xinxiang Medical University
Vol． 30 No． 11
Nov． 2013
前后离体培养的海马 CA1 区神经元的影响，并探讨
其可能的作用机制。
1 材料与方法
1． 1 动物 1 ～ 2 日龄新生 SD 大鼠，由河南省实验
动物中心提供。
1． 2 药物与试剂 改良的 Eagle 培养基(Dulbeccos
modified Eagle medium，DMEM)培养液、胰蛋白酶为
美国 Hyclone 公司产品，胎牛血清购自杭州四季青
生物材料工程有限公司，噻唑蓝(thiazolyl blue tet-
razolium bromide，MTT)、L-谷氨酸、兔抗人细胞色素
C(cytochrome C，Cyt C)单克隆抗体购自美国 Sigma
公司，其余试剂均为国产分析纯。
1． 3 海马 CA1 区神经元原代培养和纯度鉴定 取
新生 SD大鼠(1 ～ 2 日龄)，体积分数 75%乙醇消毒
后迅速取脑，在冰冷的 Hanks 液中仔细剥除脑膜，取
双侧海马并游离出 CA1 区神经组织，用眼科剪尽量
剪碎，加 25 g·L －1胰蛋白酶放入 37 ℃孵箱内孵育消
化约30 min。待组织分散后，加等体积含 150 mL·L －1
血 清 的 培 养 液 终 止 消 化，然 后 吹 打、离 心
(1 000 r·min －1，10 min)后弃上清，加培养液重新
悬浮细胞，再次吹打使细胞分散，如上再离心洗细胞
1 次，弃上清，加含 150 mL·L －1血清的培养液悬浮
细胞，吹打使之成为单细胞悬液，用 400 目的筛网过
滤，细胞计数板做细胞计数，调节细胞密度为 1 ×
106 L －1接种入预先铺有多聚赖氨酸的培养瓶中培
养，倒置显微镜下观察记录细胞生长状况。取培养
3 d 的细胞爬片，用神经特异性烯醇化酶(neuron
specific enolase，NSE)抗血清，按 ABC 法免疫组织化
学染色进行神经元纯度鉴定。
1． 4 MTT法观察 Ｒes对原代培养海马 CA1 区神经
元存活的影响 将对数生长期的细胞用胰蛋白酶消
化后配制成 1 ×108 L －1，接种于 96 孔培养板，每孔加
入细胞悬液 100 μL。培养 12 h 后弃去孔内液体，加
入终浓度为 20 μmol·L －1的无菌 Ｒes［二甲基亚砜
(dimethyl sulfoxide，DMSO)液配置］，以不加 Ｒes 的细
胞作为空白对照。分别于培养 1、2、3、4、5、6、7 d 后，
向各孔加入 5 g·L －1的 MTT 20 μL，培养 4 h 后弃去
孔内液体，加入 150 μL DMSO，振荡 10 min，在酶标仪
上测定波长490 nm处的吸光度值(A)，记录对照组及
各实验组的 A 值。各实验组的 A 值与对照组相比较，
观察 Ｒes 对原代培养大鼠海马 CA1 区神经元存活率
的影响(对照组存活率记作 100%)。
1． 5 Hoechst33324 荧光染色法观察 Ｒes 对 Glu 损
伤前后海马 CA1 区神经元的影响 将培养 7 d 的
CA1 区神经元随机分为 3 组:空白对照组、Glu 损伤
组和 Ｒes 干预组。所有组别均吸弃培养液，并用磷
酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)洗细胞 3
次，然后空白对照组加无 Glu 的 PBS 液孵育 30 min
后，弃 PBS 液加培养液继续培养;Glu 损伤组加入含
1． 5 mmol·L －1 Glu 的 PBS 液孵育 30 min 后，弃
PBS 液加培养液继续培养;Ｒes 干预组在 Glu 损伤
前 10 h 加入 20 μmol·L －1终浓度的 Ｒes 并在损伤
后培养液中维持 Ｒes 浓度。
上述 3 组神经元培养 24 h 后，每组随机选 12
孔(24 孔板)神经元，向培养液中加入 Hoechst33324
荧光染色剂工作液(100 mg·L －1)，使培养液的终
浓度为 5 mg·L －1，轻轻振荡数次，使 Hoechst33324
荧光染色剂溶解到培养液中。培养板重新放回
37 ℃，体积分数 5% CO2 和 95%空气的培养箱培养
20 min。取出培养板，吸弃培养液，PBS 洗涤 3 次，体
积分数 4%多聚甲醛固定 10 min，甩干，加入抗荧光
淬灭封片液(上述所有操作均在避光条件下进行)，
荧光显微镜观察 Ｒes 对神经元 Glu 神经毒性作用的
影响。镜下发现，细胞核染色质凝集、分布不均的高
蓝色细胞为凋亡细胞，而染色质分布均匀的低蓝色
细胞为正常存活细胞。每孔随机取 3 个视野，连续
计数每个视野的细胞总数和凋亡细胞数，计算出凋
亡百分率，凋亡百分率 = 凋亡细胞数 /总细胞数 ×
100%，计算出 3 个视野的平均凋亡百分率，作为该
孔神经元的凋亡率，每组 12 孔。
1． 6 Western blot 检测 Cyt C 的表达 分组和处
理同 1． 5。所有组别均吸弃旧培养液，并用 PBS 洗
细胞 3 遍，加入含有 1． 5 mmol·L －1的 Glu 或终浓度
为 20 μmol·L －1的 Ｒes 培养液，继续培养 48 h 后细
胞裂解液提取细胞总蛋白，定量后取等量样本，进行
聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electropho-
resis，SDS-PAGE)分离，然后将蛋白转移至聚偏二氟
乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)上。将膜在
封闭液中封闭 2 h，与 Cyt C 及 β-actin 的一抗于 4 ℃
孵育过夜。洗膜后，再与相应的二抗室温孵育 1 h，
化学发光检测试剂检测 1 min 后显像，成像。蛋白
的相对表达量 =目的蛋白的灰度值 /内参 β-actin 的
灰度值，实验重复 3 次。
1． 7 统计学处理 应用 SPSS 17． 0 软件进行统计学
处理，实验数据以均数 ±标准差(珋x ± s)表示，组间比
较采用 t 检验，P ＜0． 05 为差异有统计学意义。
2 结果
2． 1 原代培养的海马 CA1 区神经元形态学观察
原代培养的大鼠 CA1 区神经元在接种后约 2 h 大部
分已经贴壁，接种初期细胞呈圆形，周边光晕明显。
·268· 新乡医学院学报 http:/ /www． xxyxyxb． com 2013 年 第 30 卷
24 h 后细胞贴壁完全，生长旺盛，大部分细胞伸出
突起，但突起间连接尚少。培养 2 ～ 3 d 后，胞体变
大，突起增粗伸长，以双极为主，相互连接成稀疏网
络(图 1A)。培养至 7 d 时，神经元胞体呈梭形或圆
形，细胞周围光晕明显，立体感和折光强，胞质丰富，
突起长并有许多分叉，表明神经元生长旺盛(图
1B)。待培养至 8 d 左右，神经元的突起互相交织成
网状，形成神经网络，表明神经元已成熟。培养至
3 d 的神经元经 NSE 鉴定，纯度达 90%，符合实验
要求(图 2)。
A:培养 3 d的海马 CA1 区神经元;B:培养 7 d的海马 CA1 区神经元。
图 1 原代培养的海马 CA1 区神经元的形态(×400)
Fig． 1 Neurons morphous in hippocampal CA1 under pri-
mary culture(×400)
图 2 海马 CA1 区神经元纯度鉴定(NSE 免疫组织化学染
色，×400)
Fig． 2 Purity identification of hippocampal CA1 neurons
(NSE immunohistochemical staining，×400)
2． 2 Ｒes对原代培养海马 CA1 区神经元存活的影
响 终浓度为 20 μmol·L －1的 Ｒes 对原代培养的大
鼠海马 CA1 区神经元的存活既没有明显的促进作
用，也没有明显的毒副作用。与对照组比较，差异无
统计学意义(P ＞ 0． 05)，这表明该浓度的 Ｒes 对正
常神经元的生长无影响(图 3)。
图 3 20 μmol·L －1的 Ｒes 对体外培养的海马 CA1 区神经
元存活的影响
Fig． 3 Effect of Ｒes(20 μmol·L －1)on survival of hipp-
ocampal CA1 neurons cultured in vitro
2． 3 Ｒes对海马 CA1 区神经元 Glu神经毒性作用
的影响 Glu 损伤组神经元的凋亡率为(17． 24 ±
3. 19)%，较对照组的(8． 26 ± 1． 47)%明显增加，差
异有统计学意义(P ＜ 0． 01);而 Ｒes 干预组神经元
的凋亡率为(11． 59 ± 2． 78)%，较 Glu 损伤组明显降
低，差异有统计学意义(P ＜ 0． 05);这表明 Glu 对海
马 CA1 区神经元可产生毒性作用，而 Ｒes 可减轻
Glu 的毒性。荧光染色结果表明，对照组以低蓝色
的正常细胞为主，偶见高蓝色的凋亡细胞，Glu 损伤
组以高蓝色的凋亡细胞为主，而 Ｒes 干预组可见大
量的正常细胞和散在其中的凋亡细胞(图 4)。
2． 4 海马 CA1 区神经元 Cyt C蛋白表达的变化
Western blot 结果发现，Glu 损伤组神经元的 Cyt C
蛋白表达量明显增加，而 Ｒes 干预组神经元的 Cyt C
蛋白表达量明显降低(与 Glu 损伤组相比)，这表明
Ｒes 可降低 Glu 毒性损伤神经元的 Cyt C 蛋白的表
达水平(图 5)。
A:对照组;B:Glu 损伤组;C:Ｒes干预组。
图 4 海马 CA1 区神经元凋亡的检测结果(×200)
Fig． 4 Apoptosis of hippocampal CA1 neurons(×200)
·368·第 11 期 孙紫琳，等:白黎芦醇对离体培养的大鼠海马 CA1 区神经元谷氨酸神经毒性的保护作用
1:正常细胞组;2:空白对照组;3:Glu 损伤组;4:Ｒes干预组。
图 5 Western blot检测海马 CA1区神经元 Cyt C蛋白表达
Fig． 5 Cyt C expression of hippocampal CA1 neurons by
Western blot assay
3 讨论
Glu 是中枢神经系统中最重要的兴奋性氨基
酸，脑损害后可引起受损脑组织过量释放 Glu，导致
细胞内 Ca2 + 超载，Na +、Cl － 和水的内流，以及产生
大量的自由基等，从而对脑细胞产生兴奋性毒性，引
起神经元水肿、空泡形成和凋亡等，进而引起神经元
死亡［7-9］。
本研究在原代培养的海马 CA1 区神经元培养
液中加入 1． 5 mmol·L －1的 Glu 后，经 Hoechst33324
荧光染色证实，神经元的凋亡率和死亡率均明显增
加。这表明 1． 5 mmol·L －1的 Glu 对原代培养的海
马 CA1 区神经元产生了毒性作用。
在原代培养的海马 CA1 区神经元培养液中加
入终浓度为 20 μmol·L －1的 Ｒes，无论作用时间长
短，对神经元均无促进存活的作用，也未发现其毒副
作用，但在 Glu 作用前 10 h 加入该浓度的 Ｒes 进行
干预，结果发现海马 CA1 区神经元的凋亡率和死亡
率均明显降低，这表明 Ｒes 具有对抗 Glu 的兴奋性
神经毒性作用。Hoechst33324 荧光染色也证实了
Ｒes 干预组神经元的凋亡率和死亡率均明显低于
Glu 损伤组。
Cyt C 是一种凋亡蛋白，通常存在于细胞的线粒
体内，当脑组织受到损伤时，凋亡信号可转导进入细
胞内，大大增加细胞线粒体膜的通透性，使得线粒体
内大量的 Cyt C 进入到细胞质内，而迅速激活死亡
驱动水解蛋白，如 caspases 等［10］。Marsden 等［11］研
究显示，线粒体不是凋亡引发器，而是具有某种扩大
caspase 级联的作用，造成神经元进一步凋亡和死
亡。Sugawara 等［12］研究也表明，全脑缺血可促进海
马 CA1 区神经元线粒体内的 Cyt C 大量释放入细胞
质中，诱导神经元的死亡信号不断放大，因而加速了
神经元的死亡。在本研究中，作者通过 Western blot
方法检测了 Glu 损伤组和 Ｒes 干预组神经元中
Cyt C 的表达水平，研究发现 Glu 损伤组神经元内
Cyt C 的表达水平明显上调，而 Ｒes 干预组神经元中
Cyt C 的表达水平较 Glu 损伤组明显下调，这表明
Ｒes 可通过下调海马 CA1 区神经元中 Cyt C 的表达
水平而对抗 Glu 的兴奋性神经毒性作用。
总而言之，本研究证实了 Ｒes 预处理可以减弱
Glu 对海马 CA1 区神经元的毒性损伤而起到保护神
经元的作用。这种保护作用可能与 Ｒes 阻止 Cyt C
从线粒体进入到细胞质内，以及下调神经元内 Cyt C
蛋白的表达水平有关。
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(本文编辑:徐刚珍 英文编辑:孟 月)
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