全 文 ：白黎芦醇 (resveratrol,RE)是植物性雌激素,具
有类雌激素样和抗雌激素双重作用,属于选择性雌激
素受体调节剂 (selectiveestrogenreceptormodulators,
SERMs)[1]。RE通过与雌激素受体 (estrogenreceptors,
ERs)相结合,激活下游的信号转导途径,从而发挥生
物学效应[2]。研究表明,一些 SERMs表现出抗雌激素
作用与抗肿瘤特性[3]。本实验观察了 RE对大鼠垂体
腺瘤细胞系 (GH3细胞)泌乳素 (PRL)合成分泌和
细胞增殖的影响,及其与ERs的关系,探讨RE对垂体
PRL腺瘤的抑制作用及其可能调控机制。
1 材料与方法
1.1 细胞培养 GH3大鼠垂体腺瘤细胞株 (中国医学
科学院基础所细胞中心提供),用 HamsF10培养基
(Gibco-Invitrogen)培养,内含热灭活的 15%马血清
(Gibco)和 2.5%胎牛血清 (Gibco),5U/ml青霉素,
5μg/ml链霉素。细胞常规在37℃、5%CO2、100%湿度
的孵箱中培养。实验前在倒置显微镜下观察,取形态
良好、对数生长期细胞,换无血清无酚红HamsF12培
养基 (Gibco)培养进行实验。细胞贴壁 24h后给药,
加入 RE(Sigma),17β-雌二醇 (E2,Sigma),特异性
ER-α激动剂 PPT(Propylpyrazoletriol,Tocris),特异
性 ER-β激动剂 DPN(diarylpropionitrile,Tocris),继
续培养3d后检测各种指标。
白黎芦醇对GH3细胞生长和泌乳素合成分泌
的抑制作用及其与雌激素受体的关系
胡志强 1,*王 超 2,初 明 2,程 玉 2,杨孔宾 2,李守巍 2,胡恩喜 2
(1.北京世纪坛医院神经外科,北京 100038;2.哈尔滨医科大学附属第一医院神经外科,黑龙江 哈尔滨 150001)
摘要:目的 探讨白黎芦醇(RE)对垂体腺瘤GH3细胞增殖和泌乳素(PRL)合成分泌的影响,及其与雌激素受体(ERs)的关系。方法
RE作用于GH3细胞,用免疫荧光法和Western印迹法测定ERs的表达情况,分别用ELISA法和Western印迹法测定培养基内和细
胞内 PRL水平,用 MTT法测定细胞增殖,同时观察了雌二醇(E2)和特异性雌激素受体激动剂对 RE的拮抗作用。结果 RE改变
ERs表达水平,减少PRL合成分泌,抑制GH3细胞增殖,E2和特异性雌激素受体激动剂对RE有拮抗作用。结论 RE通过ERs抑制
PRL合成、分泌及细胞增殖,从而发挥抗肿瘤作用,两种效应的信号转导途径不尽相同。
关键词:垂体肿瘤;白黎芦醇;催乳素;受体,雌激素
中图分类号:R736.4 文献标识码:A 文章编号:1009-122X(2006)12-0562-04
InhibitoryefectofresveratrolonGH3celgrowthandsynthesis
ofprolactinanditsrelationtoestrogenreceptors
HUZhiqiang1,WANGChao2,CHUMing2,etal
1.DepartmentofNeurosurgery,ShiJiTanHospital,Beijing100038,China;2.DepartmentofNeurosurgery,FirstAfiliatedHospital,Harbin
MedicalUniversity,Harbin150001,China.
Abstract:ObjectiveToinvestigatetheefectsofresveratrolonGH3proliferationandsynthesisandsecretionofprolactininpituitary
adenomasandtherelationtoestrogenreceptors.MethodsGH3celsweretreatedwithresveratrol.Theexpressionofestrogenreceptorswas
detectedbyimmunocytochemistryandWesternbloting;prolactinlevelsintheculturemediumandcelswereexaminedusingWestern
blotingandELISA;thecelproliferationwasassessedbyMTTassay.Antagonismofestradiolandestrogenreceptoragonistsonresveratrol
wasobserved.ResultsResveratroldecreasedexpressionlevelofestrogenreceptorprotein,suppressedsynthesisandsecretionofprolactin,
andinhibitedCH3celproliferation.Theseefectsofresveratrolwerediferentlyreversedbyestradiolandspecificestrogenreceptoragonists.
ConclusionThesefindingsindicatethatresveratrol,anantiestrogen,exertsitsantitumorefectviaestrogenreceptorsactingonGH3celsin
twoways:suppressionofcelgrowthandinhibitionofprolactinsynthesis.Diferentsignaltransductionpathwaysareinvolvedinthetwo
efectsofresveratrol.
keywords:pituitaryneoplasms;resveratrol;prolactin;receptors,estrogen
·实验研究·
收稿日期:2006-01-16;修回日期:2006-10-18
基金项目:国家自然科学基金资助项目 (30370516);黑龙江省青年科
学技术专项资金 (QC05C32);北京世纪坛医院科研基金(2006-05)
作者简介:胡志强(1963-),男,黑龙江哈尔滨人,医学博士,北京世纪
坛医院主任医师,教授,博士研究生导师。研究方向:微创神经外科,侵
袭性垂体腺瘤生物学行为研究
通讯作者:*王超(1975-),男,山东平度市人,医学博士,哈尔滨医科
大学附属第一医院主治医师。研究方向:垂体瘤的诊断和治疗
中国微侵袭神经外科杂志(CMINSJ),2006,11(12)562· ·
图3 不同浓度RE对GH3细胞PRL分泌的影响
1.2 免疫荧光标记 将涂有 0.01%多聚赖氨酸的盖
玻片放入培养板内,使GH3细胞生长在盖玻片上,药
物作用完毕后取出盖玻片,进行免疫荧光标记。兔抗
鼠ER-α多克隆抗体 (SantaCruz,工作浓度1∶200),
兔抗人 ER-β多克隆抗体 (UpstateBiotechnology,工
作浓度1∶200),羊抗兔FITC-IgG抗体 (Sigma,工作
浓度1∶100),羊抗兔 TRITC-IgG抗体 (Sigma,工作
浓度 1∶100)。以 488nm、560nm波长激光激发样
品,荧光显微镜下进行观察。
1.3 大鼠 PRL的 ELISA实验 检测时首先将标准
品和标本各 50μl加入相应的反应孔中。每孔加入
100μl酶联物 (大连泛邦公司),轻轻混匀 30s,室温
60min。用洗涤液洗板5次,加入100μl显色液,轻轻
混匀 10s,室温 20min。每孔加入 50μl终止液,轻轻
混匀30s,30min内在ELISA检测仪上测定各孔的吸
光度 (A450nm值)。计算变化率,变化率 (%)= (实
验组 A450nm值 /对照组 A450nm值)×100%。每
组实验重复3次,取平均值。
1.4 细胞增殖检测 在给药后第 3天检测细胞生长
情况,采用四甲基偶氮唑蓝 (MTT)比色分析法。1×
105个 /ml的细胞接种于 96孔培养板内,200μl/孔。
药物作用68h后加5mg/mlMTT(Sigma),20μl/孔,
继续培养 4h,去上清,每孔加二甲基亚砜 (DMSO,
Sigma)200μl,震荡 10min,在 Bio-Rad550酶标仪
490nm波长处测定各孔吸光度值 (A490nm值)。计
算变化率,变化率 (%)= (实验组 A490nm值 /对
照组A490nm值)×100%。每组实验重复 3次,取平
均值。
1.5 Western印迹法 药物作用完毕后,冰浴中加入
RIPA裂解液裂解细胞。12000rpm,4℃离心 15min
去除细胞碎片后,留取上清,取少量上清用考马斯亮
蓝法测定蛋白质含量。取含 30～75μg蛋白的细胞裂
解液进行 SDS-PAGE电泳,蛋白转移至聚偏二氟乙
烯 (PVDF)膜上。2%牛血清白蛋白室温封闭过夜,
TBS-T洗涤液(10mmol/LTris-HCl,pH7.4,150mmol/L
NaCl,1%Tween-220)洗膜 4次,每次 5min。分别加
入一抗 (ER-α,SantaCruz,工作浓度 1∶200;ER-β,
UpstateBiotechnology,工作浓度 1∶200;PRL,Santa
Cruz,工作浓度1∶200),以β-肌动蛋白作为内参照,
于 4℃条件下孵育过夜,再加入二抗 (辣根过氧化物
酶结合的抗体,Amersham,工作浓度 1∶1000),室温
下摇动1h,洗膜。用ECL(Amersham)化学发光试剂
盒检测杂交信号。用 Quantityone软件测量条带灰度,
再以内参照 β-肌动蛋白的灰度值为基础,测定各组
的相对比值。同时设对照组的相对比值为1。每组试验
重复3次,取平均值。
1.6 统计学处理 实验数据以均数±标准差表示,运
用方差分析,Studentstest,SNK-q检验行统计学处理。
2 结 果
2.1 RE对雌激素受体 ER-α和 ER-β表达的影响
不同浓度 RE作用于 GH3细胞 3d,用免疫荧光法和
Western印迹方法检测 ER-α和 ER-β表达情况。免
疫荧光结果 (图 1)显示,所有细胞均表达 ER-α和
ER-β两种受体,但细胞间表达强度不一,可能是细胞
间接触和细胞周期等因素造成的。Western印迹结果
(图 2)显示,与对照组比较,RE降低 ER-α和 ER-β
水平,高浓度RE抑制效果明显。
2.2 RE对 PRL合成和释放的影响 ELISA法检测
结果(图3)显示,在所选浓度范围内,RE对GH3细胞
的基础PRL分泌具有抑制作用,呈剂量依赖性,与对
RE的浓度
图2 Western印迹法检测 RE作用后 GH3细胞的雌激素受体
ER-α和ER-β的表达情况
图1 雌激素受体在GH3细胞中的表达情况 (免疫荧光 400×)
1AER-α1BER-β
1A 1B
ER-α
ER-β
β-actin
10对照组 50 100 500μmol/L
胡志强,等.白黎芦醇对GH3细胞生长和泌乳素合成分泌的抑制作用及其与雌激素受体的关系 563· ·
照组比较有显著性差异 (P<0.01)。其中 500μmol/L
抑制作用最大,此时培养液中 PRL浓度仅为对照组
的25%。
2.3 细胞内PRL蛋白水平 Western印迹方法结果(图
4)显示,在一定的浓度范围内(10μmol/L~100μmol/L),
RE使细胞内PRL蛋白水平降低,并呈剂量依赖性,与
对照组比较有显著性差异 (P<0.01),说明 RE可抑
制GH3细胞合成PRL。但高浓度 (500μmol/L)RE对
细胞内PRL水平无影响,即此浓度的RE不能抑制PRL
合成。分别用10nmol/LE2、10nmol/LPPT、10nmol/L
DPN与 50μmol/L的 RE同时作用于 GH3细胞,
Western印迹结果 (图 5)显示,E2、PPT和 DPN不同
程度地逆转RE抑制PRL合成的作用,与 RE单独作
用比较有显著性差异 (P<0.01),其中 E2的逆转作
用最强。
2.4 RE对 GH3细胞增殖的影响 MTT检测结果
(图 6)显示,在所选的浓度范围内 (10μmol/L~
500μmol/L),RE抑制细胞增殖,呈剂量依赖性,与对
照组比较有显著性差异 (P<0.01)。分别用10nmol/L
E2、10nmol/LPPT、10nmol/LDPN与 50μmol/L的
RE同时作用于 GH3细胞,结果显示 (图 7),E2、PPT
可以逆转 RE抑制增殖的作用,与 RE单独作用比较
有显著性差异 (P<0.01),而DPN不能逆转RE抑制
增殖的作用。
3 讨 论
垂体 PRL腺瘤属于雌激素相关肿瘤,雌激素参
与诱发 PRL腺瘤,调控着 PRL腺瘤的增殖和分泌[4]。
雌激素的大部分生物学效应是通过 ERs介导[5],所有
PRL腺瘤均表达ERs,而且实验证实ERs的表达量与
PRL腺瘤的大小有关[4]。可见,雌激素、ERs与垂体
PRL腺瘤三者之间关系密切,因此抗雌激素治疗为
PRL腺瘤的治疗提供了新的途径。RE是近年来研究
较多的选择性雌激素受体调节剂,在许多实验中均证
实 RE具有抗雌激素和抗肿瘤特性[1]。本实验着重从
ERs的角度,研究了RE对PRL腺瘤的治疗作用及其
机制。
RE对 ERs的亲和力远远低于 E2对 ERs的亲和
力,一般植物性雌激素对 ER-β的亲和力远远大于
ER-α的亲和力,但 RE对 ER-α和 ER-β两者的亲
和力近乎相同,RE的这种特性可能与其空间构象有
关[3]。本实验结果显示:GH3细胞表达 ER-α和 ER-β
两种受体,且RE可以降低ER-α和ER-β的水平,因
此两种受体均介导了RE的生物学效应。另外,有研究
证实 E2也可以抑制 GH3细胞表达 ER-α[6],由于 RE
和E2均能抑制 ER-α的表达,提示 ER-α可能是 RE
能够发挥类雌激素样作用的信号转导途径之一。图6 不同浓度RE对GH3细胞增殖的影响
图4 不同浓度RE对GH3细胞PRL合成的影响
450
control RE RE+PPTRE+DPNRE+E2
0
50
100
300
350
400
E2
A
49
0
nm
值
变
化
率
(%
)
250
300
200
150
图7 E2、PPT、DPN对RE抑制GH3细胞增殖的拮抗作用
中国微侵袭神经外科杂志(CMINSJ),2006,11(12)564· ·
PRL水平降低和内分泌症状改善是 PRL腺瘤药
物治疗的重要目的,因此我们研究了RE对PRL合成
和分泌的影响。研究结果证实,在无血清、无酚红的培
养条件下,GH3细胞可合成和分泌PRL;RE可明显降
低细胞内和培养液中 PRL水平,抑制 PRL的合成分
泌。但当RE浓度升高至500μmol/L时,虽RE仍可降
低培养液中PRL水平,却没有改变细胞内PRL水平。
随着RE浓度的升高,RE的类雌激素样作用增加,可
能拮抗了其抗雌激素样作用,此时RE对PRL的合成
无影响。而此浓度下培养液中 PRL浓度降低,可能由
于细胞总数减少或PRL释放减少造成,有待于进一步
研究。
实验也观察到 E2可刺激 PRL合成,而且有研究
证实ER-α和ER-β均介导了E2的这种刺激作用[6,7]。
本实验中,E2能够逆转RE对PRL合成分泌的抑制作
用,说明 RE是通过 ERs发挥拮抗作用。而且特异性
ER-α激动剂PPT、特异性ER-β激动剂DPN也有类
似的逆转作用,说明 ER-α和 ER-β均介导了 RE对
PRL合成的抑制。
RE可抑制GH3细胞增殖,并呈剂量依赖性,与初
明等[8]报道一致。E2和特异性 ER-α激动剂 PPT能拮
抗RE的抑制增殖作用,而特异性ER-β激动剂DPN
无此效应,说明 RE抑制细胞增殖的作用由 ER-α介
导。Kansra等[9]观察到特异性 ER-α激动剂 PPT具有
拮抗完全性雌激素受体拮抗剂ICI182、780,抑制GH3
细胞增殖的作用,可见ER-α对GH3细胞的增殖起着
极其重要作用。实验发现[10]E2与ER-α和ER-β作用
后,ER-α和ER-β介导相反的生物学效应。因此尽管
特异性 ER-β激动剂 DPN不能逆转 RE的抑制增殖
作用,但不能就此认为ER-β对细胞增殖无作用,ER-
β可能和 RE一样抑制细胞增殖,但本试验并未观察
到特异性 ER-β激动剂 DPN增强 RE抑制细胞增殖
的作用。因此有必要进一步研究 RE通过ERs发挥作
用的具体信号转导途径。
本实验中RE可抑制PRL合成分泌和细胞增殖,
但两种效应之间无密切相关性。可能由于这两种效应
是由不同的ERs介导的,或者由同一受体的不同作用
造成的。一些实验观察到E2也具有此性质[9~11],并认为
E2对PRL细胞增殖和合成分泌的调控是通过不同的
ERs信号转导途径介导的。
本实验结果证实 RE影响着 GH3细胞 ERs的表
达,RE通过 ERs抑制 GH3细胞增殖和 PRL分泌,
ER-α和 ER-β在此信号转导途径中发挥着不同作
用。通过对 RE与ERs关系的研究,进一步明确了RE
的作用机制,这有助于根据 PRL腺瘤的 ERs表达情
况判定肿瘤对RE的治疗效果,有利于PRL腺瘤的抗
雌激素治疗的药物筛选。由于ERs的信号转导途径相
对比较复杂,所以RE具体作用机制还有待于进一步
研究。
参 考 文 献
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