全 文 ：　　文章编号:1004-8820(2000)01-0038-07
管藻目绿藻刺松藻(Codium fragile)PSII
捕光复合物的结构研究①
陈　敏1 , 李爱芬1 , 周百成2
(1.烟台大学 生物化学系 , 山东 烟台 264635;2.中国科学院海洋研究所 , 山东 青岛
266071)
摘要:采用 PAGE 法对管藻目绿藻刺松藻的色素蛋白复合物进行了分离 , 并研究了 4 种主
要的捕光复合物 LHCP1 , LHCP2 , LHCP3和 LHCP3′的色素和光谱特性等;通过对最大的捕
光复合物 LHCP1 的再分离 ,进一步得到了与其他 3 种小分子量捕光复合物相对应的条带 ,
证明 LHCP2 , LHCP3 和 LHCP3′都是 LHCP1 的组成成分 ,并提出管藻目绿藻的 4 种主要的
捕光复合物之间并不象高等植物那样是单体和寡聚体的关系 , 而是分别以不同方式解离
形成的捕光复合物的不同部分.
关键词:捕光复合物;结构;管藻目绿藻
中图分类号:Q946　　　　文献标识码:A
捕光复合物在光合作用中负责光能的吸收和传递 ,这类复合物的捕光效率直接影响着
植物的生长 、发育以及生态分布.此外 ,从光合生物进化的角度来看 ,捕光复合物的演变十分
活跃 ,其组成和结构特性在一定程度上反映出光合系统结构进化乃至光合生物的进化历程 ,
因而在国内外研究十分热烈.
高等植物和大多数绿藻等绿色植物的捕光复合物都是叶黄素-Chl a/b-蛋白复合物.只
有管藻目绿藻非常特殊 ,其捕光复合物为管藻黄素(管藻素)-Chl a/b-蛋白复合物 ,并且 Chl
a/b比值很低 ,平均为 0.8(高等植物为 1.2).这一发现将绿色植物的进化与现代海洋中占
优势的杂色藻类的进化联系了起来 ,使管藻目绿藻在系统分类上具有了特殊的意义.因此 ,
国内外多个实验室对这类藻的捕光复合物进行了分离研究[ 1～ 9] ,通常可得到 3 ～ 4个条带.
但这些复合物究竟是天然存在的 ,还是分离过程中形成的.它们相互间是怎样的关系.目前
还缺少进一步的研究和证据.现以管藻目绿藻刺松藻(Codium fragi le)为实验材料 ,对分离
出的 4种主要捕光复合物的相互关系进行了研究 ,认为它们之间并不象高等植物的 3种主
要捕光复合物那样是单体和寡聚体的关系 ,而是分别以不同方式解离形成的捕光复合物的
不同部分.
① 收稿日期:1999-06-17
基金项目:国家重点基础研究发展规划(973)资助项目.
作者简介:陈敏(1966-),女 ,广东阳江市人 ,副教授 ,博士 ,主要从事生物化学及海洋生物学研究.
第 13卷第 1期 烟台大学学报(自然科学与工程版) Vol.13 No.1
　2000年 1月 Journal o f Yantai University(Natural Science and Engineering Edition)　 Jan.2000　
DOI :10.13951/j.cnki.37-1213/n.2000.01.009
1　材料与方法
1.1　叶绿体及类囊体膜制备
刺松藻(Codium fragi le)采自青岛汇泉湾.将新鲜藻体用过滤海水洗净后 ,去假根 ,剪
碎 ,加入等体积的分离介质(50 mmol/L PBS 缓冲液 , pH 7.2 ,含 0.4 mol/L 山梨醇 、10
mmol/L M gCl2 ,50 mmol/L NaCl),间歇匀浆约 1 min ,依照Anderson[ 2]方法制备叶绿体和类
囊体膜.类囊体膜经过充分洗涤之后 ,在 Beckman离心机上 15 ,000×g 收集膜碎片 ,然后重
新悬浮在含 1 g/L 甘油的 50 mmol/L T ricine-NaOH 悬浮液中 ,pH 8.0 ,叶绿素浓度 1.0 g/
L.于-70 ℃冰箱贮存备用.
1.2　类囊体膜的增溶
增溶液为 0.3 mol/L Tris-HCl缓冲液 ,pH 8.0 ,含1 g/L 甘油和 7.5 g/L SDS.以等体积
与类囊体膜制剂混合后 ,置冰浴中增溶 7 ～ 8 min.增溶后的溶液立即在 TG L-168 台式离心
机或日立 Biofuge 28RS上 4 ℃,8000 r/min离心 10 min后 ,迅速将清液上样.
1.3　色素蛋白复合物的 PAGE分离
类囊体膜上色素蛋白复合物的分离 ,参照李桐柱等[ 10]方法稍加改进.分离胶(华美进口
分装)浓度为 10%(体积分数).除了上槽缓冲液含有 0.1%的 SDS 以外 , 其他部分均无
SDS.电泳管长11 cm ,内径6.5 mm ,上样量 60 ～ 80μL/管.管电流为2.5 mA.电泳在4 ℃冰
箱中进行 ,避光.分离后的结果立即拍照.
1.4　LHCP1 的再电泳分离
将首次电泳后的 LHCP1 色素蛋白复合物条带切下 ,采用两种不同的方法处理.I.将凝
胶切片直接上样 ,每管 3 ～ 4 片 ,电泳的条件和体系与复合物 PAGE 分离相同 ,只在堆积胶
中加入 5 mmol/ L 的 Mg2+.II.将凝胶切片置于 4 ℃冰箱中 ,在含有 1 g/ L DMG 的悬浮液
中(pH 8.0)浸泡 15 ～ 20 min ,然后采用与第一次电泳完全相同的条件进行再电泳.电泳后
的结果立即拍照.
1.5　叶绿素浓度及 Chl a/b比值的测定
取叶绿体 、类囊体膜以及电泳后充分抽提的样品液 0.2 mL ,依 Arnon[ 11]方法处理并计
算叶绿素浓度及 Chl a/b比值.
1.6　常温吸收光谱测定
叶绿体和类囊体膜悬浮液 ,以及电泳后含有复合物的凝胶片 ,都采用 UV-3000双波长
双光束分光光度计测定吸收光谱.窄缝宽度为 2 nm.
1.7　低温荧光发射光谱 、激发光谱测定
电泳后立即切下的凝胶片 ,直接插入低温管中 ,在液氮温度(77 K)下 ,采用 F-4500荧光
分光光度计测定低温荧光光谱.窄缝宽度为 5 nm.
1.8　复合物分子量测定
类囊体膜的增溶与 1.2中方法一样.改在 Bio-Rad-miniprotean II 型垂直板电泳仪上进
行色素蛋白复合物的分离 ,板厚度为 2 mm ,上样量 40 μL/孔 ,并将经过样品处理液处理的
标准蛋白同时上样.分离条件及体系与圆盘电泳相同.电泳后的带有色素的凝胶板立即在
CS-910双波长 TLC 扫描仪上进行薄层扫描 ,扫描波长 675 nm.然后参照 Laemmli[ 12]方法
将胶片染色.脱色后的胶片再次扫描 ,波长为 595 nm.根据两次扫描的结果 ,采用自编软件
·39·　第 1 期 陈　敏 ,等:管藻目绿藻刺松藻 PSII捕光复合物的结构研究
处理并计算色素蛋白复合物的分子量.
2　实验结果
2.1　LHCII 复合物的分离
采用 PAGE法 ,从刺松藻中分离到 8种色素蛋白复合物 ,依照迁移率由小到大 ,分别为
CPIa ,CPI , LHCP1 , LHCP2 ,CPa , LHCP 3 , LHCP3′和 Fca(图 1).其中 LHCP 1 , LHCP2 , LHCP3
和 LHCP3′4种是 PSII 的捕光复合物(LHCII),均呈深浅不一的褐绿色 ,很容易与绿色的中
心复合物区别开来.含量最大的是 LHCP1(分子量为73 kDa),占叶绿素总量的 30%～ 40%,
在大羽藻中报道高达 50.1%[ 6] .其次是 LHCP3 和 LHCP3′,占 10%左右.分子量分别为 33
和29 kDa.分子量仅次于 LHCP1 的 LHCP 2(62 kDa)是一个很浅的黄褐色条带 ,含量只占
2%～ 3%.目前 ,采用 SDS-PAGE 法从多种海产绿藻中分离色素蛋白复合物时 ,都报道缺少
与高等植物 LHCP 2相对应的条带[ 1 ,2 ,4 ,8] ,可见这是一条最不稳定的捕光复合物条带.并且
Chl a/b比值较之其他捕光复合物要稍高一些 ,接近 0.9.
2.2　捕光复合物的常温吸收光谱
管藻目绿藻普遍含有两种特殊的类胡萝卜素 ———管藻黄素和它的酯化形式管藻素.在
刺松藻中 ,约占类胡萝卜素总量的 60%[ 7] ,并且全部存在于捕光复合物中.管藻黄素和管藻
素在 80%丙酮溶液中的吸收峰在 458 nm ,而在叶绿体中与蛋白质结合以后的吸收峰可红移
80 ～ 90 nm ,在 510 ～ 550 nm ,位于可见光的绿光区.这两种色素都是有效的光合色素 ,可直
接参与光合作用 ,在海水环境中可以有效地增加藻体对主要的可利用光———蓝绿光的吸收.
我们从刺松藻和假根羽藻中分离出的所有的捕光复合物条带中 ,几乎都含有管藻黄素
和管藻素 ,只是随着分子量的降低 ,其含量逐步减少(图 2).说明随着捕光复合物解离程度
的加大 ,管藻黄素和管藻素大部分从复合物中脱落.
图 1　(A)刺松藻类囊体膜色素蛋白复合物
分离 ,(B)刺松藻 LHCP1 再分离　　　　 　　　　
图 2　刺松藻捕光复合物常温吸收光谱
1 LHCP1　2 LHCP2　3 LHCP3　4 LHCP3′
·40· 烟台大学学报(自然科学与工程版) 第 13 卷　
　　4种捕光复合物中都含有大量的 Chl b ,Chl a/b比值分别为 0.76 , 0.90 , 0.83 , 0.70.比
高等植物的捕光复合物低的多.此外 4种复合物中 Chl b与蛋白质的结合状态略有不同 ,它
们在蓝区的吸收峰逐步蓝移 ,其中 LHCP1 在 474 ～ 475 nm;LHCP2 在 472 ～ 474 nm ;而
LHCP3和 LHCP 3′在 470 ～ 473 nm.4种捕光复合物 Chl a 的吸收峰基本都在 434 ～ 436 nm
以及 670 ～ 673 nm(图 2).
2.3　捕光复合物的低温荧光光谱
在低温条件下(通常为 77 K)测定光能传递的纯物理过程 ,可以得到许多有关复合物结
构与功能关系方面的信息 ,目前已成为色素蛋白复合物研究中不可缺少的手段.但是 ,就刺
松藻而言 ,目前还没有低温光谱特性方面的报道.
我们采用 436 nm的激发光激发刺松藻 LHCP 1 , LHCP2 , LHCP3 和 LHCP3′各复合物 ,其
发射波长都在 680 ～ 684 nm 之间(图 3A).这一荧光发自复合物中的 Chl a.在此发射波长下
测定各捕光复合物的激发光谱 ,其中 438 ～ 440 nm 的激发峰对应于 Chl a , 478 ～ 481 nm 和
538 ～ 540 nm 的激发峰分别对应于 Chl b 以及管藻黄素和管藻素(图 3).表明分离出的
LHCII各复合物具有很好的能量吸收和传递功能 ,其中的各种光合色素均可有效地将能量
传递给Chl a.
图 3　(A)刺松藻捕光复合物 77 K 荧光发射光谱(激发波长 436 nm)
　　　　1　LHCP1　2 LHCP2　3 LHCP3　4 LHCP3′
(B)刺松藻捕光复合物的 77 K荧光激发光谱(发射波长 680 nm )
　　　　　　1 LHCP1　2 LHCP3　3 LHCP3′
2.4　几种捕光复合物的相互关系研究
2.4.1　LHCP1 的再分离　为了进一步研究各种 LHCII 捕光复合物之间的关系 ,我们将其
中分子量最大的 LHCP1做了进一步的分离.事先用含 1%DMG 的增溶液浸泡含有复合物
的凝胶片 ,或直接在含Mg2+堆积胶中进行再电泳 ,都可从 LHCP1 中分离到 4个色素蛋白复
合物条带 ,依迁移率由小到大分别称为 LH-1(深褐色)、LH-2(褐绿色)、LH-3(浅褐色)和 LH
-3(深褐绿色)(图 1).
2.4.2　LHCP1 亚复合物的光谱特性及鉴定　从复合物的迁移率及颜色来看 ,其中深褐色
的 LH-1应是未解离的 LHCP1 复合物 ,其吸收光谱也与分离之前的 LHCP1 十分相似 ,用含
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Mg2+堆积胶分离出来的 LH-1 的常温最大吸收峰分别位于 434 , 476 , 654 和 673 nm(图
4A).略有不同的是 , LH-1在 540 nm 处管藻黄素和管藻素的吸收峰较 LHCP1 略为降低 ,可
能与二次电泳有关.LH-1在 77 K温度下的荧光发射峰在 681 nm.
图 4　刺松藻 LHCP1 亚复合物吸收光谱
(A)　1 LHCP1　2 LH-1　　(B)　1 LHCP2　2 LH-2　　(C)　1 LHCP3　2 LH-3　　(D)　1 LHCP3′　2 LH-3
再分离得到的 LH-2 复合物与首次电泳中的 LHCP2 迁移率相同 ,但颜色略有差别 ,
LHCP2呈浅褐色 ,而 LH-2为褐绿色.其吸收光谱与第一次电泳中 LHCP2 的基本相同 ,最大
吸收峰都在 435 ,472 ,540 ,654和 672 nm(图 4B).它们在 77 K 的荧光发射峰分别为 681和
680 nm.再电泳得到的第 3 ,4根条带 LH-3和 LH-3呈浅褐色和黄褐色 ,它与第一次电泳凝
胶上的 LHCP3 和 LHCP3′条带相对应.常温吸收峰位置基本都在 434 ,468 , 540 , 654和 671
nm ,只是 LH-3的 540 nm的吸收肩峰大为降低 ,而 Chl b的含量却相对提高(图 4C ,D ).从
上述情况来看 , LHCP1再分离得到的 LH-2 , LH-3和 LH-3与首次电泳中的 LHCP 2 、LHCP3
和 LHCP3′相对应.由此证明 ,4种主要的 LHCII 复合物中 ,分子量较小的 3 种都是 LHCP1
的组成部分.
·42· 烟台大学学报(自然科学与工程版) 第 13 卷　
3　讨　论
高等植物 LHCP1和 LHCP 2分别是由一种单体形式 LHCP3 构成的二聚体和三聚体 ,天
然的 LHC II都是以三聚体形式存在.而在刺松藻中 ,有 LHCP3 和 LHCP3′两种单体复合物
形式.这两个条带分子量十分接近 ,但 Chl a/b 比值不同 , 显然并非同一种复合物 ,而且
LHCP3′也不是从 LHCP3上解离而来.因而 ,尽管再分离的结果表明 LHCP2 、3 、3′都是 LHCP1
的结构部分 ,但这 4种复合物之间并非象高等植物 LHCII复合物那样 ,是简单的单体与寡
聚体的关系 ,而更象是以不同方式解离下来的 LHCII大复合物中的不同组成部分.
高等植物中分子量较大的捕光复合物 LHCP1 和 LHCP2 都不稳定 ,很容易解离为它们
的单体形式 LHCP3.而在刺松藻却相反 ,最为稳定的是分子量最大的 LHCP1 ,并且含量也最
大.我们将刺松藻的 LHCP1 在含有40 g/L SDS和 10%体积分数的巯基乙醇的处理液中 ,煮
沸2 ～ 3 min 或室温放置 2 h 左右 , 结果仍然可以看到未解离的 、褐绿色的 LHCP1.而
LHCP2 , 3 , 3′却极不稳定.这也说明管藻目绿藻的捕光复合物 LHCP1 的内部是一个高度有续
的整体 ,而不是在特定条件下可分可合的聚合体的结构.这种高稳定性 ,可使藻体在各种条
件下 ,有效地保证捕光功能的实现.因此我们认为 ,天然的 PSII 的捕光复合物 LHCII 很可
能主要是以稳定的 LHCP1 形式存在 ,而其他的 3种捕光复合物都是在增溶或者电泳分离过
程中形成的.
管藻目绿藻含有管藻黄素及管藻素 ,并以管藻黄素-Chl a/b-蛋白复合物作为捕光复合
物 ,说明它兼有绿色植物和杂色植物的特点.因而对这一类藻类捕光复合物进行深入的研
究 ,对于研究光系统的结构 、功能和进化 ,了解不同进化途径之间的关系 ,都具有重要的意
义.本文通过对管藻目绿藻的捕光复合物进行再分离的方法 ,研究了 4种主要捕光复合物的
相互关系 ,并就此提出管藻目绿藻的捕光复合物在内部结构上与了解较多的高等植物相比 ,
具有特异性.为此 ,还就复合物的多肽组成和结构关系做进一步的研究 ,结果将另文报道.
本文缩写:PSII:光系统 II , LHC II:光系统 II 捕光复合物 , LHCP:捕光叶绿素蛋白复合
物 ,Chl:叶绿素 ,SDS:十二烷基硫酸钠 ,DMG:癸基-N-甲基葡萄糖胺 , PAGE:聚丙烯酰胺凝
胶电泳 ,PBS:磷酸盐缓冲液.
致谢:本工作是在中国科学院海洋研究所实验海洋生物学开放研究实验室和中国科学院植物研究所
光合作用研究中心完成 ,并得到中国科学院植物研究所匡廷云院士和李良璧先生的具体指导.张群和冯丽
洁老师在实验结果测定方面给予了热情帮助.在此深表感谢.
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Structure of the PSII Light-harvesting Complexes Isolated from
Siphonous Green Alga , Codium fragile
CHEN Min1 , LI Ai-fen1 , ZHOU Bai-cheng2
(1.Department of Biochemistry , Yantai University , Yantai 264635 , China;2.Institute o f Oceanology , Chi-
nese Academy of Sciences , Qingdao 266071 , China)
Abstract :4 kinds of main light-harvesting complexes LHCP1 , LHCP2 , LHCP3 and LHCP3′are
separated from siphonous green alga , Codium fragi le by PAGE method.The absorption spec-
tra at room temperature and fluorescence spectra at 77K are determined.When the largest light
-harvesting complexes in molecular weight LHCP1 is subjected to PAGE once more , 3 bands of
sub-complexes w hich has the same mig ration ratios as the other three smaller ones separated on
first PAGE are obtained.It suggests that LHCP2 , LHCP3and LHCP3′are all the component
parts of LHCP1.And w e conclude that the 4 light-harvesting complexes resolved f rom Codium
fragi le are not monomers and oligomers as those in most of the higher plants.They are dif fer-
ent parts of the w hole LHCII which might be disinteg rated in different w ay during separation
process.
Key words:light-harvesting complexes;st ructure;siphonous green alg a
(责任编辑　柳瑞雪)
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