全 文 ：第 46卷 第 4期 海 洋 与 湖 沼 Vol.46, No.4
2 0 1 5 年 7 月 OCEANOLOGIA ET LIMNOLOGIA SINICA Jul., 2015

* 国家高技术研究发展计划(863计划), 2012AA092001号; 浙江省重大科技专项重点社会发展项目, 2013C03045-1号。陈先
锋, 博士, E-mail: chenxf@nbciq.gov.cn
① 通讯作者: 陈炯, 博士生导师, 研究员, E-mail: jchen1975@163.com
收稿日期: 2015-02-06, 收修改稿日期: 2015-03-26
环介导等温扩增联合横向流动试纸条快速检测
扁浒苔(Ulva compressa)的研究*
陈先锋1, 2 周前进1 王瑞娜1 段维军2 苗 亮1 陈 炯1①
(1. 宁波大学海洋学院 宁波 315211; 2. 宁波检验检疫科学技术研究院 宁波 315012)
摘要 本研究将环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)与横向流动试
纸条(lateral flow dipstick, LFD)的可视化检测方法结合, 建立了扁浒苔(Ulva compressa)的 LAMP-
LFD快速检测技术。该方法以扁浒苔的内转录间隔区(ITS1-5.8S-ITS2)序列为检测靶标, 设计了 3对
特异性引物(其中, 上游内引物由生物素标记)和 1 条异硫氰酸荧光素标记的探针。结果表明, LAMP
最适反应温度为 63°C, 扩增时间为 60 min, 从核酸扩增到 LFD结果判读需 70 min。利用 LAMP-LFD
可特异性检出扁浒苔, 对浒苔、曲浒苔、缘管浒苔和孔石莼等石莼属绿藻以及塔玛亚历山大藻、无
纹环沟藻、东海原甲藻、锥状斯克里普藻和赤潮异弯藻等常见微藻的检测结果为阴性。该方法最低
可检测到 0.1 pg的扁浒苔基因组 DNA, 是以 UcoITS-F3和 UcoITS-B3为特异性引物的 PCR方法的
100倍。对实际样品的检测结果表明, LAMP-LFD方法检测扁浒苔与传统的形态学观察的结果一致。
因此, 该方法可快速、特异地检测出扁浒苔, 而且操作简单, 仪器设备依赖性低, 有潜力成为扁浒苔
现场检测的常规技术手段。
关键词 扁浒苔; 环介导等温扩增; 横向流动试纸条; 内转录间隔区; 检测
中图分类号 Q948 doi: 10.11693/hyhz20150200048
扁浒苔(Ulva compressa)是属于绿藻门、绿藻纲、
石莼目、石莼科、石莼属的一种大型藻类。石莼属
(Ulva)藻类呈全球性分布, 常见于海洋环境, 半咸水
或江河水中也有分布 , 多生长于潮间带的岩石上或
石沼中, 或泥沙滩的石砾上, 在大型海藻的藻体和船
舶外壳上也可附生。其中, 扁浒苔(U. compressa)、浒
苔(Ulva prolifera)、肠浒苔(Ulva intestinalis)等在我国
的海洋野生植物中分布极为丰富 , 是重要的经济藻
类, 含有许多人体必需的营养成分, 可食用, 也具有
重要的药用价值(Hiqashi-Okaj et al, 1999; Raman et al,
2004; Mamatha et al, 2007)。同时, 扁浒苔、浒苔等石
莼属藻类也是引起绿潮灾害的主要生物种类(Duan et
al, 2012; Huo et al, 2013; Liu et al, 2013b; Smetacek et
al, 2013)。近几年, 在黄海、东海等沿海水域由石莼
属引发的绿潮灾害对当地的海洋生态系统及相关产
业造成了巨大危害(Ye et al, 2011; Huo et al, 2013; Liu
et al, 2013a, b)。
目前 , 石莼属等绿潮藻类的鉴定仍以传统的藻
类培养, 形态学观察为主(Culverhouse et al, 1996)。该
方法不仅操作繁琐(需定期更换培养液)、培养周期过
长(30d左右)、对培养条件(光照、温度、光周期)和培
养设施有一定的要求 , 而且对操作人员的专业要求
高 , 并不适用于藻类的快速诊断和绿潮灾害的及时
防治。而且, 石莼属藻类的形态、色泽, 以及藻体大
小等随环境变化而呈现出差异 ; 不同种的石莼属藻
类也会因环境变化呈现出相似的形态特征(Reddy et
al, 1992; Hayden et al, 2003)。这种种内和种间的形态
特征的交错给依赖于形态学特征的物种鉴定和检测
820 海 洋 与 湖 沼 46卷

带来了很大的困难。正是由于基于形态学特征的鉴定
方法的不足, 直到 2003 年根据分子证据, 才将原石
莼属和原浒苔属合二为一 , 统一为石莼属 (Ulva)
(Hayden et al, 2003)。日趋严重的绿潮灾害迫使石莼
属藻类的相关检测技术向着快速、特异、准确的方向
发展。
基于核酸扩增的分子检测技术具有灵敏度高、特
异性好、检测时间短等优点, 其中, 以聚合酶链式反
应(Polymerase Chain Reaction, PCR)或分子探针技术
为主要反应原理的分子技术已应用于藻类物种鉴定,
尤其是微藻的快速鉴定和检测 (Coyne et al, 2005;
Goffredi et al, 2006; Yuan et al, 2012; Antonella et al,
2013; Doll et al, 2014)。但由于这些方法对仪器设备
的要求较高, 工作环境严格, 仅限于实验室诊断。日
本学者 Notomi 等(2000)研发了一种基于核酸扩增的
新型检测技术——环介导等温扩增技术 (loop-
mediated isothermal amplification, LAMP), 该技术在
具链置换活性的 Bst DNA 聚合酶的作用下 , 利用
6—8 条特异性引物, 在恒温条件下可使核酸扩增达
到 109—1010个数量级(Notomi et al, 2000)。LAMP反
应可在类似于水浴锅等恒温容器中完成 , 摆脱对于
仪器和实验场地的苛刻要求。但是, LAMP产物的检
测以琼脂糖凝胶电泳方法或浊度检测法为主 , 在此
方面仍旧受到凝胶成像系统或浊度仪等设备的限制。
而横向流动试纸条(lateral flow dipstick, LFD)检测结
果可视, 若将这两中技术联用, 可极大程度上降低了
检测过程对仪器的依赖性。LAMP-LFD 技术是将
LAMP产物进行生物素(biotin)标记, 标记产物与异硫
氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)标记的
特异性探针杂交 , 杂交结果利用横向流动试纸条
(lateral flow dipstick, LFD)检测。而且探针的引入可有
效避免常规核酸扩增技术(PCR 等)引起的污染问题,
使得检测结果更加特异 , 在生物物种的实验室诊断
和现场检测领域均体现出较好的应用潜力(Nimitphak
et al, 2008; Puthamibool et al, 2009; Ding et al, 2010;
王瑞娜等, 2014)。
本研究根据扁浒苔的内转录间隔区(ITS1-5.8S-
ITS2)的序列保守区设计 3 对引物和 1 条异硫氰酸荧
光素标记的探针 , 经条件优化后 , 建立了扁浒苔
LAMP-LFD检测方法。
1 材料与方法
1.1 藻种分离株及培养
实验所用微藻分离株(塔玛亚历山大藻、无纹环
沟藻、东海原甲藻、锥状斯克里普藻、赤潮异弯藻)
由宁波大学海洋生物实验室藻种室提供。实验所用石
莼属绿藻经由母藻细断法进行分离 (Hiraoka et al,
1998), 按 Duan 等(2012)采用的方法于本实验室培
养、保存。具体所用藻类见表 1, 其中, 扁浒苔分离
株 55用于 LAMP条件优化、灵敏度分析等实验。
表 1 LAMP-LFD 方法建立过程中使用的藻类分离株
Tab.1 Algal species used in LAMP-LFD assay
藻类名称 英文名称 分离株 来源
塔玛亚历山大藻 Alexandrium tamarense NMBjah048 周成旭博士惠赠(王金娜等, 2010)
无纹环沟藻 Gyrodinium instriatum NMBjah046 周成旭博士惠赠(王金娜等, 2010)
东海原甲藻 Prorocentrum donghaiense NMBjah045 周成旭博士惠赠(周成旭等, 2006)
锥状斯克里普藻 Scrippsiella trochoidea NMBjah044 周成旭博士惠赠(王金娜等, 2010)
赤潮异弯藻 Heterosigma akashiwo H1 周成旭博士惠赠(周成旭等, 2006)
扁浒苔 Ulva compressa SDF10 本实验室培养(Duan et al, 2012)
扁浒苔 Ulva compressa 55 本实验室培养(Duan et al, 2012)
曲浒苔 Ulva flexuosa SDF12 本实验室培养(孙东等, 2011)
缘管浒苔 Ulva linza HS42 本实验室培养
– Ulva ohnoi FJ4 本实验室培养
孔石莼 Ulva pertusa SDF30 本实验室培养(Duan et al, 2012)
浒苔 Ulva prolifera XS5 本实验室培养(孙东等, 2011)

1.2 藻类 DNA的制备
各藻类分离株基因组 DNA的提取参照植物组织
基因组 DNA 提取试剂盒的步骤进行(Qiagen, Hilden,
Germany)。获取的基因组 DNA经 Qubit 2.0 Fluorometer
(Life Technologies, Carlsbad, USA)测定浓度后用作标
准品, –30°C贮存备用。
4期 陈先锋等: 环介导等温扩增联合横向流动试纸条快速检测扁浒苔(Ulva compressa)的研究 821

1.3 LAMP-LFD引物及探针的设计
针对 NCBI 上公布的扁浒苔 ITS1-5.8-ITS2 序列
(GenBank登录号: AF013982)设计 3对引物, 包括上游
外引物 UcoITS-F3、上游内引物 UcoITS-FIP、下游外引
物 UcoITS-B3、下游内引物 UcoITS-BIP, 以及环引物
UcoITS-LF和 UcoITS-LB, 用于 LAMP(表 2, 图 1)。同
时, 基于该扩增区段设计 1条 DNA探针 UcoITS-HP用
于杂交实验(表 2, 图 1)。其中, 上游内引物 UcoITS-FIP
的 5’端进行 biotin 标记, UcoITS-HP 的 5’端进行 FITC
标记。另外, 外引物 UcoITS-F3和 UcoITS-B3作为引物
应用于常规 PCR 扩增, 扩增片段大小为 333 bp。上述
引物和探针由英维捷基(上海)贸易有限公司合成。

表 2 扁浒苔 ITS1-5.8-ITS2 基因的 LAMP-LFD 引物和探针序列
Tab.2 The primers and DNA probe targeting ITS1-5.8S-ITS2 of U. compressa used in LAMP-LFD assay
引物 长度(碱基数) 序列(5’—3’) 目的
UcoITS-F3 19-mer CTCTCGCAACGATGAAGAA LAMP/PCR
UcoITS-B3 20-mer CTCAGGTCGAATGGAAAGTT LAMP/PCR
UcoITS-FIP 37-mer (F1c+F2)a CCGACGCTGAGGCAGATGGCAGAATTCCGTGAGTCAT LAMP
UcoITS-BIP 42-mer (B1c+B2) CTGGCTGAAGTACAGAGGTTCGAGTATCCTTCGTGGCTCATA LAMP
UcoITS-LF 18-mer TGGTCTCGTCCGAAGACT LAMP
UcoITS-LB 19-mer GACTAGGTAGGTTGCTCGC LAMP
UcoITS-HPb 17-mer GTCCTTGCGGCCGGGCT LFD
a上游引物 UcoITS-FIP的 5’端进行 biotin标记; bUcoITS-HP的 5’端进行 FITC标记


图 1 扁浒苔 rDNA ITS1-5.8S-ITS2基因序列的
LAMP-LFD引物设计示意图
Fig.1 Design of primers and DNA probe targeting
ITS1-5.8S-ITS2 of U. compressa used in LAMP-LFD assay
UcoITS-LFc、UcoITS-B1c、UcoITS-B2c和 UcoITS-B3c分别是
UcoITS-LF、UcoITS-B1、UcoITS-B2和 UcoITS-B3的互补序列

1.4 LAMP反应条件优化
LAMP 的反应体系为 25µL, 具体组成参考 Ding
等(2010), 主要包括 20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.8), 6.5
mmol/L MgSO4, 10 mmol/L KCl, 10 mmol/L(NH4)2SO4,
0.1% Triton X-100, 1.6 mol/L 甜菜碱, 1.4 mmol/L
dNTPs, 外引物UcoITS-F3和UcoITS-B3各 0.2µmol/L,
内引物 UcoITS-FIP 和 UcoITS-BIP 各 1.6µmol/L, 环
引物UcoITS-LF和UcoITS-LB各 0.4µmol/L, Bst DNA
聚合酶(New England BioLabs, 美国)8 U, 藻类基因
组 DNA标准品 1µL。阴性对照不加任何 DNA。选用
扁浒苔分离株 55的较高浓度的基因组 DNA (1.0×103
pg/µL)作为模板, 分别在 61、63和 65°C下进行 LAMP
反应, 根据扩增效果筛选最佳反应温度。将 DNA 标
准品已 10 倍浓度为单位进行倍比稀释 , 选取
1.0×103、 1.0×102、 1.0×101、 1.0×100、 1.0×10–1 和
1.0×10–2 pg/µL等 6个浓度的基因组 DNA为模板, 在
确定的最适温度下进行 LAMP 扩增, 根据起峰时间
和扩增强度分析反应时间; 在此基础上, 选择最低检
测浓度的基因组 DNA为模板分别选择 20、30、40、
50、60和 70 min作为 LAMP反应时间, 在最适温度
下扩增, 扩增产物经 2%琼脂糖凝胶电泳分析, 确定
反应的最适时间。
1.5 利用 LFD检测 LAMP产物(LAMP-LFD)
LFD 试纸条购买自 Milennia Biotec GmbH
(Milenia GenLine HybriDetect by Milenia Biotec
GmbH, Germany)。根据该试纸条的设计原理, 检测时
FITC 标记的探针与 biotin 标记的 LAMP 产物特异性
杂交, 杂交产物与金标记的 FITC 抗体结合形成三元
复合物, 结合在具有 biotin 抗体的检测线上; 未杂交
的探针与金标记的 FTIC 抗体形成两元复合物, 经过
检测线, 结合在质控线上。经 biotin标记的 LAMP反
应结束后, 不进行终止反应, 而是将 20 pmol FITC标
记的探针 UcoITS-HP 加入反应体系中, 63°C 杂交 5
822 海 洋 与 湖 沼 46卷

min。取 5 µL杂交液加入 80 µL Buffer混匀, 将试纸
条沿正确方向竖直放入该 Buffer 中反应 3 min 左右,
肉眼判断结果。
1.6 LAMP-LFD的特异性验证
选择扁浒苔(Ulva compressa)分离株 SDF10、曲
浒苔(Ulva flexuosa) SDF12、Ulva ohnoi FJ4、缘管浒
苔(Ulva linza) HS42、孔石莼(Ulva pertusa) SDF30、
浒苔(Ulva prolifera) XS5等常见石莼属绿藻, 以及塔
玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense) NMBjah048、
无纹环沟藻(Gyrodinium instriatum) NMBjah046、东海
原甲藻(Prorocentrum donghaiense) NMBjah045、锥状
斯克里普藻(Scrippsiella trochoidea) NMBjah044和赤
潮异弯藻(Heterosigma akashiwo) H1等国内常见微藻
种类共 11株用于 LAMP-LFD的特异性检验。上述藻
类基因组DNA的提取方法按步骤 1.2进行, 将各基因
组 DNA的浓度调整到约 1.0×103 pg/µL后用作 LAMP
反应的模板, 反应体系和条件参考步骤 1.4。扩增产
物分别采用琼脂糖凝胶电泳和 LFD进行检测。
1.7 LAMP-LFD的灵敏度分析
如步骤 1.4所述, 选取扁浒苔分离株 55的 6个不
同浓度(1.0×103, 1.0×102, 1.0×101, 1.0×100, 1.0×10–1和
1.0×10–2 pg/µL)的基因组 DNA 为模板, 采用优化后
的反应条件进行 LAMP 反应, 扩增产物分别采用 2%
琼脂糖凝胶电泳和 LFD进行检测。
同时, 以上述 6 个不同浓度的基因组 DNA 为模
板, 以外引物 UcoITS-F3和UcoITS-B3为特异性引物,
进行 PCR 扩增。PCR 的反应体系为 25 µL, 包括:
10×PCR Buffer 2.50 μL, 5 U/μL rTaq DNA 聚合酶
(TaKaRa, 中国大连 )0.25 μL, dNTPs (0.25mmol/L)
2μL, 0.20 μmol/L gyrB-F3 2 μL, 0.20 μmol/L gyrB-B3
2 μL, 模板 1 μL, 用无菌水补足反应体系。PCR反应
程序是: 95°C预变性 2 min后; 94°C 30 s, 55°C 30 s,
72°C 30 s, 扩增 30个循环; 72 °C延伸 10 min。扩增
产物经 2%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.8 LAMP-LFD的重复性实验
取 3 份新培养的扁浒苔分离株 55, 按照步骤 1.2
的方法进行基因组 DNA 的提取, 浓度测定后, 调整
至最低检测浓度, 采用优化后的反应条件进行 LAMP
反应, 扩增产物分别采用琼脂糖凝胶电泳和 LFD 进
行检测。
1.9 野外样品检测
共收集海水样品 12 份。样品通过 100 目的筛绢
网过滤后, 取 400 mL水样与 500 mL的三角烧瓶中,
按 Duan 等(2012)所述的方法进行培养, 培养成熟的
藻体用于显微观察。另取过滤后的水样 250 mL直接
用于基因组 DNA的提取, 具体方法参考 1.2所述, 用
于 LAMP-LFD和 PCR鉴定。
2 结果
2.1 LAMP扩增条件的确立
以较高浓度的扁浒苔基因组 DNA(1.0×103 pg/µL)
为模板, 分别在 61、63和 65°C下进行 LAMP。3个
反应温度下均可获得特征性的梯形条带 , 而不添加
任何 DNA 模板的反应管中未检测到扩增(图 2a)。但
在 63°C 条件下, 梯形条带间的间隔最为分明, 条带
最为清晰, 故选择 63°C作为最适反应温度(图 2a)。
在 63°C 条件下, 模板浓度在 1.0×103 pg/µL 和
1.0×100 pg/µL之间均可获得明显扩增(图 2b), 起峰时
间维持在 27—41 min (图 2c), 起峰时间随模板浓度降
低而逐渐增加, 呈明显的线性相关(图 2c), 约 60 min
时, 相对荧光强度达到平台期(图 2b)。当以较低的
1.0×100 pg/µL的基因组 DNA为模板时, 发现反应到
50 min 时可以检测到明显的梯形条带, 而 70 min与
60 min时的产物浓度并无明显增加(图 2d), 与扩增曲
线显示的结果(图 2c)一致。因此确定 60 min为最适反
应时间。
2.2 LAMP-LFD检测的特异性
以 11 株常见石莼属绿藻和微藻的基因组
DNA(1.0×103 pg/µL)为模板, 按优化的 LAMP反应体
系 63°C反应 60 min。结果表明, 浒苔分离株 SDF10
与 55一样可获得明显的扩增(图 3a, 3b), 而曲浒苔、
浒苔、缘管浒苔、孔石莼等石莼属绿藻的反应呈阴性
(图 3a, 3b), 塔玛亚历山大藻、无纹环沟藻、东海原甲
藻、锥状斯克里普藻和赤潮异弯藻等 5株微藻的反应
亦呈阴性(图 3a, 3b)。LFD 检测结果表明, 以两株扁
浒苔分离株的基因组 DNA 为模板时, 试纸条的检测
线位置出现明显的阳性条带, 而其它 10 株藻类分离
株的反应产物在试纸条的检测线位置未能检测到条
带(图 3c)。
2.3 LAMP-LFD检测的灵敏度
结果表明, LAMP 扩增过程中, 通过凝胶电泳的
方式可检测到的最低模板浓度是 1.0×100 pg/µL(图
4a), 而利用 LFD 可检测到的最低浓度是 1.0×10–1
pg/µL (图 4b)。以外引物 UcoITS-F3和 UcoITS-B3为
特异性引物的 PCR 方法能够检测到的最低模板浓度
为 1.0×101 pg/µL(图 4c)。
4期 陈先锋等: 环介导等温扩增联合横向流动试纸条快速检测扁浒苔(Ulva compressa)的研究 823


图 2 LAMP检测扁浒苔最适反应条件的确定
Fig.2 The optimization of LAMP for detection of U. compressa
a. 确定最佳反应温度: 1、3和 5, 以蒸馏水为模板; 2、4和 6, 以扁浒苔分离株 55的较高浓度基因组 DNA(1.0×103 pg/µL)为模板; M,
GeneRuler 100 bp plus DNA Ladder; 下同。b. 不同浓度的基因组 DNA作为模板的 LAMP反应; NC, 不加任何 DNA模板。c. 扩增的起
始时间(起峰时间)与基因组 DNA浓度的关系, 呈明显额线性相关。d. 以较低浓度(1.0×100 pg/µL)基因组 DNA为模板时, 扩增时间对
LAMP产物的影响; NC, 不加任何 DNA模板

2.4 LAMP-LFD检测的重复性
将 3份新培养的扁浒苔分离株 55的基因组 DNA
进行倍比稀释, 以 1.0×100 pg/µL浓度的基因组 DNA
为模板进行 LAMP 反应, 产物经琼脂糖凝胶电泳分
析; 以 1.0×10–1 pg/µL浓度的基因组DNA为模板进行
LAMP反应, 产物经 LFD检测。实验表明, 利用扁浒
苔的基因组DNA为模板进行的 LAMP或 LAMP-LFD
检测, 结果均呈阳性; 而不加任何 DNA 为模板的检
测, 结果呈阴性, 具有良好的重复性。
2.5 LAMP-LFD检测海水中藻类样品的适用性分析
利用传统的藻类分离、培养、显微观察的方法对
获得的 12 个海水样品进行了鉴定 , 发现江苏的
JS-3-1、JS-10 和 JS-11 为扁浒苔(表 3)。LAMP-LFD
的结果表明江苏的 JS-3-1、JS-10和 JS-11检测结果为
阳性, 其余为阴性, 检测结果与显微观察一致(表 3)。
利用 PCR 的方法获得江苏的 JS-3-1、JS-10 和 JS-11,
以及青岛的 S19 检测结果均为阳性, 其余为阴性(表
3)。针对 ITS1-5.8S-ITS2区的测序结果表明藻类分离
株 JS-3-1、JS-10和 JS-11为扁浒苔, 而青岛的 S19分
离株为浒苔(表 3)。
3 讨论
石莼属绿藻作为一类海洋经济藻类, 具有重要
的食用和药用价值(Hiqashi-Okaj et al, 1999; Raman et
al, 2004; Mamatha et al, 2007), 其可能引发的绿潮灾
害一直未引起足够的重视。但是, 近年来, 由石莼属
绿藻引发的绿潮灾害在全球范围内呈现高发、频发态
势, 给当地生态环境以及海水养殖、旅游等产业产生
824 海 洋 与 湖 沼 46卷


图 3 LAMP(a、b)和 LAMP-LFD(c)的特异性实验结果
Fig.3 Specificity test of LAMP (a, b) and LAMP-LFD (c) for
detection of U. compressa
Ucom1, 扁浒苔 55; Ucom2, 扁浒苔 SDF10; Ufle, 曲浒苔 SDF12;
Ulin, 缘管浒苔 HS42; Uohn, 曲浒苔 FJ4; Uper, 孔石莼 SDF30;
Upro, 浒苔 XS5; Atam, 塔玛亚历山大藻 NMBjah048; Gins, 无纹
环沟藻 NMBjah046; Pdon, 东海原甲藻 NMBjah045; Stro, 锥状斯
克里普藻 NMBjah044; Haka, 赤潮异弯藻 H1; NC, 不加任何 DNA
模板

了巨大影响(Smetacek et al, 2013)。2008年, 青岛附近
黄海海域暴发了绿潮灾害 , 近万人参与了藻体清除
工作, 花费多达 3亿美元(Liu et al, 2013a), 同时给近
海的水产养殖造成的直接经济损失达 10亿美元(Ye et
al, 2011)。因此, 建立准确、快速的藻类鉴定技术实现
对石莼属绿藻的有效监测、预防和控制具有重要意义。
目前, 绿潮藻检测技术的发展还相对滞后, 传统
的形态学观察仍是主要判断依据。石莼属种类多, 形
态特征复杂且易随环境改变而变化 , 形态学观察的
方法常常使得石莼属藻类的鉴定出现混乱或难以判
断(Blomster et al, 1998; Malta et al, 1999), 这就要求
检测人员必须具备较强的专业知识, 即便如此, 在实
际操作中, 也经常出现结果的误判。借助分子生物学
的方法进行绿潮藻类的鉴定仍处于起步阶段。基于
ITS、二磷酸核酮糖羧化酶大亚基基因(rbcL)等基因序
列的系统进化分析较早应用于石莼属藻类的种属鉴
定(Blomster et al, 1998; Coat et al, 1998), 作为传统形
态学观察的一种辅助手段 , 在藻类鉴定方面取得了
较好的应用效果(Liu et al, 2010; Wang et al, 2010;
Duan et al, 2012)。Xiao等(2013)基于 ITS建立了限制
性片段长度多态性 (RFLP)的分析方法 , 结合 5S
rDNA间隔区的 PCR扩增技术, 成功地应用于黄海海
域常见石莼属和盘苔属藻类的种类鉴定。尽管如此,
这些方法均未对自身的检测灵敏度等指标进行描述。

图 4 LAMP(a)、LAMP-LFD(b)和 PCR(c)检测扁浒苔的灵
敏度比较
Fig.4 Comparison in detection limit to U. Compressa by LAMP
(a), LAMP-LFD (b), and PCR (c)
NC: 不加任何 DNA模板。LAMP-LFD检测到的最低模板浓度为
1.0×10–1 pg/µL; LAMP为 1.0×100 pg/µL; PCR方法为 1.0×101 pg/µL
4期 陈先锋等: 环介导等温扩增联合横向流动试纸条快速检测扁浒苔(Ulva compressa)的研究 825


图 5 LAMP(a)和 LAMP-LFD(b)的重复性实验
Fig.5 Reproducibility of LAMP-LFD(a) and LAMP (b) for detection of U. compressa
a. 以扁浒苔 1.0×100 pg/µL浓度的基因组 DNA为模板; NC, 不加任何 DNA模板。b. 以扁浒苔 1.0×10–1 pg/µL浓度的基因组 DNA为模
板; NC, 不加任何 DNA模板
表 3 利用显微观察、LAMP-LFD 以及 PCR 方法对海水样品中扁浒苔的检测结果
Tab.3 Detection of U. compressa from field samples by microscopic examination, LAMP-LFD, and PCR
检测方法
样品编号 来源地
显微观察 LAMP-LFD PCR
ITS1-5.8S-ITS2/
(GenBank登录号)
BW30 宁波 – – – /
JS-3-1 江苏 + + + +/(GenBank: KR006936)
JS-10 江苏 + + + +/(GenBank: KR006937)
JS-11 江苏 + + + +/(GenBank: KR006938)
FJ-10 福建 – – – /
FJ-11 福建 – – – /
FJ-12 福建 – – – /
S19 青岛 – – + 浒苔/(GenBank: KR006939)
S76 青岛 – – – /
S77 青岛 – – – /
S78 青岛 – – – /
HS42 青岛 – – – /

段维军等(2012)通过比较分析石莼属不同种类的 ITS
序列, 建立了可特异性检测扁浒苔的 PCR方法, 最低
可检测到 10 pg的扁浒苔基因组DNA。Zhang等(2014)
以浒苔的 5S rDNA 间隔区为靶标建立了荧光原位杂
交技术(FISH), 利用该技术不仅可将浒苔与缘管浒
苔、曲浒苔、扁浒苔、孔石莼, 以及盘苔属藻类区分
开来, 同时也能对浒苔完成定量分析。本研究建立的
LAMP-LFD技术, 能够将扁浒苔与浒苔、曲浒苔、缘
管浒苔和孔石莼等石莼属区分开来 , 而且针对塔玛
亚历山大藻、无纹环沟藻、东海原甲藻、锥状斯克里
普藻和赤潮异弯藻等引发赤潮的常见藻类也表现出
良好的特异性。利用该 LAMP-LFD 方法, 最低可检
测到 0.1 pg 的扁浒苔基因组 DNA, 是以 UcoITS-F3
和 UcoITS-B3 为特异性引物的 PCR 方法的 100 倍。
12 个的野外样本检测结果显示, LAMP-LFD 技术的
检测结果与传统的形态学观察、PCR方法取得的结果
基本一致 , 表明该方法有潜力成为我国沿海扁浒苔
快速检测的有效技术手段之一并加以推广。
基于 PCR 或核酸杂交的检测技术能够适用于多
数生物样本的检测 , 尤其适用于设备齐全的实验室
诊断领域。实时、便捷是分子生物学技术的重要指标,
也是决定其能广泛应用于各领域现场检测的主要因
826 海 洋 与 湖 沼 46卷

素。目前针对石莼属藻类的检测技术均体现出一定的
适用性 , 但作为一种快检技术应用于藻类的现场检
测仍存在明显的不适性。依赖于核酸测序的系统进化
分析与传统的形态学观察结合后能够准确的确定藻
类物种(Liu et al, 2010; Wang et al, 2010; Duan et al,
2012), 但该方法依赖于 PCR 技术, 序列测定受制于
相关公司 , 而且该方法需工作人员具备专业的系统
进化知识 , 诸多限制使得本方法多在石莼属藻类基
础性研究的实验室使用。RFLP和常规 PCR技术能够
快速完成石莼属藻类的实验室诊断(Duan et al, 2012;
Xiao et al, 2013), 但需依赖于 PCR仪、凝胶成像系统
等仪器设备。本研究建立的 LAMP-LFD 技术在核酸
扩增阶段摆脱了对 PCR 仪等昂贵仪器的依赖, 在检
测阶段也不再需要凝胶成像系统或浊度仪等设备 ,
整个检测完全可在室外完成 ; 而且特异性探针的引
入也可避免荧光染料法造成的假阳性问题(Schnetz-
inger et al, 2013)。同时, 本研究建立的 LAMP-LFD
方法能够在 60 min 内实现核酸的几何级数扩增, 完
成整个检测也仅需要不到 70 min。因此, 本研究建立
的 LAMP-LFD 方法作为一种快检技术, 可作为扁浒
苔现场检测的重要工具并加以推广。
4 结论
本研究根据扁浒苔的 ITS1-5.8S-ITS2 基因序列
建立的 LAMP-LFD 方法可特异性检测扁浒苔。该方
法检测灵敏度高, 最低可检测到 0.1 pg的扁浒苔基因
组 DNA; 检测时间短, 从 LAMP 扩增到 LFD 结果判
读仅需 70 min, 且无需对待检样品进行培养、分离。
该技术摆脱了对实验室环境和仪器设备的依赖 , 对
操作人员的技能要求较低, 作为一种新型快检技术,
有潜力成为扁浒苔现场检测的重要手段。
参 考 文 献
王金娜, 严小军, 周成旭等, 2010. 产油微藻的筛选及中性脂
动态积累过程的检测. 生物物理学报, 26(6): 472—480
王瑞娜, 周前进, 陈 炯, 2014. 环介导等温扩增联合横向流
动试纸条可视化检测海豚链球菌方法的建立 . 农业生物
技术学报, 22(12): 1584—1594
孙 东, 孙存华, 段维军等, 2011. 宁波地区石莼属绿藻形态
学观察及分子生物学鉴定 . 安徽农业科学 , 39(12):
6936—6938
周成旭, 马 斌, 汪飞雄等, 2006. 海洋原甲藻与三角褐指藻
混合培养条件下的种群生长与氮磷营养盐变化 . 海洋科
学, 30(12): 58—61
段维军, 郭立新, 陈先锋等, 2012. 扁浒苔 PCR快速检测方法
研究. 海洋科学, 36(1): 30—35
Antonella P, Luca G, 2013. The quantitative real-time PCR
applications in the monitoring of marine harmful algal
bloom (HAB) species. Environmental Science and Pollution
Research, 20(10): 6851—6862
Blomster J, Maggs C A, Stanhope M J, 1998. Molecular and
morphological analysis of Enteromorphaintestinalis and E.
compressa (Chlorophyta) in the British Isles. Journal of
Phycology, 34(2): 319—340
Coat G, Dion P, Noailles M C et al, 1998. Ulva armoricana
(Ulvales, Chlorophyta) from the coasts of Brittany (France).
II. Nuclear rDNA ITS sequence analysis. European Journal
of Phycology, 33(1): 81—86
Coyne K J, Handy S M, Demir E et al, 2005. Improved
quantitative real-time PCR assays for enumeration of
harmful algal species in field samples using an exogenous
DNA reference standard. Limnology and Oceanography:
Methods, 3(9): 381—391
Culverhouse P F, Simpson R G, Ellis R et al, 1996. Automatic
classification of field-collected dinoflagellates by artificial
neural network. Marine Ecology Progress Series. Oldendorf,
139(1): 281—287
Ding W C, Chen J, Shi Y H et al, 2010. Rapid and sensitive
detection of infectious spleen and kidney necrosis virus by
loop-mediated isothermal amplification combined with a
lateral flow dipstick. Archives of Virology, 155(3): 385—389
Doll C, Main C R, Bianco C et al, 2014. Comparison of sandwich
hybridization assay and quantitative PCR for the
quantification of live and preserved cultures of Heterosigma
akashiwo (Raphidophyceae). Limnology and Oceanography:
Methods, 12: 232—234
Duan W J, Guo L X, Sun D et al, 2012. Morphological and
molecular characterization of free-floating and attached
green macroalgae Ulva spp. in the Yellow Sea of China.
Journal of Applied Phycology, 24(1): 97—108
Goffredi S K, Jones W J, Scholin C A et al, 2006. Molecular
detection of marine invertebrate larvae. Marine
Biotechnology, 8(2): 149—160
Hayden H S, Blomster J, Maggs C A et al, 2003. Linnaeus was
right all along: Ulva and Enteromorpha are not distinct
genera. European Journal of Phycology, 38(3): 277—294
Hiraoka M, Enomoto S, 1998. The induction of reproductive cell
formation of Ulva pertusa Kjellman (Ulvales, Ulvophyceae).
Phycological Research, 46(3): 199—203
Hiqashi-Okaj K, Otani S, Okai Y, 1999. Potent suppressive effect
of a Japanese edible seaweed, Enteromorpha prolifera
(Sujiao-nori) on initiation and promotion phases of
chemically induced mouse skin tumorigenesis. Cancer
Letters, 140(1—2): 21—25
Huo Y Z, Zhang J H, Chen L P et al, 2013. Green algae blooms
caused by Ulva prolifera in the southern Yellow Sea:
Identification of the original bloom location and evaluation
of biological processes occurring during the early northward
floating period. Limnology and Oceanography, 58(6):
2206—2218
Liu D Y, KeesingJ K, He P M et al, 2013a. The world’s largest
macroalgal bloom in the Yellow Sea, China: Formation and
implications. Estuarine Coastal and Shelf Science, 129:
2—10
Liu F, Pang S J, Chopin T et al, 2013b. Understanding the
recurrent large-scale green tide in the Yellow Sea: temporal
and spatial correlations between multiple geographical,
4期 陈先锋等: 环介导等温扩增联合横向流动试纸条快速检测扁浒苔(Ulva compressa)的研究 827

aquacultural and biological factors. Marine Environmental
Research, 83: 38—47
Liu F, Pang S J, Xu N et al, 2010. Ulva diversity in the Yellow
Sea during the large-scale green algal blooms in 2008-2009.
Phycological Research, 58(4): 270—279
Malta E J, Draisma S, Kamermans P, 1999. Free-floating Ulva in
the southwest Netherlands: species or morphotypes? A
morphological, molecular and ecological comparison.
European Journal of Phycology, 34(5): 443—454
Mamatha B S, Namitha K K, Senthil A et al, 2007. Studies on use
of Enteromorpha in snack food. Food Chemistry, 101(4):
1707—1713
Nimitphak T, Kiatpathomchai W, Flegel T W, 2008. Shrimp
hepatopancreatic parvovirus detection by combining
loop-mediated isothermal amplification with a lateral flow
dipstick. Journal of Virological Methods, 154(1—2): 56—60
Notomi T, Okayama H, Masubuchi H et al, 2000. Loop-mediated
isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research,
28(12): e63
Puthamibool T, Senapin S, Kiatpathomchai Wet al, 2009.
Detection of shrimp infectious myonecrosis virus by reverse
transcription loop-mediated isothermal amplification
combined with a lateral flow dipstick. Journal of Virological
Methods, 156(1—2): 27—31
Raman B V, Rao D N, Radhakrishnan T M, 2004. Enteromorpha
compressa (L.) Greville An edible green alga as a source of
antiallergic principle (S). Indian Journal of Clinical
Biochemistry, 19(1): 105—109
Reddy C R K, Iima M, Fujita Y, 1992. Induction of fast growing
and morphologically different strains through intergeneric
protoplast fusions of Ulva and Enteromorpha (Ulvales,
Chlorophyta). Journal of Applied Phycology, 4(1): 57—65
Schnetzinger F, Pan Y, Nocker A, 2013. Use of propidium
monoazide and increased amplicon length reduce
false-positive signals in quantitative PCR for bioburden
analysis. Applied Microbiology and Biotechnology, 97(5):
2153—2162
Smetacek V, Zingone A, 2013. Green and golden seaweed tides
on the rise. Nature, 504(7478): 84—88
Wang J F, Li N, Jiang P et al, 2010. Ulva and Enteromorpha
(Ulvaceae, Chlorophyta) from two sides of the Yellow Sea:
analysis of nuclear rDNA ITS and plastid rbcL sequence
data. Chinese Journal of Oceanology and Limnology, 28(4):
762—768
Xiao J, Li Y, Song W et al, 2013. Discrimination of the common
macroalgae (Ulva and Blidingia) in coastal waters of Yellow
Sea, northern China, based on restriction fragment-length
polymorphism (RFLP) analysis. Harmful Algae, 27:
130—137
Ye N H, Zhang X W, Mao Y Z et al, 2011. ‘Green tides’ are
overwhelming the coastline of our blue planet: taking the
world’s largest example. Ecological Research, 26(3):
477—485
Yuan J, Mi T Z, Zhen Y et al, 2012. Development of a rapid
detection and quantification method of Karenia mikimotoi
by real-time quantitative PCR. Harmful Algae, 17: 83—91
Zhang Q C, Liu Q, Kang Z J et al, 2014. Development of a
fluorescence in situ hybridization (FISH) method for rapid
detection of Ulva prolifera. Estuarine, Coastal and Shelf
Science, doi:10.1016/j.ecss.2014.09.004
RAPID DETECTION OF ULVA COMPRESSA BY LOOP-MEDIATED ISOTHERMAL
AMPLIFICATION COMBINED WITH LATERAL FLOW DIPSTICK
CHEN Xian-Feng1, 2, ZHOU Qian-Jin1, WANG Rui-Na1, DUAN Wei-Jun2, MIAO Liang1, CHEN Jiong1
(1. School of Marine Science, NingboUniversity, Ningbo, 315211; 2. Academy of Inspection and Quarantine, Ningbo, 315012)
Abstract A rapid loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method combined with a lateral flow dipstick (LFD)
was developed to detect Ulva compressa. Three pairs of primers that specifically recognized 8 conserved regions of the
internal transcribed spacer regions (ITS1-5.8S-ITS2) were designed and UcoITS-FIP, the forward inner primer, was
biotinylated. In addition, a DNA probe was designed to specifically recognize the given region of ITS1-5.8S-ITS2, and it
was labeled by fluorescein isothiocyanate (FITC). The optimized conditions for LAMP assay were recommended at 63°C
within 60 min and the whole course including nucleic acid amplification and visual detection by LFD was less than 70 min.
The LAMP-LFD assay could specifically detect U. compressa and distinguish it from U. prolifera, U. flexuosa, U. ohnoi, U.
linza and U. pertusa. And no positive results could be observed from several common microalgal species, i.e., Alexandrium
tamarense, Gyrodinium instriatum, Prorocentrum donghaiense, Scrippsiella trochoidea, and Heterosigma akashiwo. The
LAMP-LFD assay achieved a limit of detection of 0.1 pg genomic DNA of U. compressa, which is 100 times lower than
that of PCR assay using primers UcoITS-F3/UcoITS-B3. U. compressa could be successfully detected from filed samples
by LAMP-LFD, which is coincident with the results obtained by the traditional microscopic examination. Therefore, this
rapid and specific method is wellsuited for the detection of U. compressa in water samples.
Key words Ulva compressa; loop-mediated isothermal amplification; lateral flow dipstick; ITS1-5.8S-ITS2; detection