全 文 ：第 47卷 第 2期 海 洋 与 湖 沼 Vol.47, No.2
2 0 1 6 年 3 月 OCEANOLOGIA ET LIMNOLOGIA SINICA Mar., 2016

*国家星火计划项目, 2014GA701007号; 浙江省重大科技专项重点社会发展项目, 2013C03045-1号; 宁波市科技创新团队项
目, 2015C110018号。周前进, 博士, E-mail: mumu2325@163.com
① 通讯作者: 陈炯, 博士生导师, 研究员, E-mail: jchen1975@163.com
收稿日期: 2014-12-10, 收修改稿日期: 2015-10-19
孔石莼(Ulva pertusa)LAMP-LFD快速检测
方法的建立*
周前进1 陈先锋1, 2 蔡 怡1 段丽君2 段维军2 苗 亮1 陈 炯1①
(1. 宁波大学海洋学院 宁波 315211; 2. 宁波检验检疫科学技术研究院 宁波 315012)
摘要 采用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)进行核酸扩增, 凭
借横向流动试纸条(lateral flow dipstick, LFD)完成扩增产物检测, 建立了可快速检测孔石莼(Ulva
pertusa)的 LAMP-LFD方法。该方法首先在孔石莼的内转录间隔区序列(internal transcribed spacer, ITS)
的 8 个种内保守区域设计 6 条特异性引物(上游内引物由生物素标记), 进行由生物素标记的 LAMP
反应; 同时, 在两条外引物的有效扩增区段内设计 1 条异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,
FITC)标记的探针, 生物素标记的 LAMP产物与 FITC标记的探针特异性杂交后, 在 LFD上完成结果
显示。优化后 LAMP 的反应条件为 63C 反应 50min, 加上探针杂交与 LFD 检测共需 60min。结果
表明, 利用该 LAMP-LFD方法可特异性地检出孔石莼, 对浒苔(Ulva prolifera)等 9种常见藻类的检测
均呈阴性。利用该方法最低可检测到 3.04×10–2 pg/µL的孔石莼基因组 DNA, 是以 LAMP外引物进行
的常规 PCR 方法的 1000 倍。针对一定数量的实际样本的检测结果表明, LAMP-LFD 方法与传统的
形态学观察的结果一致。因此, 本研究建立的孔石莼 LAMP-LFD 快速检测方法, 具有特异性强、灵
敏度高、操作简便等优点, 有望成为我国东部沿海孔石莼快速检测和定期监测的有效技术手段。
关键词 孔石莼; 内转录间隔区; 环介导等温扩增技术; 横向流动试纸条; 检测
中图分类号 Q948 doi: 10.11693/hyhz20141200344
孔石莼(Ulva pertusa)属于绿藻纲, 石莼目, 石莼
科, 石莼属。石莼属(Ulva)藻类呈全球性分布, 多数种
类生活在温带至亚热带海洋中 , 部分生长在高潮带
至低潮带和大干潮线附近岩石上或石沼中。石莼属藻
类富含蛋白和多种微量元素 , 具有很高的食用及药
用价值(Torres et al, 2014; Montingelli et al, 2015;
Ghadiryanfar et al, 2016)。作为重要的经济藻类, 孔石
莼(U. pertusa)、浒苔(U. prolifera)等已得到越来越多
的开发利用。然而, 当石莼属藻类脱离固着基, 形成
大量的漂浮增殖群体时, 将导致绿潮的暴发, 破坏底
栖生态系统。自 20世纪 70年代初法国布列塔尼沿海
首次报道以来, 绿潮发生范围已遍及欧洲沿海、美国
东西海岸、东亚和东南亚沿海以及澳大利亚等国, 成
为世界性的海洋环境问题(Smetacek et al, 2013)。
多年以来 , 石莼属等绿潮藻的分类鉴定主要依
赖于显微镜下的形态学观察, 通常以其形态、结构特
征等作为主要的分类依据。然而, 石莼属藻类不同生
长阶段的细胞结构和藻体形态有着很好的可塑性 ,
易随季节和环境的变化而变化(Blomster et al, 1999,
2002), 导致形态学分类比较困难。因此, 以 PCR 为
代表的分子生物学技术引入到绿潮藻类的检测。其中,
rDNA-ITS序列、rDNA-18s序列、二磷酸核酮糖羧化
酶大亚基基因(rbcL)等因其种间较大的差异性, 通常
用作鉴定的靶标 , 应用于藻类的系统分类和鉴定过
程(Blomster et al, 2002; Wang et al, 2010; Lin et al,
2012); 由于该类技术有一定的仪器依赖性 , 要在特
2期 周前进等: 孔石莼(Ulva pertusa)LAMP-LFD快速检测方法的建立 381

定环境下由专业人员操作, 仅限于在实验室开展。
环 介 导 等 温 扩 增 (loop-mediated isothermal
amplification, LAMP)是 2000年发展起来的一种新的
核酸扩增方法(Notomi et al, 2000)。相较于 PCR技术,
LAMP 方法需针对靶序列的不同区域设计 6—8 条引
物 , 这些引物在反应过程中需完全与靶序列匹配才
能完成扩增反应 , 使得该方法具有良好的特异性。
LAMP 反应依赖于一种具有链置换功能的 Bst DNA
聚合酶, 恒温条件下即可完成核酸的大量扩增, 无需
类似于 PCR 的反复升降温过程, 使得仪器设备的依
赖性大幅度降低。因此, 自该技术发明以来已广泛应
用于细菌、病毒、寄生虫等病原的检测(Niu et al, 2012;
Nie et al, 2013; Notomi et al, 2015)。LAMP产物的检
测主要以琼脂糖凝胶电泳或浊度检测为主 , 仍依赖
于凝胶成像系统和浊度仪等仪器(Parida et al, 2008);
依赖于荧光染料的裸眼观察和实时荧光 LAMP 法在
某些微生物的检测中也取得了应用 , 但非特异性扩
增引起的假阳性成为限制该类检测手段广泛应用的
重要因素(Mori et al, 2001, 2004; Schnetzinger et al,
2013)。LAMP-LFD 技术是利用生物素标记的引物进
行 LAMP反应, 实现核酸的几何级数扩增, 随后将生
物素标记的 LAMP 产物与异硫氰酸荧光素标记的特
异性探针进行杂交 , 杂交产物在经生物素抗体和异
硫氰酸荧光素抗体处理的横向流动试纸条 (lateral
flow dipstick, LFD)上完成检测, 阳性的杂交产物会
在 LFD 的检测线位置呈现特征性的条带。相较于其
它的 LAMP 产物检测手段, LFD 无需任何仪器设备,
易于操作和携带 ; 而且可通过探针的特异性杂交进
一步筛选扩增产物, 降低了结果的假阳性。该技术在
传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)和海豚链球菌等多种
水产病原微生物的基层即时检测中展示了良好的适
用性(Ding et al, 2010; 王瑞娜等, 2014); 同时, 该方
法在绿潮藻扁浒苔的的鉴别诊断中也展示了一定的
应用潜力(陈先锋等, 2015)。
本研究根据孔石莼核糖体 DNA的内转录间隔区
序列(rDNA-ITS)的保守区设计 3对引物和 1条异硫氰
酸荧光素标记探针, 优化反应条件后, 建立 LAMP-
LFD 技术, 为水体环境中孔石莼的定期检测和快速
检测提供一种快捷可靠的方法。
1 材料与方法
1.1 藻种分离株及培养
实验所用的各微藻分离株 (赤潮异弯藻、东海
原甲藻、塔玛亚历山大藻、无纹环沟藻、锥状斯
克里普藻等 )由宁波大学海洋学院藻种实验室提
供。实验中涉及的石莼属绿藻经母藻细断法分离
后(Hiraoka et al, 1998), 按 Duan等(2012)的方法于本
实验室培养、保存。具体所用藻类见表 1, 孔石莼
分离株 S66用于 LAMP条件优化 , 灵敏度优化 , 特
异性分析等试验。
表 1 实验过程中使用的藻类分离株
Tab.1 Algal species used in LAMP-LFD assay
藻类名称 英文名称 分离株 来源
孔石莼 Ulva pertusa S66 宁波检验检疫科学技术研究院培养
浒苔 Ulva prolifera XS5 宁波检验检疫科学技术研究院培养(孙东等, 2011)
曲浒苔 Ulva flexuosa SDF12 宁波检验检疫科学技术研究院培养(孙东等, 2011)
缘管浒苔 Ulva linza HS42 宁波检验检疫科学技术研究院培养
- Ulva ohnoi FJ4 宁波检验检疫科学技术研究院培养
赤潮异弯藻 Heterosigma akashiwo H1 周成旭博士惠赠(周成旭等, 2006)
东海原甲藻 Prorocentrum donghaiense NMBjah045 周成旭博士惠赠(周成旭等, 2006)
塔玛亚历山大藻 Alexandrium tamarense NMBjah048 周成旭博士惠赠(王金娜等, 2010)
无纹环沟藻 Gyrodinium instriatum NMBjah046 周成旭博士惠赠(王金娜等, 2010)
锥状斯克里普藻 Scrippsiella trochoidea NMBjah044 周成旭博士惠赠(王金娜等, 2010)

1.2 藻类 DNA的制备
按照植物组织基因组 DNA提取试剂盒(离心柱
型 )的步骤 , 提取各藻类分离株的基因组 DNA
(Qiagen, Hilden, 德国)。获取的基因组 DNA 溶解于
50 μL的无菌去离子水中, 经 Nanodrop 2000 分光光
度计(Thermo Fisher Scientific, 美国)测定浓度后用
作标准品 , –30C贮存备用。
1.3 引物和探针设计
根据孔石莼的 rDNA-ITS 序列(GenBank 登录号:
HM584747), 在保守区域设计 3 对特异性引物(包括上
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游外引物 UpeITS-F3、下游外引物 UpeITS-B3、上游内
引物 UpeITS-FIP、下游内引物 UpeITS-BIP, 以及环引
物 UpeITS-LF 和 UpeITS-LB), 用于 LAMP 实验(表 2,
图 1)。此外, 基于该扩增区段设计 1 条 DNA 探针
UpeITS-HP用于 LFD杂交试验(表 2, 图 1)。其中, 上游
内引物 UpeITS-FIP 的 5端进行生物素(biotin)标记, 探
针 UpeITS-HP的 5端进行异硫氰酸荧光素(FITC)标记。
同时, 以外引物UpeITS-F3和UpeITS-B3进行常规PCR
扩增, 扩增片段大小为 360 bp。引物的合成和标记均由
英潍捷基(上海)贸易有限公司完成。
表 2 孔石莼 rDNA-ITS序列的 LAMP-LFD引物和探针序列
Tab.2 The primers and DNA probe targeting rDNA-ITS of U. pertusa used in LAMP-LFD assay
引物 长度(碱基数) 序列(5—3) 目的
UpeITS-F3 19-mer TAGCCTCACCTGAACTCAG LAMP/PCR
UpeITS-B3 18-mer ACGGATATCTCGGCTCTC LAMP/PCR
UpeITS-FIP(F1c+F2)a 39-mer(F1c:21-mer, F2:18-mer) CGGCTGAAATACAGAGGCTCGTATCCTTCGTGGCTCACA LAMP
UpeITS-BIP(B1c+B2) 39-mer(B1c:20-mer, B2: 19-mer) GTTATTCCGACGCTGAGGCAGCAGAATTCCGTGAGTCAT LAMP
UpeITS-LF 21-mer TAGGTAGCTCGCTACTCCTAC LAMP
UpeITS-LB 20-mer GTGGTCTCATCCGAAGACTC LAMP
UpeITS-HPb 20-mer GCAAGCGCGTGAGGGGTTAT LFD
a上游引物 UpeITS-FIP的 5端进行 biotin标记; b UpeITS-HP的 5端进行 FITC标记


图 1 孔石莼 rDNA-ITS序列的 LAMP引物设计示意图
Fig.1 Design of primers and DNA probe targeting
ITS1-5.8S-ITS2 of U. pertusa used in LAMP-LFD assay
UpeITS-LFc, UpeITS-B1c, UpeITS-B2c和 UpeITS-B3c分别是
UpeITS-LF, UpeITS-B1, UpeITS-B2和 UpeITS-B3的互补序列

1.4 LAMP反应条件确立
LAMP反应体系参照Ding等(2010), 具体组成包
括(25 μL): UpeITS-F3 和 UpeITS-B3 各 0.2μmol/L,
UpeITS-FIP和 UpeITS-BIP各 1.6μmol/L, UpeITS-LF
和 UpeITS-LB 各 0.4μmol/L, Tris-HCl (pH 8.80)
20mmol/L, KCl 10mmol/L, (NH4)2SO4 10mmol/L,
MgSO4 6.5mmol/L, dNTPs 1.4mmol/L, betaine
0.8mol/L, Triton X-100 0.1%, Bst DNA聚合酶(New
England BioLabs, 美国) 8U, 藻类基因组 DNA 标准
品 1μL, 无菌去离子水补足 25μL 体系。对于反应条
件的优化, 主要从反应温度和时间两个方面考虑。Bst
DNA 聚合酶的最佳活性温度范围在 60—65C, 根据
已经建立的多个 LAMP方法, 我们得出 63C和 65C
是最为常用的温度。因此, 本研究中 LAMP反应的温
度设定为 63C, 并在此基础上完成了引物的筛选。为
进一步分析 DNA模板浓度与 LAMP反应效率之间的
关系 , 我们在 LAMP 反应体系中加入 0.1 mmol/L
SYTO 9 荧光染 料 (Invitrogen,美国 ), 在 晶 芯
RT-Cycler 实时荧光定量 PCR 仪(博奥生物有限公司,
中国)上进行 LAMP 反应(即实时荧光 LAMP 反应),
据此可实时观察反应产物的生成情况。操作可大致概
括为: 将孔石莼 S66的 DNA标准品以 10倍浓度单位
进行梯度稀释, 取 3.04×102、3.04×101、3.04×100、
3.04×10–1、3.04×10–2、3.04×10–3和 3.04×10–4pg/µL等
7 个浓度的基因组 DNA 为模板 , 在 63C 下进行
LAMP反应, 根据起峰时间和扩增强度分析反应时间
与模板浓度之间的关系, 并初步确定 LAMP 反应的
时间; 实时荧光 LAMP的反应程序如下: 63C 1min;
63C 15s 和 63C 45s, 60 个循环 , 于每个循环的
63C 45s 末端收集荧光信号。在此基础上, 分别选取
较高浓度和最低检测浓度的基因组 DNA 为模板, 反
应时间依次设置为 10、20、30、40、50和 60min, 进
行 LAMP 反应, 扩增产物经 1.5%琼脂糖凝胶电泳分
析, 最终确定其反应时间。
1.5 利用 LFD检测 LAMP产物
经 biotin标记的 LAMP反应结束后, 向反应体系
中加入 2µL 10pmol/µL的探针 UpeITS-HP, 63C杂交
5 min, 最后 80C温育 5min终止反应, 反应产物可利
用 LFD试纸条(Milenia GenLine HybriDetect, Milenia
Biotec, 德国)检测 , 具体操作如下: 取 80µL Buffer
(Milenia GenLine HybriDetect, Milenia Biotec, 德国)
于 1.5mL离心管内, 加入 5µL杂交液混匀, 将试纸条
2期 周前进等: 孔石莼(Ulva pertusa)LAMP-LFD快速检测方法的建立 383

检测端竖直浸没预混液中反应 5min, 肉眼判断结果。
当 FITC 标记的探针与 biotin 标记的扩增产物特异性
杂交后, 杂交产物与胶体金标记的 FITC 抗体结合形
成的三元复合物结合在带有 biotin 抗体的检测线上;
多余的探针则与胶体金标记的 FITC抗体结合后越过
检测线, 最终结合在质控线上。
1.6 LAMP-LFD的特异性验证
选择浒苔(U. prolifera) XS5、曲浒苔(U. flexuosa)
SDF12、缘管浒苔(U. linza) HS42、U. ohnoi FJ4等常
见石莼属绿藻分离株, 以及赤潮异弯藻(Heterosigma
akashiwo) H1、东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)、
NMBjah045塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)
NMBjah048、无纹环沟藻 (Gyrodinium instriatum)
NMBjah046 和锥状斯克里普藻(Scrippsiella trochoidea)
NMBjah044 等国内常见微藻种类, 用于 LAMP-LFD
的特异性实验。用于特异性实验的各藻类分离株的模
板浓度统一调整为 1.0×102pg/µL, 产物分别采用
1.5%琼脂糖凝胶电泳和 LFD进行检测。
1.7 LAMP-LFD的灵敏度分析
取稀释后的孔石莼分离株 S66的 6个不同浓度的
基因组 DNA (3.04×102—3.04×10–3pg/µL)为模板, 按
优化后的体系和条件进行有生物素标记的 LAMP 反
应, 扩增产物分别采用 1.5%琼脂糖凝胶电泳和 LFD
进行检测。
以上述 6 个浓度的基因组 DNA 为模板, 外引物
UpeITS-F3 和 UpeITS-B3 为引物, 进行 PCR 扩增。
25µL PCR 反应体系, 包括: 10×PCR Buffer 2.5μL,
dNTPs (0.25mmol/L) 2μL, 0.2μmol/L UpeITS-F3 1μL,
0.2μmol/L UpeITS-B3 1μL, 5U/μL rTaq DNA聚合酶
(TaKaRa, 大连, 中国)0.25μL, 基因组NDA模板 1μL,
用无菌去离子水补足 25μL体系。PCR反应程序如下:
94C预变性 2min; 94C 30s, 52C 30s, 72C 30s, 30
个循环; 72C延伸 10min。扩增产物经 1.5%琼脂糖凝
胶电泳检测。
1.8 LAMP-LFD的重复性实验
重新培养孔石莼分离株 S66, 平行制备 3个样品,
按步骤 1.2的方法提取基因组DNA, 测定浓度后将浓
度稀释至 LAMP-LFD 的最低检测浓度, 并以此为模
板, 进行有生物素标记的 LAMP反应, 产物分别采用
1.5%琼脂糖凝胶电泳和 LFD进行检测。
1.9 海水样品检测
从福建和青岛等地区收集海水样品 17 份。样品
经 100 目的筛绢网过滤后, 各取 400mL 水样培养于
500mL的三角烧瓶中若干天, 至成熟藻体长成, 培养
方法参照 Duan等(2012)所述。成熟藻体用于形态学
鉴定。另取筛绢网滤后水样 250mL 按步骤 1.2 的方
法提取基因组 DNA, 利用 LAMP-LFD 和 PCR 进行
鉴定。
2 结果
2.1 LAMP反应时间的优化
在 63C条件下, 以不同浓度的基因组DNA为模
板进行的实时荧光 LAMP 实验结果表明, 当模板浓
度在 3.04×102pg/µL 至 3.04×10–2pg/µL 范围内均可获
得明显扩增(图 2A), 起峰时间随模板浓度降低而增
加(图 2A), 范围约在 17—33min之间(图 2A, 2B), 呈
典型的线性相关性(图 2B)。各反应均在约 50min 时,
相对荧光强度达到平台期 (图 2A)。当以较高浓度
(3.04×102pg/µL)的基因组 DNA 为模板时, LAMP 扩
增 30min 即可通过琼脂糖凝胶电泳的方式检测到明
显的梯形条带, 反应至 40min 及以后产物浓度不再
明显增加 (图 2C)。当以较低浓度的基因组 DNA
(3.04×10–2pg/µL)为模板时, 发现反应时间达到 40min
才能观察到明显的梯形条带, 至 50min 及以后产物
浓度不再显著增加(图 2D), 与扩增曲线的结果(图
2A)相一致。因此, 确定 LAMP 的最适反应时间为
50min。
2.2 LAMP-LFD检测的特异性
除孔石莼外, 选择其它 9株国内常见的石莼属绿
藻或微藻的基因组 DNA(1.00×102pg/µL)为模板, 进
行有生物素标记的实时荧光 LAMP 反应 , 条件为
63C反应 50min。结果表明, 以孔石莼的基因组 DNA
为模板的 LAMP反应, 15min左右即出现明显“S”形荧
光曲线(图 3A), 利用琼脂糖凝胶电泳检测也出现明
显的梯形条带(图 3B), LFD的检测线位置也出现明显
的条带(图 3C); 而以其它 9 种藻类基因组 DNA 为模
板时, 实时荧光曲线呈光滑曲线, 未见明显扩增(图
3A), 琼脂糖凝胶电泳的结果未呈现梯形条带(图 3B),
LFD 的检测线位置也未能检测到明显条带(图 3C),
检测结果为阴性。
2.3 LAMP-LFD检测的灵敏度
结果表明, 当孔石莼的基因组 DNA 模板浓度稀
释至 3.04×10–2 pg/µL时, 利用琼脂糖凝胶电泳仍可清
晰地检测到梯形条带(图 4A), LFD检测线位置也呈现
明显的条带 (图 4 B ) ; 当模板浓度进一步稀释至
3.04×10–3pg/µL 时, 琼脂糖凝胶电泳未能检测到梯形
384 海 洋 与 湖 沼 47卷


图 2 LAMP检测孔石莼最适反应时间的确定
Fig.2 Time optimization of LAMP for detection of U. pertusa
A: 不同浓度的基因组 DNA为模板的实时荧光 LAMP反应; NC, 不加任何 DNA. B: 扩增起始时间(起峰时间)与基因组 DNA浓度的关系,
呈典型的线性相关性. C: 以较高浓度(3.04×102 pg/µL)基因组 DNA为模板时, 不同反应时间下的 LAMP产物. D: 以较低浓度(3.04×10–2
pg/µL)基因组 DNA为模板时, 不同反应时间下的 LAMP产物

图 3 LAMP(A、B)和 LAMP-LFD(C)的特异性实验结果
Fig.3 Specificity test of LAMP (A, B) and LAMP-LFD (C) for detection of U. pertusa
Upe, 孔石莼 S66; Ufl, 曲浒苔 SDF12; Uli, 缘管浒苔 HS42; Uoh, Ulva ohnoi FJ4; Upr, 浒苔 XS5; Ata, 塔玛亚历山大藻 NMBjah048; Gin,
无纹环沟藻 NMBjah046; Hak, 赤潮异弯藻 H1; Pdo, 东海原甲藻 NMBjah045; Str, 锥状斯克里普藻 NMBjah044; NC, 蒸馏水
2期 周前进等: 孔石莼(Ulva pertusa)LAMP-LFD快速检测方法的建立 385


图 4 LAMP(A)、LAMP-LFD(B)和 PCR(C)检测孔石莼的灵敏度比较
Fig.4 Comparison in detection limit to U. pertusa by LAMP (A), LAMP-LFD (B), and PCR (C)
NC: 不添加任何 DNA模板; 3.04×102 —3.04×10–3: 孔石莼的基因组 DNA浓度, 单位: pg/µL. LAMP-LFD检测到的最低模板浓度为
3.04×10–2pg/µL; LAMP为 3.04×10–2pg/µL; PCR方法为 3.04×101pg/µL

条带(图 4A), LFD 检测线位置也未见条带(图 4B),
结果阴性, 该结果与实时荧光 LAMP 的检测结果一
致(图 2A); 以外引物 UpeITS-F3 和 UpeITS-B3 为特
异性引物的 PCR反应, 检测灵敏度为 3.04×101pg/µL
(图 4C)。上述结果表明 LAMP-LFD 的灵敏度可达
3.04×10–2 pg/µL, 是常规 PCR 方法灵敏度的 1000
倍。
2.4 LAMP-LFD检测的重复性
结果表明, 以灵敏度浓度(约 3.04×10–2pg/µL)的
孔石莼基因组 DNA为模板, 在 63C反应 50min条件
下进行的 LAMP 反应, 产物利用 LFD 试纸条和琼脂
糖凝胶电泳两种方式检测 , 均能稳定地检测到目的
产物的有效扩增(图 5); 以无菌去离子水为模板时 ,
结果皆为阴性(图 5); 这说明孔石莼的 LAMP-LFD方
法具有良好的技术重复性。
2.5 LAMP-LFD检测海水样品中藻类的适用性分析
从青岛和福建等地区采集 17 份海水样品 , 对
LAMP-LFD 方法应用于野外样本检测的适用性进行
分析。对收集样本利用传统的显微观察方法鉴定发现
来自青岛的 ZQ-5、TD-4、S73、S77以及 S78等 5个
样品为孔石莼(表 3); LAMP-LFD 的检测结果表明青
岛的 ZQ-4、ZQ-5、TD-2、TD-4、S73、S77以及 S78
为孔石莼(表 3); 利用 PCR 的方法同样获得青岛的
ZQ-4、ZQ-5、TD-2、TD-4、S73、S77以及 S78为孔
石莼(表 3), 其余样品呈阴性。
3 讨论
富营养化海区暴发的绿潮灾害已逐渐成为我国
某些海域的常态化现象 , 严重影响到当地的海水养
殖和旅游业(Hiraoka et al, 2004; Sun et al, 2008)。研究
证实 , 原本多数具有较好的食用和药用价值的石莼
属藻类如浒苔和孔石莼等 , 如今已成为导致绿潮灾
害频发的主要因素 (Wang et al, 2015; Zhou et al,
2015)。传统的基于藻类形态学特征的显微镜观察方
法, 需经过海水样本的过筛、培养等步骤培养出藻体,
除对培养设施和操作人员有较高要求外 , 整个培养
周期过长(30d 左右), 不能及时有效的反映藻类的分
布情况。因此, 本研究以孔石莼的作为检测靶标, 建
立了快速、准确的 LAMP-LFD 方法, 为孔石莼的快
速筛选和鉴定提供了一种可靠方法。
386 海 洋 与 湖 沼 47卷


图 5 LAMP(A)和 LAMP-LFD(B)的重复性实验
Fig.5 Reproducibility of LAMP-LFD(A) and LAMP (B) for detection of U. pertusa
NC: 不添加任何 DNA模板; 3.04×10–2, 孔石莼基因组 DNA的浓度, 单位: pg/µL

表 3 利用显微观察、LAMP-LFD以及 PCR方法对海水
样品中孔石莼的检测结果
Tab.3 Detection of U. pertusa from field samples by
microscopic examination, LAMP-LFD, and PCR
检测方法
样品编号 来源地
显微观察 LAMP-LFD PCR
ZQ-1 青岛 — — —
ZQ-2 青岛 — — —
ZQ-3 青岛 — — —
ZQ-4 青岛 — + +
ZQ-5 青岛 + + +
TD1 青岛 — — —
TD2 青岛 — + +
TD3 青岛 — — —
TD4 青岛 + + +
S69 青岛 — — —
S70 青岛 — — —
S73 青岛 + + +
S77 青岛 + + +
S78 青岛 + + +
FJ-10 福建 — — —
FJ-11 福建 — — —
FJ-12 福建 — — —

耗时短是目前核酸检测类方法追求的重要目标。
LAMP 的扩增反应通常可在 1h 内完成, 尤其添加环
引物, 可明显缩短 LAMP的反应时间, 这也是 LAMP
方法相较于基于 PCR 原理的分子检测技术的重要优
点。本研究中, 在添加环引物的前提下, 当 DNA 模
板浓度较高, LAMP反应在 20min之内即可出现阳性
扩增(图 2A); 通过琼脂糖凝胶电泳检测发现, 30min
时即可观察到明显的梯形条带(图 2C); 当模板浓度
降低至最低检测浓度时 , 利用琼脂糖凝胶电泳的方
法在 40min 也可以清晰地检测到梯形条带, 反应至
50min左右时, 产物量即可达到最大值(图 2D)。当使
用 LFD检测时, LAMP产物只需经过与特异性探针杂
交 5min, 再将 LFD 试纸条浸没入添加有杂交产物的
反应液 3—5min, 即可完成结果判读。因此, 考虑到
从 LAMP 反应开始计算, 整个检测时程在 1h 左右。
除此之外, LAMP反应的体系组成也是建立 LAMP方
法过程中重点考虑的因素。本研究使用的体系组成主
要参考自 Ding等(2010)的方法; 在此基础上, 通过添
加荧光染料 SYTO 9, 利用荧光曲线得出 LAMP扩增
的起峰时间与 DNA 的浓度成线性关系, 模板浓度约
低, LAMP反应的起峰时间越延迟(图 2B)。
由于近年来石莼属绿藻引发的绿潮灾害逐渐引
起人们的重视 , 多种基于核酸的分子检测技术在绿
潮藻类的检测与鉴定中取得了应用。其中, 基于 PCR
原理的核酸扩增技术占多数。Liu 等(2012)借助于核
酸测序技术, 对 2007—2011 年间江苏省近海的绿潮
藻类情况进行了调查, 发现浒苔(U. prolifera)能够抵
抗该海域强烈的环境变化 , 是该海域的主要优势藻
类。Duan 等(2012)借助于内转录间隔区(ITS)、二磷
酸核酮糖羧化酶大亚基基因(rbcL)以及 5S rDNA等藻
类常用的分子标志 , 对采集于黄海的部分样本的藻
类信息进行了分析, 发现该海域中存在有扁浒苔、孔
石莼、缘管浒苔, 以及浒苔等多种绿潮藻类。Xiao等
(2013)基于 ITS 序列建立了 PCR-RFLP 技术, 应用于
黄海海域石莼属和盘苔属藻类的鉴别。Zhao等(2015)
利用建立的 PCR-ISSR技术(PCR-inter-simple sequence
repeat)对黄海海域的漂浮浒苔分析发现, 浒苔的一个
2期 周前进等: 孔石莼(Ulva pertusa)LAMP-LFD快速检测方法的建立 387

独特的生态型是引起全球性绿潮的重要原因 , 固着
生长的浒苔种类不是该生态型的物种来源 , 这两种
不同生活方式的浒苔种之间很难发生基因漂流现象。
Zhang 等(2015)建立了荧光原位杂交技术(FISH), 该
技术无需依赖于 PCR 的核酸扩增, 借助于针对浒苔
5S rDNA序列的特异性探针即可将浒苔与缘管浒苔、
曲浒苔、扁浒苔、孔石莼, 以及盘苔属藻类区分开来。
检测灵敏度是核酸检测类技术的重要指标。段维军等
(2012)针对扁浒苔 ITS序列建立的 PCR方法最低可检
测到 10 pg的藻类基因组DNA; 本实验室先前也针对
扁浒苔的 rDNA-ITS序列建立了 LAMP-LFD技术, 最
低可检测到 0.1 pg 的扁浒苔基因组 DNA(陈先锋等,
2015)。Chen等(2016)基于多重 PCR的原理建立的基
因芯片技术能够特异性检测浒苔、扁浒苔等多种藻类,
最低检测灵敏度可达 0.5 ng的基因组 DNA。本研究
建立的 LAMP-LFD 技术, 能够将孔石莼与浒苔、曲
浒苔和缘管浒苔等加以区分 , 最低可检测到 3.04×
10–2 pg/µL 的孔石莼基因组DNA, 是以UpeITS-F3和
UpeITS-B3为特异性引物的 PCR方法的 1000倍。17
个海水样本的检测结果表明, LAMP-LFD方法检测孔
石莼与传统的形态学观察的结果基本一致。因此, 该
方法作为一种快检技术 , 可作为孔石莼现场检测的
重要工具并加以推广。
4 结论
本研究以孔石莼的 rDNA-ITS序列为检测靶标建
立了 LAMP-LFD 方法能够特异性地应用于孔石莼的
检测。该方法检测时间短, 从核酸扩增到 LFD结果展
示, 整个检测过程仅需 60min。该方法具有良好的检
测灵敏度, 最低可检测到 3.04×10–2pg/µL的孔石莼基
因组 DNA。由于该技术从核酸扩增开始的整个检测
过程能够彻底摆脱对于仪器设备的依赖性 , 容易操
作上手, 作为一种新型技术, 有望成为我国东部沿海
孔石莼快速检测的有效手段之一。
参 考 文 献
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DEVELOPMENT OF A NOVEL LAMP-LFD METHOD FOR
RAPID DETECTION OF ULVA PERTUSA
ZHOU Qian-Jin1, CHEN Xian-Feng1, 2, CAI Yi1, DUAN Li-Jun2, DUAN Wei-Jun2,
MIAO Liang1, CHEN Jiong1
(1. School of Marine Science, Ningbo University, Ningbo 315211, China; 2. Academy of Inspection and Quarantine, Ningbo 315012,
China)
Abstract We developed a novel LAMP-LFD method for rapid detection of Ulva pertusa based on loop-mediated
isothermal amplification (LAMP) integrated with visual detection by a lateral flow dipstick assay (LFD). Six primers were
designed according to the conserved regions of internal transcribed spacer (ITS) (among the primers, the forward inner
primer was biotinylated) and used in the LAMP assay. In addition, a specific probe was designed based on the conserved
sequence amplified by both outer primers, and labeled by fluorescein isothiocyanate (FITC). The biotinylated LAMP
amplicons were hybridized exclusively with the FITC-labeled probe and detected via LFD. The optimized LAMP assay to
detect U. pertusa was performed at 63 °C for 50 min, and for only 60 min when visualization via LFD is incorporated. The
results demonstrate that LAMP-LFD could specifically detect U. pertusa and no characteristic amplification was observed
when using genomic DNA of other 9 common algal isolates responsible for green tide or red tide. The detection limit using
genomic DNA of U. pertusa was 3.04×10–2 pg/µL, which was 1000 times lower than that of the conventional PCR method
using both outer primers. U. pertusa could be successfully detected from filed samples by LAMP-LFD, which is coincident
with the results obtained by the traditional microscopic examination. Therefore, the LAMP-LFD method is specific,
sensitive, and easy, showing great potential in the rapid detection and routine monitoring of U. pertusa in the eastern coast
of China.
Key words Ulva pertusa; internal transcribed spacer; loop-mediated isothermal amplification; lateral flow
dipstick; detection