全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 8 期 2011 年 8 月

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环介导等温扩增法鉴定检测冬虫夏草
李 奎 1，李 琦 1，袁 媛 2，陈江源 1，黄璐琦 2，刘志国 1*
1. 武汉工业学院生物与制药工程学院，湖北 武汉 430023
2. 中国中医科学院中药研究所，北京 100700
摘 要：目的 建立冬虫夏草的环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）方法，实现对冬虫夏草的
快速检测。方法 针对冬虫夏草的 CS2 serine protease (csp2)基因设计 LAMP 内外引物对；利用 CTAB 法提取冬虫夏草 DNA；
优化扩增反应条件；采用包括冬虫夏草在内的 6 种不同虫草进行 LAMP 扩增，并对阳性产物酶切鉴定以检测其特异性，通
过对模板 DNA 的 10 倍梯度稀释检测其灵敏度；紫外灯下观察凝胶电泳或加入荧光染料 SYBR Green I 的扩增产物。结果 设
计的 LAMP 引物可以特异地针对冬虫夏草的 csp2 基因进行 LAMP 扩增，产物可被限制性内切酶 Taq1 酶切，且有较高的灵
敏度，检出限达 6 pg/mL。结论 LAMP 法可以实现对冬虫夏草的快速鉴定检测，在中药鉴定中有着广阔的应用前景。
关键词：冬虫夏草；环介导等温扩增；鉴定；检测；检出限
中图分类号：R282.5 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2011)08 - 1605 - 04
Identification and detection of Cordyceps sinensis with LAMP
LI Kui1, LI Qi1, YUAN Yuan2, CHEN Jiang-yuan1, HUANG Lu-qi2, LIU Zhi-guo1
1. School of Biology and Pharmaceutical Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China
2. Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100700, China
Abstract: Objective The method of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) was employed to detect and identify Cordyceps
sinensis rapidly. Methods Specific LAMP primers were designed according to the CS2 serine protease (csp2) gene of Cordyceps
sinensis. C. sinensis DNA was extracted using CTAB method. The reaction conditions of LAMP were optimized. Specificity of LAMP
reaction was validated by six different strains and using restriction enzyme Taq1 digested the LAMP products. Sensitivity of LAMP
was tested with diluted C. sinensis solution with 10-fold gradient. LAMP products were shown by gel electrophoresis or adding SYBR
Green I. Results The method of LAMP for detecting C. sinensis was effective and specific. The detection limit of LAMP assay was up
to 6 pg/mL. Conclusion LAMP protocol is a promising method for the identification and detection of C. sinensis and Chinese materia
medica as well.
Key words: Cordyceps sinensis (Berk.)Sacc.; loop-mediated isothermal amplification (LAMP); identification; detection; detection limit

冬虫夏草是我国名贵中药材，因其经济价值
高，常有伪冒品扰乱市场，因此冬虫夏草的快速
鉴定检测具有重要意义。目前，冬虫夏草检测方
法包括分离培养、子囊孢子微循环产孢、子实体
人工诱发、菌丝蛋白酶谱检测、PCR-限制性片段
长度多态性（PCR-RFLP）分析、随机扩增多态性
DNA（RAPD）分析等[1-3]。这些方法由于周期长，
特异性及灵敏度不够，操作繁杂，检测成本高等
原因而不适于推广应用。环介导等温扩增 [4]
（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）
是一种快速的核酸扩增技术，利用特异引物及链
置换 DNA 聚合酶在恒温条件下自循环几十分钟，
就可完成核酸扩增反应。该方法具有高特异性、
高灵敏性、简便、快速、低成本等特点，已在诸
多领域应用。本研究拟采用 LAMP 方法，实现冬
虫夏草的快速检测与鉴定。
1 材料
冬虫夏草 Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc. 子实

收稿日期：2011-03-29
基金项目：湖北省楚天学者计划项目；武汉市科技局对外科技合作与交流计划项目（201070934341）
作者简介：李 奎（1986—），男，湖北宜昌人，硕士研究生，研究方向为中药材鉴定。Tel: 13277078375 E-mail: lk87282240@163.com
*通讯作者 刘志国 Tel: (027) 83956899 E-mail: zhiguo_l@126.com
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 8 期 2011 年 8 月

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体、虫体由北京同仁堂提供，亚香棒虫草 Cordyceps
hawkesii Gray、分枝虫草 Cordyceps ramosa Teng、
新疆虫草 Cordyceps gracilis (Grev.) Dur. et Mont.、
蛹虫草 Cordyceps militaris（L.）Link 购自青海玉树
尼达大药房。
Bst DNA 聚合酶购自纽英伦生物技术有限公
司；LAMP 引物由上海生工生物工程有限公司合成；
SYBR Green I、dNTPs、DNA Marker DL2000、
DL1000 购自上海捷瑞公司。
电热恒温水浴箱（武汉市琴台医疗器械厂）；超
净工作台（YJ—1450）（江苏苏州净化设备公司）；
聚合酶链式反应仪 Biometre UNO Ⅱ；核酸电泳仪
（北京六一厂）；UV—2000 GIS 紫外分析仪（日本
HITACHI）。
2 方法
2.1 DNA 提取
按文献采用 CTAB 法[5]提取冬虫夏草 DNA，测
定 DNA 量，作扩增模板用。
2.2 LAMP 反应
通过 Genebank Blast 比对，选择冬虫夏草特异
性基因 CS2 serine protease（csp2）上的保守序列作
为模板靶序列，利用 PrimerExplorer V4 软件设计
LAMP 内外引物对（表 1）。
25 μL LAMP 反应体系含 1.6 μmol/L FIP、1.6
表 1 冬虫夏草 csp2 基因的 LAMP 引物
Table 1 LAMP primers for csp2 gene of C. sinensis
名 称 序 列
F3 GGAGTAGTTGCACCACCAC
B3 TAGCGAGGTATGTGGCGG
FIP TCGCATCGCAAGCCTTCGTC-CTCGCTCGAGAAGGTCAAG
BIP AGAAGTTGCGAAACTCGAGCCG-AGTGCCCAGTTGAGTGAATG

μmol/L BIP、0.2 μmol/L F3、0.2 μmol/L B3、20 mmol/L
Tris-HCl（pH 8.8）、10 mmol/L KCl、2 mmol/L
MgSO4、10 mmol/L（NH4）2SO4、0.1% Triton X-100、
1.4 mmol/L dNTPs、8 U Bst DNA 聚合酶、1.0～4.0
μL 模板 DNA。在 EP 管中先加入除 Bst DNA 聚合
酶以外的所有反应物，在 95 ℃水浴 5 min，然后迅
速放在冰上冷却，冷却后加入 Bst DNA 聚合酶，63
℃反应 60 min，80 ℃孵育 10 min 终止酶活性即完
成 LAMP 反应。扩增产物在含 0.5 μg/mL 溴化乙锭
（EB）的 1.5%琼脂糖凝胶上电泳，紫外观察结果；
由于荧光染料 SYBR Green I 分子可嵌入核苷酸链
中，可产生绿色荧光，因而加入 0.5 μL SYBR-Green
I 于紫外光下观察扩增产物。
2.3 LAMP 反应条件的确定
分别设定反应温度为 60、63、65 ℃，反应时
间为 40、60、80 min 等不同条件下进行 LAMP 扩
增，根据扩增结果确定最佳反应温度和反应时间。
2.4 LAMP 特异性检测
分别对包括冬虫夏草在内的 6 种不同虫草扩
增，由于 LAMP 阳性扩增产物是由若干茎环结构和
类似花椰菜结构的 DNA 组成的混合物，电泳后凝
胶上会呈现出梯状条带。利用靶序列中含有的 Taq1
限制性酶切位点，对电泳呈阳性的 LAMP 产物与
Taq1 混合，37 ℃酶切过夜，电泳，进一步检测冬
虫夏草 LAMP 扩增的特异性。
2.5 LAMP 灵敏度检测
利用 A260 值，测定冬虫夏草 DNA 模板浓度，
用三蒸水对模板进行 10 倍梯度稀释，最低稀释至
109 倍，对每一质量浓度梯度 DNA 模板进行 LAMP
扩增，扩增产物电泳分析，确定检测限。
以 LAMP 外引物 F3 和 B3 对冬虫夏草各稀释模
板进行 PCR，条件为 94 ℃变性 45 s；53 ℃退火
45 s；72 ℃延伸 45 s，35 个循环。扩增产物进行电
泳分析，确定检出限。
3 结果
3.1 LAMP 反应条件的确定
结果显示 LAMP 反应最佳反应温度为 63 ℃
（图 1），最佳反应时间为 60 min（图 2），阳性结果
电泳呈典型梯状条带。
3.2 LAMP 的特异性
对 6 种虫草 DNA 模板分别进行 LAMP 扩增，
结果除冬虫夏草扩增产物呈阳性梯状条带外，其他
均为阴性（图 3），表明针对冬虫夏草的 LAMP 引
物具有高特异性。对冬虫夏草 LAMP 扩增阳性产物
经 Taq1 酶切过夜，梯状条带消失（图 4），表明 LAMP
产物为特异性扩增。
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M-DNA Marker（DL1 000） 1-60 ℃ 2-63 ℃ 3-65 ℃ 4-空白对照
M-DNA Marker (DL1000) 1-60 ℃ 2-63 ℃ 3-65 ℃
4-blank control
图 1 LAMP 反应温度的确定
Fig. 1 Optimal reaction temperature of LAMP

M-DNA Marker （DL1 000） 1～3-分别是在 63 ℃时扩增 40、
60、80 min 后电泳结果 4-空白对照
M-DNA Marker (DL1 000) 1－3-LAMP amplicons for 40, 60,
and 80 min, respectively 4-blank control
图 2 LAMP 反应时间的确定
Fig. 2 Optimal reaction time conditions of LAMP

M-DNA Marker （DL2000） 1-空白对照 2-冬虫夏草子实体
3-冬虫夏草虫体 4-亚香棒虫草 5-分枝虫草
6-新疆虫草 7-蛹虫草
M-DNA Marker (DL2000) 1-blank control 2-C. sinensis
fruiting bodies 3-C. sinensis larvae 4-C. hawkesii
5-C. ramose 6-C. grsacilis 7-C. militaris
图 3 不同虫草的 LAMP 扩增
Fig. 3 Specificity of LAMP for different species in C. sinensis

M-DNA Marker (DL1000) 1-LAMP 阳性产物 2-LAMP 阳性产
物经 Taq1 酶切 3-LAMP 阳性产物经 EcoR1 酶切
M-DNA Marker (DL1000) 1-LAMP products of C. sinensis csp2
2-C. sinensis csp2 LAMP products carried out digestion with Taql
3-C. sinensis csp2 LAMP products carried out digestion with EcoR1
图 4 冬虫夏草 LAMP 阳性扩增产物的酶切
Fig. 4 Restriction analysis of C. sinensis csp2 LAMP
positive products
3.3 LAMP 的灵敏度
通过测定 A260 数值，计算得到 0.1 g 冬虫夏草
所提的 DNA 的量为 600 μg/mL，模板梯度稀释后，
各取 1 μL 进行 LAMP 扩增，结果见图 5。当模板
DNA 样品稀释至 10−5 倍时，依然可检出，检出限
为 6 pg/mL。以 F3 和 B3 引物对冬虫夏草进行 PCR，
得到预期片段（图 6），而检出限为 6 ng/mL。可见，
LAMP 扩增比普通 PCR 扩增灵敏度高约 1 000 倍。
3.4 LAMP 产物的荧光染色
LAMP 扩增产物中加入 SYBR Green I 后在紫
外灯下观察，空白管无荧光反应，阳性结果管呈明

M-DNA Marker (DL1000) 1～9-分别是模板稀释至 10−1～10−9倍后
的 LAMP 扩增 10-空白对照
M-DNA marker (DL1000) 1－9-LAMP reaction carried out with C.
sinensis DNA template diluted by 10−1－10−9-fold 10-blank control
图 5 冬虫夏草 DNA 梯度稀释后的 LAMP 扩增
Fig. 5 LAMP products with serial dilution
of C. sinensis DNA template
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

M 1 2 3 4
M 1 2 3 4

M 1 2 3 4 5 6 7

M 1 2 3
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M-DNA Marker (DL2000) 1～4-分别为模板稀释至10−1～10−4 倍
后的 PCR 5-空白对照
M-DNA Marker (DL2000) 1—4-PCR-reaction carried out with C.
sinensis DNA template diluted by 10−1－10−4-fold 5- blank control
图 6 冬虫夏草 DNA 10 倍系列稀释后的 PCR 扩增
Fig. 6 PCR products with 10-fold serial dilution
of C. sinensis DNA template
显的绿色荧光反应。SYBR Green I 可用于 LAMP
结果的快速检测。
4 讨论
冬虫夏草是十分珍贵的中药材，在实物检测中，
LAMP 法只需要约为 0.05 g 子实体样品就可对样品
做出检测和鉴定，耗材极少；且 LAMP 法操作简便，
只需恒温水浴锅等简单设备便可完成反应。目前核
酸探针、Real time PCR、RAPD、RFLP 等分子生物
学检测手段，虽然有较高灵敏度，但是操作较 LAMP
复杂，都需要特殊的仪器[6-10]。本实验通过特异靶
序列的 LAMP 引物实现冬虫夏草特异性扩增，对其
他虫草无交叉反应，模板 DNA 检出限达 6 pg/mL，
比普通 PCR 灵敏度高约 1 000 倍。整个反应在数十
分钟即可完成，而且 LAMP 扩增产物检测方便多
样，可肉眼观察沉淀物，或电泳检测，或加入荧光
染料紫外观察颜色变化。可见冬虫夏草的 LAMP 检
测快速、便捷，适于基层推广应用。
自从 LAMP 技术被发明之后，凭借其高灵敏
度、简便、快速的特性，迅速在食品安全检测、疫
病检测、性别鉴定等多个方面得到了广泛应用[11-12]。
此外，通过 LAMP 法与其他技术联合，开发出多种
检测方法，例如环介导逆转录等温扩增技术
（RT-LAMP）[13]、原位 LAMP（in-situ LAMP）[14]等，
使 LAMP 技术不断深化，应用领域更广阔。
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