全 文 ：　 收稿日期：２０１５－０３－０６　　　修回日期：２０１５－０５－１１
　＊通讯作者：张彩凌，女，硕士，主要从事微藻成分分析研究工作．Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉｎｇｌｉｎｇｌｅ８１＠１２６．ｃｏｍ
第３２卷第２期
Ｖｏｌ．３２　Ｎｏ．２
分 析 科 学 学 报
ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＡＮＡＬＹＴＩＣＡＬ　ＳＣＩＥＮＣＥ
２０１６年４月
Ａｐ

ｒ．２０１６
ＤＯＩ：１０．１３５２６／ｊ．ｉｓｓｎ．１００６－６１４４．２０１６．０２．０２５
高效液相色谱法测定栅藻中５种类胡萝卜素的含量
张彩凌＊，牛春芳，葛兴信，武献春
（新奥科技发展有限公司，煤基低碳能源国家重点实验室，河北廊坊０６５００１）
摘　要：建立了栅藻中虾青素、叶黄素、玉米黄质、角黄素和β －胡萝卜素５种类胡萝卜
素的Ｃ３０－反相高效液相色谱测定方法。冻干的藻粉经二甲基亚砜、二氯甲烷∶甲醇
（２５∶７５，Ｖ／Ｖ）混合溶剂超声提取后，经０．１０７ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＯＨ－甲醇溶液４℃下黑暗冷皂
化１２ｈ，采用ＹＭＣ－ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ　Ｃ３０色谱柱（２５０×４．６ｍｍ，５μｍ），以甲醇、甲基叔丁基
醚、水组成的流动相梯度洗脱，紫外检测器４５０ｎｍ检测。在优化实验条件下，５种色素
可以很好地从藻粉中提取出来并且转化为游离的类胡萝卜素，并且在不同浓度下其峰
强度和质量浓度呈良好的线性。虾青素、叶黄素、玉米黄质、角黄素和β－胡萝卜素的平
均回收率范围为１０１％～１０７％，平均相对标准偏差范围为０．４９％～２．７８％，检出限范
围为０．０５～０．３μｇ／ｍＬ。该方法操作简单准确、可靠，可同时定量分析栅藻中上述５种
类胡萝卜素的含量。
关键词：高效液相色谱法；类胡萝卜素；微藻
中图分类号：Ｏ６５７．７＋２　　　文献标识码：Ａ　　　文章编号：１００６－６１４４（２０１６）０２－２６９－０４
类胡萝卜素是一种重要的天然色素，它不仅是一种很好的食品添加剂，而且广泛应用于化妆品、保健
品等。同时类胡萝卜素在人体内具有多种生物学功能，可对一些疾病起到预防和治疗作用［１］。目前，对类
胡萝卜素的分析多采用高效液相色谱法（ＨＰＬＣ）。而 ＨＰＬＣ法用于类胡萝卜素分离分析时最常用Ｃ１８
柱，流动相常用甲醇、异丙醇、乙腈、水，并配以一些溶剂如正己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷，采用梯度洗
脱［２－６］。但是Ｃ１８柱对于结构相似的类胡萝卜素及其异构体的分离仍然是一项挑战［７］，最为典型的情况是
玉米黄质和叶黄素两者互为异构体，分离起来比较困难。１９９２年，Ｃｒａｆｔ［８］首次应用Ｃ３０柱分离类胡萝卜素
标准品和血清中的类胡萝卜素。随后人们尝试用Ｃ３０柱来优化类胡萝卜素的分离［９］。尤其是在分离叶黄
素和玉米黄质这两种结构非常相似的化合物上，Ｃ３０柱显示出了明显的优势。目前还未见报道采用Ｃ３０柱
ＨＰＬＣ法分离检测栅藻中各种色素含量的报道。
微藻是生产类胡萝卜素的最佳来源，栅藻是一种常见的淡水微藻，含有丰富的类胡萝卜。本文以该藻
为研究对象，用Ｃ３０－ＨＰＬＣ法对其中的虾青素、叶黄素、玉米黄质、角黄素和β －胡萝卜素５种类胡萝卜素
的含量进行测定，此方法具有分离效果好、多组分同时分析的特点。
１　实验部分
１．１　仪器与试剂
Ａｇｉｌｅｎｔ　１２００高效液相色谱仪（美国，Ａｇｉｌｅｎｔ公司），配紫外检测器；３－１５高速离心机（Ｓｉｇｍａ），超声波
清洗仪（南京垒君达超声电子设备有限公司）。
标准品：虾青素（纯度９６．０％）、玉米黄质（纯度８５％）、角黄素（纯度≥９８％）购于Ｔｏｒｏｎｔｏ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　Ｉｎｃ）；叶黄素（纯度≥９０％）购于Ｓｅｅｂｉｏ　Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ；β－胡萝卜素标品（纯度≥９３％）购于Ｓｉｇｍａ，
各标准品－１８℃避光储存于。称取适量５种色素的标准品用二氯甲烷和丙酮的混合液溶解（超声波促进
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第２期 张彩凌 等：高效液相色谱法测定栅藻中５种类胡萝卜素的含量 第３２卷
溶解），加入适量的２，６－二叔丁基对甲酚（ＢＨＴ），定容于２５ｍＬ棕色瓶中，充氮气并于－１８℃冰箱避光保
存。二甲基亚砜、丙酮、乙腈、二氯甲烷均为分析纯，甲醇和甲基叔丁基醚均为色谱纯。实验用水为蒸馏水。
１．２　提取与皂化
准确称取５０ｍｇ藻粉，加入４ｍＬ二甲基亚砜（ＤＭＳＯ），放入超声波清洗仪中于２０℃超声１５ｍｉｎ，离
心，取上清液，剩余藻渣加入４ｍＬ提取液二氯甲烷∶甲醇混合液（体积比２５∶７５），放入超声波清洗仪中２０
℃超声１５ｍｉｎ，离心，取上清液；重复此步骤直至上清液和藻渣变白。合并上清液，加入１／６体积的０．１０７
ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＯＨ－甲醇溶液，混匀，充氮气，在４℃冰箱中黑暗冷皂化１２ｈ。于上述皂化液中加入３～５ｍＬ石
油醚，震荡均匀后加入与皂化液等体积的蒸馏水，静置分层后，吸取上层液体；剩余液体继续加入石油醚提
取，直至色素全部抽提完全。合并上层液体，氮气吹干，然后用５ｍＬ提取液定容，经０．２２μｍ针筒式有机
滤膜过滤，滤液待测。
１．３　高效液相色谱法测定条件
色谱柱：ＹＭＣ－ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ　Ｃ３０柱（２５０×４．６ｍｍ，５μｍ，日本ＹＭＣ公司）；流动相：Ａ为甲醇∶甲基叔丁
基醚∶水混合液（体积比８１∶１５∶４），流动相Ｂ为甲醇∶甲基叔丁基醚∶水混合液（体积比７∶９０∶３）。洗脱程
序：０～５５．６ｍｉｎ，１００％～４４．４％Ａ；流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ；紫外检测器检测波长：４５０ｎｍ；进样量：１０μＬ；柱
温：２０℃。外标法定量。
２　结果与讨论
２．１　稳定性
由于类胡萝卜素是由多个异戊二烯单元构成，其中所含的多个双键导致该类化合物具有极大的不稳
定性，在光照下易被破坏，很容易被空气中的氧或过氧化物氧化，所以混标应该避光低温保存。样品前处
理过程中应尽快完成且尽量避免强光，控制操作温度，利用超声波提取时需控制提取温度在２０℃以下，皂
化在低温条件下进行并且不能时间太长，充氮气。
２．２　提取及皂化方法的考察
天然虾青素是以酯的形式存在，一般采用提取皂化的方法进行测定。孙伟红［１０］等人采用二氯甲烷、
甲醇提取经碱皂化的微藻中的色素，但因５种色素溶解度的差异性，所以不适合采用２种溶剂提取。本实
验采用ＤＭＳＯ超声破壁的方法预提取栅藻中的色素，再采用混合溶剂提取，使栅藻中的５种色素达到充
分的溶出提取。而对于β－胡萝卜素则同时采用了直接提取测定和提取皂化测定的方法，并且对于两种方
法的结果进行了比较，结果表明皂化不会影响β－胡萝卜素含量测定，所以最终对样品采用提取皂化的方
法处理。对于样品中的角黄素进行了提取率实验，测得提取率为９１％。
图１　类胡萝卜素标准样品（Ａ）和栅藻中类胡萝卜素（Ｂ）的色谱图
Ｆｉｇ．１　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ　ｓｔａｎｄａｒｄｓ（Ａ）ａｎｄ　ｔｈｅ　ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ　ｉｎ　ｓｃｅｎｄｅｓｍｕｓ（Ｂ）
１．Ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ；２．Ｌｕｔｅｉｎ；３．Ｚｅａｘａｎｔｈｉｎ；４．ｃａｎｔｈａｘａｎｔｈｉｎ；５．β－Ｃａｒｏｔｅｎｅ．
２．３　色谱分离与定性
选择Ｃ３０柱，柱温２０℃，比较了乙腈∶甲醇∶甲基叔丁基醚体系做流动相、乙腈∶水∶甲基叔丁基醚／磷酸
体系做流动相、甲醇∶水∶甲基叔丁基醚体系做流动相进行分离分析，发现乙腈∶甲醇∶甲基叔丁基醚体系、
乙腈∶水∶甲基叔丁基醚∶磷酸体系做流动相玉米黄质与叶黄素无法很好分离，因此本实验选取甲醇∶水∶甲
基叔丁基醚体系做流动相进行洗脱。借鉴Ｓａｎｄｅｒ［１１］等应用的Ｃ３０柱分离类胡萝卜素的方法，对洗脱程序进
行优化，缩短了样品分析的时间。图１（Ａ）为虾青素、叶黄素、玉米黄质、角黄素和β－胡萝卜素混合标样的
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第２期 分 析 科 学 学 报 第３２卷
液相色谱图，图１（Ｂ）为栅藻样品皂化提取液的色谱图。从图中可见，在本实验选定的色谱条件下，５种色
素得到较好的分离。对５种色素的分离进行了分离度和理论塔板数的计算，结果表明５种色素的分离度
都在２．０以上，理论塔板数都在６　０００以上，能够满足测定要求。
２．４　线性关系与检出限
配制５种色素的系列浓度混合标准溶液并进行测定，以质量浓度（ｘ，μｇ／ｍＬ）为横坐标，以峰面积（ｙ）
为纵坐标绘制标准工作曲线；以３倍信噪比（Ｓ／Ｎ）测得各组分的检出限。虾青素、叶黄素、玉米黄质、角黄
素和β－胡萝卜素在一定浓度范围内呈良好线性关系。线性回归方程、线性范围、相关系数及检出限如表１。
表１　方法的线性方程、线性范围、相关系数及检出限
Ｔａｂｌｅ　１　Ｌｉｎｅａｒ　ｅｑｕａｔｉｏｎｓ，ｌｉｎｅａｒ　ｒａｎｇｅｓ，ｃｏｒｒｅｔａｔｉｏｎ　ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ａｎｄ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｌｉｍｉｔｓ　ｏｆ　ｔｈｉｓ　ｍｅｔｈｏｄ
Ｃｏｍｐｏｕｎｄ 　Ｌｉｎｅａｒ　ｅｑｕａｔｉｏｎ　 Ｃｏｒｒｅｔａｔｉｏｎ　ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｌｉｎｅａｒ　ｒａｎｇｅ（μｇ／ｍＬ）
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｌｉｍｉｔ
（μｇ／ｍＬ）
Ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ　 ｙ＝１００．０１ｘ－１９．３５　 ０．９９９９　 １．０３０－２５．７　 ０．０６
Ｌｕｔｅｉｎ　 ｙ＝１１０．３３ｘ－９．８８　 ０．９９９９　 ０．９８－２４．５９　 ０．０４
Ｚｅａｘａｎｔｈｉｎ　 ｙ＝１９．５３ｘ－３．９８　 ０．９９９３　 ０．６－１５．１８　 ０．３
ｃａｎｔｈａｘａｎｔｈｉｎ　 ｙ＝１０６．３２ｘ－１２．３５　 ０．９９９９　 ０．７６－１９．０７　 ０．０５
β－Ｃａｒｏｔｅｎｅ　 ｙ＝６３．７４ｘ－５．５８　 ０．９９９９　 １．２２－３０．５４　 ０．０９
２．５　回收率与精密度试验
为验证方法的可靠性，进行了回收率和精密度（ＲＳＤ）试验。每一加标水平重复测定５次，结果如表２
所示。由表２可见，添加回收率高，准确度和精密度都能满足类胡萝卜素含量测定要求，适用于栅藻中类
胡萝卜的含量测定。
表２　方法的加标回收率（ｎ＝５）
Ｔａｂｌｅ　２　Ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ（ｎ＝５）
Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ　ｖａｌｕｅ（μｇ）
Ａｄｄｅｄ
（μｇ）
Ｆｏｕｎｄ（ａｖｅｒａｇｅ　ｖａｌｕｅｓ±ＳＤ）
（μｇ）
Ｒｅｃｏｖｅｒｙ
（％）
ＲＳＤ
（％）
Ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ　 ６１．０　 ２５．７　 ８９．４６±０．２０　 １１０．７４　 ０．２３
３０．２　 ４１．２　 ７３．３４±０．５０　 １０４．７１　 ０．６９
３０．２　 ５１．５　 ８３．６１±０．４６　 １０３．７１　 ０．５５
Ｌｕｔｅｉｎ　 ５７．７　 ２４．６　 ８４．２４±０．３４　 １０７．８９　 ０．４０
２８．０　 ３９．３　 ７０．４５±０．５３　 １０８．０２　 ０．７６
３０．１　 ４９．２　 ８２．３４±０．６６　 １０６．１９　 ０．８０
Ｚｅａｘａｎｔｈｉｎ　 ３６．６　 １５．２　 ５２．７２±０．７０　 １０６．０５　 １．３２
１６．０　 ２４．３　 ５１．４９±１．０３　 １０４．９０　 ２．５０
１６．０　 ３０．４　 ４９．４６±２．２４　 １１０．０７　 ４．５２
Ｃａｎｔｈａｘａｎｔｈｉｎ　 ４５．２　 １９．１　 ６６．０３±０．５０　 １０９．０６　 ０．７６
２０．４　 ３０．７　 ５２．６５±０．５３　 １０５．０６　 ０．６９
２２．３　 ３８．１　 ６２．７１±０．３５　 １０６．０６　 ０．５６
β－Ｃａｒｏｔｅｎｅ　 ７１．７　 ３０．５　 １０２．３３±０．７７　 １００．４３　 ０．７５
３４．７　 ４８．９　 ８４．８７±０．３１　 １０２．６０　 ０．３７
３３．３　 ６１．１　 ９５．６７±０．５４　 １０２．０８　 ０．５６
３　结论
本文建立了栅藻中５种类胡萝卜素提取皂化的方法，使得一次性同时分离检测５种色素的含量成为
可能，该处理方法节省时间，准确可靠。Ｃ３０－高效液相色谱－紫外检测法检测５种类胡萝卜素，分离度、理论
塔板数均可以满足分离分析要求。该方法准确、可靠，操作简单，可同时定性定量分析栅藻中５种类胡萝
卜素的含量。
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第２期 张彩凌 等：高效液相色谱法测定栅藻中５种类胡萝卜素的含量 第３２卷
参考文献：
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Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｆｉｖｅ　Ｃａｒｏｔｅｎｅｓ　ｉｎ　Ｓｃｅｎｄｅｓｍｕｓ　ｂｙ
Ｈｉｇｈ　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　Ｌｉｑｕｉｄ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ
ＺＨＡＮＧ　Ｃａｉ－ｌｉｎｇ＊，ＮＩＵ　Ｃｈｕｎ－ｆａｎｇ，ＧＥ　Ｘｉｎｇ－ｘｉｎ，ＷＵ　Ｘｉａｎ－ｃｈｕｎ
（Ｓｔａｔｅ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｃｏａｌ－ｂａｓｅｄ　Ｌｏｗ　Ｃａｒｂｏｎ　Ｅｎｅｒｇｙ，ＥＮＮ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　Ｃｏ．Ｌｔｄ，Ｌａｎｇｆａｎｇ０６５００１）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａ　Ｃ３０－ｈｉｇｈ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ（Ｃ３０－ＨＰＬＣ）ｍｅｔｈｏｄ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ
ｃａｒｏｔｅｎｅｓ　ｉｎ　ｓｃｅｎｄｅｓｍｕｓ．Ｆｒｅｅｚｅ－ｄｒｉｅｄ　ａｌｇａｅ　ｐｏｗｄｅｒ　ｓａｍｐｌｅ　ｗａｓ　ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃａｌｙ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｄｉｍｅｔｈｙｌ　ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ，
ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ－ｍｅｔｈａｎｏｌ（２５∶７５，Ｖ／Ｖ），ａｎｄ　ｓａｐｏｎｉｆｉｅｄ　ｗｉｔｈ　０．１０７ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＯＨ－ｍｅｔｈａｎｏｌ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ａｔ　４℃ｉｎ
ｄａｒｋ　ｆｏｒ　１２ｈｏｕｒｓ．Ｔｈｅ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃａｒｏｔｅｎｅｓ　ｗａｓ　ａｃｈｉｅｖｅｄ　ｕｓｉｎｇ　ａ　ＹＭＣ－Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ　Ｃ３０（２５０×４．６ｍｍ，５μｍ）
ｃｏｌｕｍｎ　ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｗｉｔｈ　ａ　ｍｏｂｉｌｅ　ｐｈａｓｅ　ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ　ｏｆ　ｍｅｔｈａｎｏｌ，ｔｅｒｔ－Ｂｕｔｙｌ　ｍｅｔｈｙｌ　ｅｔｈｅｒ　ａｎｄ　ｗａｔｅｒ．Ｔｈｅ　ＵＶ
ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｏｐｅｒａｔｅｄ　ａｔ　４５０ｎｍ．Ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ，ｆｉｖｅ　ｐｉｇｍｅｎｔｓ　ｆｒｏｍ　ａｌｇａｅ　ｐｏｗｄｅｒ　ｗｅｒｅ　ｃｏｖｅｒｔｅｄ　ｔｏ　ｆｒｅｅ　ｃａｒｏｔｅｎｅｓ
ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ，ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ　ｉｎ　ａ　ｇｏｏｄ　ｌｉｎｅａｒ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ　ｐｅａｋ　ａｒｅａｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ．
Ｔｈｅ　ａｖｅｒａｇｅ　ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ｏｆ　ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ，ｌｕｔｅｉｎ，ｚｅａｘａｎｔｈｉｎ，ｃａｎｔｈａｘａｎｔｈｉｎ　ａｎｄβ－ｃａｏｒｔｅｎｅ　ｗａｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ　１０１％ａｎｄ
１０７％．Ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｓｔａｎｄａｒｄ　ｄｅｖｉａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｗｅｒｅ　ｂｅｔｗｅｅｎ　０．４９％ａｎｄ　２．７８％，ｗｈｉｌｅ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
ｌｉｍｉｔｓ　ｗｅｒｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒａｎｇｅ　ｏｆ　０．０５－０．３μｇ／ｍＬ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｉｓ　ａｃｃｕｒａｔｅ，ｒｅｌｉａｂｌｅ　ｗｉｔｈ
ｓｉｍｐｌｅ　ｏｐｅｒａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆｉｖｅ　ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ　ｉｎ　ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｃ３０－ＨＰＬＣ；Ｃａｒｏｔｅｎｅ；Ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ
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