全 文 ：0 引言
船舶压载水的排放是造成地理性隔离水体间有害生物
传播的主要途径之一 [1-3]。 在船舶压载水有害生物入侵问题的
防治上，较大型生物可以用物理过滤的方法去除，但对于诸
如小新月菱形藻（Nitzschia closterium minutissima）这样的单
细胞生物或原生动物，因其个体微小而去除困难。 在航深海
羟基自由基致死小新月菱形藻的生化
机制
薛晓红，白敏冬，杨 波，张拿慧，范 丹，华六三
大连海事大学环境工程研究所，辽宁大连 116026
收稿日期： 2010-03-18
基金项目： 国家自然科学基金项目（60801010，50578020）；“十一五”国家科技支撑计划重点项目（2006BAC11B06）
作者简介： 薛晓红，助教，研究方向为海洋生物防治，电子信箱：xiaohong-xue@163.com；白敏冬（通信作者，中国科协所属全国学会个人会员登记号：
S292102158M），教授，研究方向为环境污染治理，电子信箱：mindong-bai@163.com
摘要 船舶压载水中悬浮微藻的去除一直是一个难题。 本文以小新月菱形藻（Nitzschia closterium minutissima）为压载水代表生
物，研究了羟基自由基致死小新月菱形藻的生化机制。 结果表明，当小新月菱形藻的浓度为 1.2×106/mL 时，致死小新月菱形藻的羟
基溶液浓度范围为 0.81~0.91mg/L。 羟基自由基对小新月菱形藻的致死机制是对细胞蛋白质、藻糖和叶绿素等大分子的破坏，使其
无法再生，从而达到压载水排放的生物量要求。
关键词 压载水；小新月菱形藻；羟基自由基；致死机制
中图分类号 X55 文献标识码 A 文章编号 1000-7857（2010）09-0080-04
Biochemical Mechanism of Killing Nitzschia closterium minutissima by
Hydroxyl Radicals
XUE Xiaohong, BAI Mindong, YANG Bo, ZHANG Nahui, FAN Dan, HUA Liusan
Institute of Environmental Engineering, Dalian Maritme University, Dalian 116026, Liaoning Province, China
Abstract It has always been an important issue to remove suspended algae in ships ballast water. The ballast water discharge process is
the main cause of pest spreads in a body of water of geographic isolation. The treatment of micro-organisms in ballast water by hydroxyl
radicals is based on the advanced oxidation technology, a new method, that will not adversely affect the water environment. Hydroxyl
radical is similar to fluorine in oxidation capability, and is one of the most offensive chemicals, and can react with different types of
organic and inorganic matters. With Nitzschia closterium minutissima as biological representatives in ballast water, this paper mainly study
the biochemical reaction mechanism of killing Nitzschia closterium minutissima by the hydroxyl radicals. Tests for dead Nitzschia
closterium minutissima concentrations were carried out with increase of hydroxyl radical concentration, to observe the changes of
biological macromolecules of protein, glucose and chlorophyll. Results show that when the concentration of Nitzschia closterium
minutissima reaches 1.2×106/mL, the concentration range of dead Nitzschia closterium minutissima hydroxyl is 0.81~0.91mg/L. When the
hydroxyl radical solution reaches progressively the concentration of 0.7mg/L, 99% of Nitzschia closterium minutissima can be killed, with
no regeneration after 24 hours. The lower rate of protein and glucose shows a further decrease after an initial increase and chlorophyll is
in the trend of reducing. Hydroxyl radicals are effective in oxidation, decomposition of protein and sugar, and reduction of the chlorophyll
content. The reaction of the hydroxyl radical solution is to kill Nitzschia closterium minutissima, at the same time, to undermine vivo
biological molecules so that it can not be regenerated, which can meet the requirements of the ballast water discharge of biomass.
Keywords ballast water; Nitzschia closterium minutissima; hydroxyl radical; lethal mechanism
研究论文（Articles）
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更换压载水方法（水深 200m 以下距岸 200 海里以外）是一种
有效减少外来生物入侵的可行措施 [4-5]， 但存在消耗能量过
高、操作运行时间过长等问题；加热压载水法 [6]，压载水中的
新月菱形藻在水温 38℃条件下 2h 后才致死， 存在处理时间
长、能耗过高、形成的热应力将影响船舶的安全等难以解决
的问题。 也有不少科学工作者进行了加入杀灭生物的药剂如
氯、过氧化氢、臭氧等化学法以及超声波、紫外光、加热、电解
等物理方法的研究[7-10]。 尽管治理压载水问题如此重要，不少
科学工作者也作了大量探索性研究工作，但海上环境保护委
员会（MEPC）以及全球压载水管理项目组（GloBallast）却认为
当前尚无一种有效的治理压载水方法。
压载水有其特殊性， 在研究防治海洋生物入侵的方法
时，应遵循高级（先进）氧化技术（AOT 或 AOP）的要求，力求
实现零污染、零废物排放。 为此，采用绿色强氧化剂羟基自由
基（·OH）是首选的方法。 ·OH（E0=2.80V）与氟的氧化能力相
当，是进攻性最强的化学物质之一，它几乎能和所有的生物
大分子、有机物和无机物发生不同类型的化学反应。 由于小
新月菱形藻的细胞壳面一侧具龙骨突，且上下龙骨突彼此交
叉相对，比大多数浮游植物更难杀灭。 本文以小新月菱形藻
为压载水中入侵生物的代表藻，研究了·OH 致死小新月菱形
藻的生化机制。
1 实验材料与方法
1.1 实验系统
·OH 处理船舶压载水实验系统如图 1 所示，配有小新月
菱形藻的模拟压载水（2t）被泵打入主管路中，流速为 2.5m/s。
一部分压载水通至自制的羟基产生设备， 制备高浓度的·OH
溶液，设备的处理量 10t/h，调节·OH 产生设备的电参数可改
变·OH的浓度，·OH溶液最高浓度可达 10mg/L。 ·OH溶液注
入液液溶解器，与主管路的注入比为 1:5，充分混溶稀释，在
主管路中得到分布均匀的实验所需的·OH浓度。 在主管路中
设置 A 和 B 两个取样点， 取样点的反应时间分别为 4.8s 和
6.0s， 本文实验为 B 点的取样测试结果。 实验设置了 0.32~
0.91mg/L 由低到高 8个羟基溶液浓度，每个浓度取 3个 1L的
平行样，检测小新月菱形藻的杀灭效果及生化机制。
1.2 实验材料
实验用的小新月菱形藻， 藻种来自大连水产学院。 藻种
使用前经分离、纯化后，在 XYZ－250D 型震荡数显光照培养
箱 （常洲国华仪器有限公司 ）中进行培养 ，培养液采用 f/2
营养盐配方 [11]。 在 （23 ±1）℃ 、pH （7.2 ±0.1）、光照 2600lnx、
光期:暗期=10:14 条件下进行藻类培养，将小新月菱形藻富集
到 106/mL数量级。
1.3 实验方法
藻类检测。 在 B取样点用三角玻璃瓶取 3个 1L平行样，
在显微镜下用血球计数板直接读出活体数目。
光合色素检测 。 光合色素测定按海洋监测规范
（GB17378.7—1998）的分光光度法进行，用 UNICO7200 型分
光光度计（尤尼柯上海仪器有限公司）测定。 葡萄糖测定：邻
甲苯胺显色后，在 630nm 下比色测定[11]；总蛋白质测定用双缩
脲法[11]。
2 实验结果及分析
2.1 ·OH对小新月菱形藻的致死作用及其适宜浓度
实验前藻液的浓度为 1.2×106/mL。 通过调节·OH 溶液产
生设备，使用·OH溶液浓度梯度为 0.32、0.39、0.47、0.55、0.63、
0.71、0.81 和 0.91mg/L，不同浓度的·OH 杀灭小新月菱形藻情
况如表 1 所示。
由表 1 可以看出，·OH 溶液作用后， 小新月菱形藻浓度
表 1 羟基自由基杀灭小新月菱形藻情况
Table 1 Nitzschia closterium being killed by hydroxyl solution
0.32
0.39
0.47
0.55
0.63
0.71
0.81
0.91
1.2
1.0
1.1
1.03
0.45
0.42
0.40
0.20
0.05
3.2
4
4
4.5
4
0.5
0.3
0.01
0
0
0
0
0
0
0
0
100
100
100
100
100
100
100
100
藻液浓度/106mL-1 藻液浓度/104mL-1 藻液浓度/mL-1 致死率/％
·OH 溶液浓度
/（mg·L-1）
藻液原浓度
/106mL-1
反应后 24h 后 48h 后
97.4
96.6
96.6
96.2
96.6
99.6
99.8
100
致死率/％
16.6
0.9
14
62.5
65
66.6
83.3
96
致死率/％
研究论文（Articles）
科技导报 2010，28（9） 81
明显减少。 当·OH 溶液浓度为 0.91mg/L 时，小新月菱形藻反
应后的致死率已达 96％。24h后，浓度为 0.71mg/L·OH溶液作
用后的小新月菱形藻样品的致死率达到 99.8％； 浓度为
0.91mg/L·OH溶液作用后的样品中的小新月菱形藻已完全致
死且无再生现象。48h后，各·OH溶液浓度下的小新月菱形藻
的致死率均达到 100％。 从 24h 及 48h 的小新月菱形藻存活
情况可以看出， 虽然在显微镜下仍可观察到小新月菱形藻，
但·OH 已破坏了小新月菱形藻的细胞结构， 使其无法再生。
综上得出 ，·OH 溶液的致死小新月菱形藻的最佳浓度在
0.81~0.91mg/L 之间。
2.2 ·OH对藻蛋白质的破坏
·OH溶液对蛋白质含量的影响情况如图 2 所示。 从图 2
可以看出，水样中的蛋白质含量（由于实验使用的样品是过
滤后的海水中加入高浓度的小新月菱形藻，检测未加藻原海
水中蛋白质含量为零，证明水样中为小新月菱形藻的蛋白质
含量）呈先减小，后增加，再减小的趋势（蛋白质的含量和吸
光度值成正比）。 当·OH溶液浓度在 0~0.4mg/L 区间内，蛋白
质的含量随·OH溶液浓度的增加而减少。 蛋白质构成的形态
是多种多样的，有的附着在膜的表面，有的镶嵌在脂类双分
子层内，还有的存在于细胞内部。 根据蛋白质的构成形态推
断： 当·OH 溶液浓度较低时，·OH 只能和部分的附着蛋白质
反应，使其肽键断裂，而不能使藻细胞膜破裂，水样中蛋白质
的含量减少；当·OH 溶液浓度继续增加达到 0.5mg/L 时，·OH
将藻细胞膜氧化破碎，其中镶嵌的蛋白质和细胞内的蛋白质
泄漏出来，但由于·OH 溶液浓度不够高，不能继续氧化蛋白
质，使肽键断裂，水样中蛋白质的量增加；当·OH 溶液浓度大
于 0.5mg/L 时，·OH溶液能够将泄漏的蛋白质氧化， 最终，水
样中的蛋白质完全被氧化分解，吸光度呈现最小值。 此结果
也证明了·OH逐步氧化藻细胞的过程。
2.3 ·OH对藻糖的破坏
图 3 为·OH 溶液对葡萄糖含量的影响情况。 由图 3 可
知，水样中的葡萄糖含量（由于实验使用的样品是过滤后的
海水中加入高浓度的小新月菱形藻，检测未加藻的原海水中
葡萄糖含量为零， 证明水样中为小新月菱形藻的葡萄糖含
量）呈先减小，后增加，再减小，最后增加的趋势（葡萄糖的含
量和吸光度值成正比）。 当羟基浓度在 0~0.4mg/L 区间内，葡
萄糖的含量随·OH 溶液浓度的增加而减少，此时·OH 作为氧
化剂可能是不足量的，它仅可以和膜表面的葡萄糖发生氧化
反应，而不能使藻细胞膜破裂，因此水样中葡萄糖的含量减
少；当·OH 溶液浓度继续增加到约 0.55mg/L 时，葡萄糖的含
量反而增加，推测·OH 溶液将藻细胞膜氧化使其破碎，藻细
胞内的葡萄糖泄漏出来， 但由于·OH 溶液浓度还是较低，不
能继续氧化葡萄糖， 这时水样中的葡萄糖的含量就会增加，
体现出来的吸光度也增加；当·OH 溶液浓度在 0.55~0.62mg/L
区间内，葡萄糖的含量随·OH 溶液浓度的增加而减少，这是
因为泄露出来的葡萄糖也继续被·OH 溶液氧化；当·OH 溶液
浓度大于 0.62mg/L 时， 葡萄糖的含量又呈现增大的趋势，究
其原因很可能是·OH 氧化分解了小新月菱形藻内的大分子
多糖，使之降解为单糖，导致葡萄糖的含量增加。 这一结果也
表明大分子物质比小分子物质更容易被·OH 破坏。 据此分
析，实验结果和理论是完全吻合的。
2.4 ·OH对叶绿素的破坏
·OH对叶绿素含量的影响情况如图 4和图 5所示。 从图
4和图 5 可以看出，水样中的叶绿素含量都是呈减小的趋势。
研究论文（Articles）
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由于叶绿素 a是由单、双键交替的不饱和结构组成的，极易与
羟基自由基反应，发生氧化、断裂、变构和分解等生化反应。
叶绿素 b 是多键和单键交替的不饱和结构， 也容易被氧化。
随着·OH 溶液浓度的不断增加，其不断氧化叶绿素，使叶绿
素的含量不断减少，体现出吸光度下降。 叶绿素是藻细胞光
合作用的重要组成部分，本实验说明·OH 可以在很短的时间
内氧化分解叶绿素，破坏其光合作用，导致微生物细胞体的
死亡。
3 结论
1） 当羟基溶液浓度范围在 0.81~0.91mg/L 时， 可将浓度
为 106/mL的小新月菱形藻杀灭，且 48h后无再生现象。
2） 羟基自由基能够氧化、分解小新月菱形藻的蛋白质和
糖，并使叶绿素含量降低，这是致死小新月菱形藻的重要生
化机制。
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（责任编辑 王芷）
研究论文（Articles）
由中国矿物岩石地球化学学会、中国地质学会等主办的“第三届全国应用地球化学学术讨论会”将于 2010 年 12 月 1
日在广州市举行。
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准与应用；应用地球化学新理论、方法与技术；基础地质与应用地球化学；特色农业发展与应用地球化学；地方病防治与应
用地球化学；人-地相互作用与应用地球化学；农产品安全与应用地球化学；土地、环境评价与应用地球化学；重大工程用
地决策与应用地球化学；生态环境安全与应用地球化学；矿山环境地球化学；温泉、矿泉水地球化学；重要都市区地球化学
灾害预警预测；应用地球化学教育与地学信息社会服务；地球化学在其他领域的应用。 论文截止日期：2010 年 7 月 30 日。
联系电话：020-84111255；电子信箱：aahuxiaoqiong@126.com， zhouyongzhang2005@163.com。
“第三届全国应用地球化学学术讨论会”征文
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