全 文 ：63
研究报告 REPORTS
pH对眼点拟微绿球藻的生长 、总脂含量及脂肪酸组成的影响*
王秀良 1 刘晨临 2 张学成 1
(1青岛海洋大学海洋生命学院 266003)
(2国家海洋局第一海洋研究所青岛 266061)
提要 pH对眼点拟微绿球藻 (Nannocholoropsis oculata)的生长 、总脂含量及脂肪酸组成有明
显影响 。研究表明 ,眼点拟微绿球藻的生长对 pH有较强的适应性 ,在 pH 6.2 ～ 9.8的范围内均
能较好的生长 , 但在 pH5.5的条件下生长受到较强的抑制 。在不同 pH条件下 , 在同一细胞周
期内总脂含量及脂肪酸组成均有相同的变化规律 , 即总脂含量在对数初期略有下降然后逐渐
上升 ,在稳定期达到最大值 。16∶0 , 18∶1n9的含量在稳定期显著升高 ,而 EPA的含量在稳定
期明显下降 。在对数初期 ,藻细胞在 pH 6.8的条件下含有较高的 EPA含量 , 而在 pH 9.8的条
件下 ,藻细胞的 EPA含量明显降低 。
关键词 眼点拟微绿球藻 ,EPA ,总脂 ,脂肪酸 , pH ,光合生物反应器
n-3长链多饱和脂肪酸(主要为γ-亚麻酸 、EPA和
DHA)是重要的一类生物活性物质 , 具有很高的营养
价值和多种保健功能 。海洋微藻具有非常高的合成
n-3长链多饱和脂肪酸的能力 ,日渐成为 n-3长链多饱
和脂肪酸的新来源 。因此 ,有关利用微藻积累 n-3长链
多饱和脂肪酸的理论研究和开发应用倍受人们关
注 。
眼点拟微绿球藻(Nannochloropsis oculata)是一种
重要的海产经济微藻 , 其脂肪酸组成简单 , 富含
EPA[ 5 ] 。目前 ,日本 、澳大利亚等国家已实现了大规模
养殖 , 国际市场供不应求[6 ,7 ] 。研究者发现在富含氮 、
磷的培养基中 ,该藻 EPA的含量可以达到总脂肪酸的
35%[ 1 ] ;眼点拟微绿球藻的总脂含量在稳定期含量最
高 ,占干重的 43.3%,在生长对数早期 ,EPA与总不饱
和脂肪酸的比例最高 ,可达 27.7%[2 ] 。而有关 pH对该
藻的影响规律少有报道 。本文利用封闭式光合生物反
应器研究了 pH对该藻的生长 、总脂含量及脂肪酸组
成的影响规律 , 为更好地进行生态调控 , 提高 EPA 的
含量提供了依据 。
1 材料与方法
1.1 藻种来源
藻种眼点拟微绿球藻属于金藻门 (Chrysophyta),
真眼点纲(Eustigmatophyceae)。藻细胞直径 2 ～ 3μm。
由中国水产科学研究院黄海水产研究所提供 。
1.2 培养基
实验中所用培养基为 Provasoli的加富培养基 , 氮
源为 NaNO 3 ,磷源为 NaH 2PO 4 · 2H 2O , 氮 、磷的终浓
度分别为 0.924 mmol/L、 0.085 mmol/L , N/P比为
10.85(M/M)。培养基均用无菌海水配制 。
1.3 培养装置
实验中所用密闭式 BFC-2光合生物反应器为烟台
高新区海洋生物工程研究所生产 。反应器罐体为柱
状 ,径高比为 1/3 ,实际体积为 7 L ,工作体积为 6 L ,培
养过程中的各参数如温度、 pH 、转速 、溶氧均能进行
在线检测 。实验前反应器空罐灭菌 , 121 ℃, 20 min。
1.4 藻种预培养
实验前离心收取藻液 400 ～ 600 ml , 将藻泥接种至
2 L的玻璃三角瓶中 , 培养体积 1 L , 培养基为无菌海
水配制的 Provasoli加富培养基 , 培养至对数期 。所用
玻璃器皿均为高压蒸汽灭菌 。
* 国家“九五”攻关项目 96-C02-01-10-8、96-C02-04-05号;国
家“863”计划项目 819-02-01号。
第一作者:王秀良 , 出生于 1974年 , 硕士。主要从事海洋生
物学研究。E-mail:Xlwang@163.com
收稿日期:2000-11-13;修回日期:2001-01-20
Marine Sciences/Vol.26, No.5/2002
64
图 1 pH对眼点拟微绿球藻生长的影响
Fig.1 Effect of pH on the growth of N.oculata
图 2 pH对眼点拟微绿球藻氮源吸收的影响
Fig.2 Effect of pH on the nitrate absorption of N.oculata
1.5 实验
将活化至对数期后期的藻种按 1∶5的接种量
接种于光合生物反应器中 ,起始OD680值为 0.1左右 。
培养体积为 6 L ,温度为 25±0.5 ℃,转速为 150 r/min ,
光照强度为 6 400±200 lx ,光暗周期为 12 h∶12 h。分批
培养中每天取样测定 680 nm下的 OD值及营养盐消
耗情况 。在不同的细胞时期收取藻液离心 、洗涤 ,在离
心收取藻泥后冷冻干燥 ,藻粉用于总脂和脂肪酸组成
分析 。实验重复两次 ,每次实验至少两个平行样 ,结果
为平均值 。
1.6 分析测试与计算
1.6.1 细胞浓度 根据回归方程 y(106cell/ml)
=36.883×OD680 -0.1076 , R2=0.85;由测得的 OD680
值 ,计算细胞浓度 。
1.6.2 培养基中营养盐消耗 氮源浓度由镉-
铜还原法测得;磷源浓度由磷钼蓝比色法测得[3 ] 。
1.6.3 总脂 藻体总脂占干重的百分比按
Ahlgren 1991年的分光光度法测定 ,由(1)式可得分光
光度法的总脂含量 ,由(2)式换算成重量法结果 。
y(μg)=46.51×OD 528 +2.06 R2=0.988 1 (1)
总脂 (%干重 , 重量法)=6.782 3×总脂 (%干
重 ,光度法)+0.194 5
R2=0.856 5 (2)
1.6.4 脂肪酸组成的气相色谱分析 按 Lepage
1984年的方法并进行了改进 。在螺口试管中称取 15
mg藻粉 ,加入 1ml被 KOH饱和的 CH 3OH溶液 ,迅速
混匀 , 于 75 ℃水浴中皂化 、甲酯化 10 min , 冷却至室
温后加入约 2 ml 1mol/L HCl-CH3OH溶液使 pH≤2 , 振
荡 1min ,在 75 ℃水浴酸化 10min ,冷却至室温 ,加入
0.3 ml石油醚及少许蒸馏水促进分层 , 充分振荡 , 离
心后取上层石油醚相进行色谱分析 。
脂肪酸分析采用美国 HP 5890II型气相色谱仪 ,
氢火焰离子化检测器 , SGEAC 20毛细管珠 (30
m×0.25 mm)。进样后程序升温:150 ℃保持 1 min ,
以 15 ℃/min升至 200 ℃,再以 2 ℃/min升至 250℃。高
纯氮为载气 ,流速 1.5 ml/min ,进样量为 1μl 。以面积
归一化法得到各脂肪酸组分的相对百分含量 。脂肪酸
标样为 Sigma公司产品 。
2 结果
2.1 pH对眼点拟微绿球藻生长的影响
pH对眼点拟微绿球藻生长的影响见图 1。由图
1可见 , 在 pH为 6.8 , 8.5 , 9.8的条件下 ,眼点拟微绿
球藻具有大致相同的生长速率 。在对数初期 ,该藻在
pH 6.8的条件下具有较高的生长速率;在对数后期 ,
在 pH 8.5 , 9.8的条件下 , 眼点拟微绿球藻生长较快
且细胞密度较高 。在 pH 6.2的条件下 ,眼点拟微绿球
藻的生长受到抑制 ,而在 pH 5.5的条件下 ,生长受到
严重抑制 。
由图 2 , 3可见 ,在 pH 5.5 , 6.2的条件下 ,眼点拟
微绿球藻的营养盐消耗受到抑制 , 因而其生长缓慢 ,
尤其是在 pH 5.5的条件下 , 氮源浓度在整个细胞周
期内几乎保持不变 , 磷源浓度在生长初期无变化 , 然
后缓缓下降 。在 pH 6.8 ,8.5 , 9.8条件下 ,眼点拟微绿
球藻的氮源消耗速率基本相同 , 而磷源消耗速率有差
别 , 在 pH 9.8的条件下 , 其消耗速率最快 , 其他条件
下 ,消耗速率大致相同 。
研究报告 REPORTS
海洋科学/2002年/第 26卷/第 5期
65
图 3 pH对眼点拟微绿球藻磷源吸收的影响
Fig.3 Effect of pH on the phosphate absorption of N.oculata
2.2 pH对眼点拟微绿球藻总脂含量的影响
pH对眼点拟微绿球藻总脂含量的影响见图4。
除 pH 9.8以外 ,在所有 pH条件下 ,在一个细胞周期
图 4 pH对眼点拟微绿球藻总脂含量的影响
Fig.4 Effect of pH on the total lipid of N.oculata
研究报告 REPORTS
Marine Sciences/Vol.26, No.5/2002
66
内眼点拟微绿球藻总脂含量的变化规律基本相同 。即
藻细胞的总脂含量在对数初期有所下降 ,然后逐渐上
升 ,在稳定期达到最大值。在 pH 9.2的条件下 , 总脂
含量最高可达细胞干重的 25.57%。在 pH 9.8的条件
下 ,眼点拟微绿球藻的总脂含量明显低于其他条件下
的总脂含量 ,在稳定期时总脂含量仅占生物量干重的
10.55%。
2.3 pH对眼点拟微绿球藻脂肪酸组成及
EPA含量的影响
pH对眼点拟微绿球藻脂肪酸组成的影响见表
1。由表 1可见 , 16∶0 , 16∶1和 20∶5是眼点拟微绿
球藻脂肪酸组成的主要成分 , 三者占总脂肪酸的
60%～ 70%。在不同 pH条件下 ,在一个生长周期内眼
点拟微绿球藻脂肪酸组成的变化规律基本相同 。在对
数生长初期 ,16∶0与 20∶5的含量比较稳定 ,变化不
大 ,而在对数后期 16:0的含量明显增加 ,最高可达脂
肪酸组成的 43%;20∶5的含量则明显降低 , 甚至仅
为脂肪酸组成的 8%。18∶1n9的含量随培养时间的
延长而增加 , 至稳定期时含量明显增加 , 最高可由对
数初期的 3.6%增长为 8.8%。14∶0 ,16∶1 , 18∶0及
20∶4等的含量变化不大 。在 pH 6.2条件下 ,稳定期
时 16∶0的含量相对较低 , 占总脂肪酸组成的 31%,
而在碱性条件下 , 其含量相对较高 , 占总脂肪酸组成
的 40%左右 。在对数期 pH对 EPA(20∶5)含量的影响
见图 5。由图 5可知 ,在 pH 6.8的条件下 ,眼点拟微绿
球藻含有较高的 EPA约为 9.8μg/mg(干重);而在 pH
9.8的条件下 , EPA含量明显降低 , 仅为 5.1μg/mg
(干重),在其他条件下 , EPA含量差别不大 。
3 讨论
(1)在 pH 6.8 ～ 9.8的范围内 , 眼点拟微绿球
藻有较高的生长速率 。在 pH 5.5 ,6.2的酸性条件下 ,
营养源的吸收受到阻碍 , 因而藻细胞的生长受到抑
制 。一般海洋藻类生存的适宜 pH值与海水的 pH值
相近 ,为 pH 8.3左右。不同的藻类生活的适宜 pH值
不同 ,偏离此 pH值 ,微藻生长和体内有关代谢活动即
受影响 。Cohen 1988年发现紫球藻 (Porphyridium cru-
entum)的理想 pH为 7.6左右 ,偏离此值时 , 藻细胞生
长变慢 。本研究表明眼点拟微绿球藻对 pH有较强的
适应性 , 在 pH9.8的强碱性条件下 , 仍然保持很高的
生长速率 ,只有在偏酸性条件下 ,由于氮 、磷的吸收受
到阻碍 ,生长才受到抑制 。
(2)本实验表明在 pH 9.8的条件下 , 眼点拟微绿
球藻的总脂含量明显低于其他 pH条件下的总脂含
量 。在 pH 6.8的条件下 , EPA的含量较高 , 而在 pH
9.8的条件下 , EPA的含量明显低于其他 pH条件下
EPA的含量。有些研究者认为培养基酸碱度的改变影
响了细胞内外的离子平衡、细胞膜的渗透性及有关膜
的结构组成 。当 pH的范围在 5.5 ～ 8.0之间时 ,微藻
的多不饱和脂肪酸的生产受 pH的影响较小[ 4] 。但
Molina等 1992发现等鞭金藻(Isochrysis galbana)在 pH
6.0 ～ 8.0范围内 , 总脂含量变化不大 , 但 EPA含量 ,
随 pH上升而下降 , 在 pH 6.0时含量最高 。本研究也
发现在 pH 6.8时 , 眼点拟微绿球藻的 EPA含量最
高 。这表明 pH值对微藻的总脂及 EPA含量的影响因
藻种的不同而异 。在 pH 9.8时 ,眼点拟微绿球藻的总
脂及 EPA含量均明显低于其他条件下的总脂及 EPA
含量 。这表明在强碱性条件下 , 眼点拟微绿球藻的脂
类合成受到了抑制;生物体内长链脂肪酸的合成都是
从 16∶0开始 , 通过一系列脱氢酶 、加氧酶和链延长
酶类 , 向长链多不饱和脂肪酸转化 , pH可能使此过程
有关的酶的活性受到影响 ,因而 EPA含量相对较低 。
(3)本实验表明在不同 pH条件下 ,眼点拟微绿球
藻的总脂含量在一个培养周期内均表现出相同的变
化规律 , 在对数初期总脂含量略有下降 , 然后逐渐上
升 , 在稳定期含量达到最大值;其脂肪酸组成在一个
图 5 pH对眼点拟微绿球藻对数早期 EPA含量的影响
Fig.5 Effect of pH on the EPA content of N.oculata in the
early exponential phase
研究报告 REPORTS
海洋科学/2002年/第 26卷/第 5期
67
培养周期内也表现出相同的变化规律 。在对数期 EPA
含量较高 , 稳定期时含量明显降低 , 而 16∶0和 18∶
1n9的含量与 EPA相反 , 在稳定期其含量明显升高 。
Yongmanitchai等 1989年表明当培养进入后期时 , 许
多微藻倾向于以脂类的形式储存它们的能源 。这种脂
类通常富含饱和和单不饱和脂肪酸 。海洋微藻等鞭金
藻在培养后期 , 脂类是有机物中的主要成分 , 且中性
脂含量显著升高 ,而富含长链多不饱和脂肪酸的糖脂
却显著降低[ 8] 。本实验表明眼点拟微绿球藻也具有此
规律 。在许多微藻中 ,已经观察到不饱和脂肪酸的降
低是时间的函数 。然而 ,Arao , T.等 1987年发现在一
种海洋硅藻(Phaeodactylum tricornuium)中 , EPA含量
当培养进入后期时显著增加 。由此可见 ,培养周期对
海洋微藻的影响也因藻种而异 。
参考文献
1 魏 东、张学成、隋正红等。氮源和 N/P对眼点拟微绿球
藻的生长、总脂含量和脂肪酸组成的影响 ,海洋科学 ,
2000, 24(7):46～ 51
2 魏 东、张学成、邹立红等。细胞生长时期对两种海洋微
藻总脂含量和脂肪酸组成的影响 ,青岛海洋大学学报 ,
2000 , 30(3):503～ 509
3 T.R.帕森斯、前天吉明、C.M.兰莉。海水分析的化学
和生物学方法。厦门:厦门大学出版社 , 1991。 24～ 27 ,
3～ 7
4 陈 峰、姜 悦。微藻生物技术。北京:中国轻工业出版
社 , 1999。 214～ 239
5 Brown M.R., Jeffrey S.W.et al..Nutritional properties of
microalgae for maricul ture , Aquaculture , 1997, 151:315～
331
6 Zittelli G., Lavista F.et a l..Production of eicosapentaenoic
acid by Nannochloropsis sp.Cultures in outdoor tubular
photobioreactors, Journa lofbiotechnology , 1999, 70(1～ 3):
299～ 312
7 Zou N., Richmond A..Effect of light-path length in
outdoor flat plate reactors on output rate of cell mass and of
EPA in Nannochloropsis sp., Journal of Biotechnology ,
1999 , 70(1～ 3):351～ 356
8 Fidalgo J.P., Torres E., Cid A.et al..Effects of nitrogen
source and growth phase on proximate biochemical composi
tion , lipid classes and fatty acid profile of the marine mi
croalgal Isochrysis galbana , Aquaculture , 1998, 166:
105～ 116
EFFECTS OF pH ON THE GROWTH , TOTAL LIPID CON-
TENT AND FATTY ACID COMPOSITION OF THE MARINE
MICROALGA Nannochloropsis oculata
WANG Xiu-liang1 LIU Chen-lin2 ZHANG Xue-cheng1
(1College of Marine Life Sciences , Ocean University of Qingdao , 266003)
(2First Institute of Oceanography , State Oceanic Adiministration ,Qingdao , 266061)
Received:Nov., 13 , 2000
Key Words:Nannochloropsis oculata , EPA , Total lipid , Fatty acid , pH , Photobioreactor
Abstract
pH has an obvious effect on the growth , total lipid content and fatty acid composition of marine microalga Nan-
nochloropsis oculata .Results showed that a high growth rate of the alga was obtained under the range of pH 6.2 ～ 9.8 , but
the growth was very weak at pH 5.5 because the absorption of nitrate and phosphate was disturbed.At pH 9.8 , the total
lipid and EPA content of the alga dropped obviously but higher EPA content at pH 6.8.The total lipid of the species in-
creased gradually as the culture aged except for a slight reduction in the early exponential phase , the content of 16∶0 and
18∶1n9 increased obviously in the stationary phase , but the EPA content dropped.
(本文编辑:张培新)
研究报告 REPORTS
Marine Sciences/Vol.26, No.5/2002