全 文 ：生物技术进展 2014 年 第 4 卷 第 2 期 124 ～ 128
Current Biotechnology ISSN 2095-
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2341
研究论文
Articles
收稿日期:2014-02-19;接受日期:2014-03-13
基金项目:辽宁省大连市科学技术基金项目(2010J21DW017) ;大连海洋大学 2012 年校列科研项目(2012HYDX15)资助。
作者简介:王维才，硕士研究生，研究方向为海洋微生物资源综合利用。E-mail:weicaiwang012@ 163． com。* 通信作者:张付云，副教
授，主要从事海洋微生物资源利用研究。E-mail:zhangfuyun2002@ aliyun． com． cn
江蓠内生真菌 NSS1 蛋白活性的初步研究
王维才， 张付云* ， 刘 晔， 卢 航， 李 振， 赵 宇
大连海洋大学食品科学与工程学院，辽宁 大连 116023
摘 要:为促进江蓠内生真菌 NSS1 抗菌蛋白的应用研究，利用硫酸铵沉淀法制备抗菌蛋白，最佳硫酸铵饱和度为 65%。
采用滤纸片法检测其对细菌指示菌的抑菌活性，抗菌粗蛋白均能抑制五种细菌指示菌的生长，当浓度达到 750 μg /mL
时，抑制效果最好。采用邻苯三酚自氧化法测定蛋白对超氧阴离子自由基(O －2 )的清除作用，MTT法检测蛋白对肿瘤细
胞的影响。抗菌蛋白在 100℃以下，pH中性时抑菌活性稳定，对紫外线照射不敏感，丙三醇、甲醇和胰蛋白酶对抗菌蛋白
的抑菌活性没有影响。不同浓度的蛋白液对超氧阴离子均有清除效果。当蛋白浓度达到 360 μg /mL时对肿瘤细胞的抑
瘤作用最强。上述结果显示抗菌蛋白具有较强的抑菌活性、抗氧化活性和抗肿瘤活性。
关键词:内生真菌;抗菌蛋白;抑菌活性;抗氧化活性;抗肿瘤活性
DOI:10． 3969 / j． issn． 2095-2341． 2014． 02． 09
Antimicrobial Activity of Protein from Gracilaria Endophytic Fungi NSS1
WANG Wei-cai，ZHANG Fu-yun* ，LIU Ye，LU Hang，LI Zhen，ZHAO Yu
College of Food Science and Engineering，Dalian Ocean University，Liaoning Dalian 116023，China
Abstract:Inorder to study antimicrobail activity of protein from Gracilaria endophytic fungi NSS1，the antimicrobial protein was
prepared by ammonium sulfate precipitation，the best ammonium sulfate saturation was 65% ． Antibacterial activity to bacterial
indicator was detected by filter paper method，the results showed that the antibacterial crude protein could inhibit the growth of
five indicator bacteria，and the best inhibitory effect was obtained when the protein concentration reached 750 μg /mL． The
scavenging effect of superoxide anion free radical (O －2 )from protein was detected by the pyrogallol autoxidation method． The
effect of protein on tumor cells was detected by the MTT method． The antibacterial activity was stable under the condition of below
100℃ and neutral pH． The activity of protein was not sensitive to UV irradiation，glycerol，methanol and trypsin． Different
concentrations of protein solution all had effect on removing superoxide anion． It had the strongest inhibitory effect on tumor cells，
when the protein concentration was 360 μg /mL． Above results indicated that the antibacterial protein had strong antibacterial
activity，antioxidant activity and antitumor activity．
Key words:endophytic fungi;antimicrobial protein;antimicrobial activity;antioxidant activity;antitumor activity
植物内生真菌(endophytic fungi)是指一定阶
段或全部阶段生活于健康植物的组织和器官内部
的真菌［1］。普遍存在于高等植物中，草本植物、
单子叶植物和双子叶植物内均有内生真菌。植物
内生真菌目前已作为生物防治中有潜力的微生物
农药、增产菌或作为潜在的生防载体菌而加以利
用。研究表明，植物内生真菌可以产生具有多种
生物活性的代谢产物［2 ～ 5］，有些具有一定的抗氧
化活性和抗肿瘤活性，在医药业中具有重要的应
用价值。
江蓠作为多年生的大型红藻，其内生真菌产
生的生物活性物质种类繁多［6，7］，但目前国内外
对江蓠内生真菌的研究报道较少。本实验室从江
蓠中筛选出的拮抗菌 NSS1，对从该菌中提取的粗
蛋白的活性进行了初步研究，系统分析了粗蛋白
的抗菌活性和生物稳定性，进而测定了抗菌蛋白
的抗氧化性和抗肿瘤活性，为抗菌蛋白的分离纯
化、农业发展应用和医学应用提供理论依据。
1 材料与方法
1． 1 实验材料
江蓠内生真菌 NSS1由本实验室分离［8］。指示
菌株有金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠
杆菌(Escherichia coli)、产气肠杆菌(Enterobacter
aerogenes)、变形杆菌(Proteus vulgaris)、枯草芽胞杆
菌(Bacillus subtilis) ，均为本实验室保存。
1． 2 培养基
牛肉膏蛋白胨培养基:牛肉膏 0． 3%，蛋白胨
1%，NaCl 0． 5%，蒸馏水，琼脂 1． 5%，pH 7． 2 ～
7. 4，用于细菌培养。
沙氏培养基:蛋白胨 1%，葡萄糖 4%，琼脂
1. 8%，pH 7． 0 ～ 7． 2，用于真菌培养。
1． 3 试剂
硫酸铵、盐酸、氢氧化钠、甲醇、丙三醇、异丙
醇、丙酮、三氯甲烷、正丁醇、石油醚、胰蛋白酶、蛋
白酶 K、邻苯三酚、抗坏血酸等试剂均为分析纯，
购自安泰生物工程股份有限公司。青霉素、链霉
素、小牛血清、神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y P7) ，
由中国科学院大连化学物理研究所 1810 组提供。
1． 4 仪器与设备
无菌操作台，上海跃进医疗器械厂;恒温培养
箱，上海跃进医疗器械厂;紫外分光光度计，大龙
医疗设备(上海)有限公司;酶标仪，上海科学精
密仪器有限公司。
1． 5 方法
1． 5． 1 真菌培养 接种已分离纯化的 NSS1 菌
株于含有 500 mL沙氏液体培养基的锥形三角瓶
中，28℃、180 r /min 振荡培养 3 d，取发酵菌液，4
000 r /min，离心 10 min，去菌体，收集发酵上清液，
为待测样液。
1． 5． 2 抗菌蛋白制备 利用硫酸铵沉淀法制备
抗菌蛋白。取 100 mL已制备好的发酵上清液，在
其中加入硫酸铵至 65%饱和度，4℃沉淀 18 ～24 h，
9 000 r /min 离心 30 min，弃上清，收集沉淀。将
沉淀用磷酸缓冲液溶解，于透析袋(截留分子量
为 3． 5 kDa)中 4℃透析 3 d，每天换水 3 次。将透
析袋中截留溶液冷冻干燥，得到粗蛋白。
1． 5． 3 抗菌蛋白抑菌活性测定 将得到的粗蛋
白溶解于无菌水中，浓度分别为 50 μg /mL、100
μg /mL、250 μg /mL、500 μg /mL、750 μg /mL、
1 000 μg /mL 和 2 000 μg /mL，然后利用滤纸片
法［9］测定蛋白的抑菌活性。
1．5．4 最佳硫酸铵饱和度 取等量的发酵液，分别
加入硫酸铵至 55%、60%、65%、70%、75%、80%、
85%和 90%饱和度，采用硫酸铵沉淀法对微生物所
产生的蛋白质进行提取。将得到的粗蛋白配制成抑
菌活性的最佳浓度进行抑菌活性检测。
1． 5． 5 抗菌蛋白稳定性测定 ①温度稳定性:将
得到的抗菌蛋白用无菌水配制成 750 μg /mL 的
蛋白溶液。抗菌蛋白各取 800 μL，分别置于 4℃、
20℃、40℃、60℃、80℃、100℃ 和 121℃ 条件下
30 min，进行抑菌试验，测量抑菌圈直径。
②pH 稳定性:将抗菌蛋白分别用 HCl 和
NaOH 调至不同 pH(pH 1、pH 3、pH 5、pH 7、
pH 9、pH11 和 pH 13) ，4℃放置过夜，抗菌蛋白各
取 400 μL进行抑菌试验，测量抑菌圈直径。
③有机试剂稳定性:在 400 μL抗菌蛋白溶液
中分别加入等体积的甲醇、丙三醇、异丙醇、丙酮、
三氯甲烷、正丁醇和石油醚，充分混匀过夜后，通
过离心或蒸发去除有机试剂。然后将进行抑菌试
验，测量抑菌圈直径。
④紫外照射稳定性:将抗菌蛋白溶液放置在
20 W紫外灯下距离 10 cm 处分别照射 0 h、2 h、
4 h、6 h、8 h、10 h 和 12 h 后进行抑菌试验，测量
抑菌圈直径。
⑤蛋白酶稳定性:将等体积的抗菌蛋白液分
别与胰蛋白酶、蛋白酶 K 溶液混合，在恒温 37℃
下反应 1 h，沸水浴(约 96℃)终止蛋白酶活性，
10 000 r /min离心 1 min，进行抑菌试验，测量抑
菌圈直径。
1． 4． 6 抗氧化活性检测 采用邻苯三酚自氧化
法［10］对超氧阴离子自由基(O －2 )清除作用的测
定。在洁净的试管中依次加入 50 mmol /L Tris-
HCl缓冲溶液(pH 8． 2)5 mL、待测液 0． 25 mL、
3 mmol /L邻苯三酚 0． 1 mL，迅速混匀，以培养基
做空白对照，5 mg /mL抗坏血酸为阳性对照，25℃
反应15 min，在 320 nm处测定吸光值。
清除率的计算公式为:
清除率 S(%)=［A0 －(Ai －Aj)］/A0 ×100%
式中，A0 为试剂空白的吸光度值(Tris-HCl +培养基
521王维才，等:江蓠内生真菌 NSS1 蛋白活性的初步研究
+邻苯三酚) ;Ai 为样液的吸光度值(Tris-HCl +待测液 +
邻苯三酚) ;Aj 为未加邻苯三酚待测液吸光度(Tris-HCl +
样品液)。
1． 4． 7 蛋白抗肿瘤活性 实验分为空白对照组
(未经试样处理的细胞悬液)和实验组(加入不同
浓度的蛋白溶液) ，蛋白浓度梯度为 10 μg /mL、
30 μg /mL、90 μg /mL、180 μg /mL 和 360 μg /mL，
每个浓度做 5 个复孔。用 MTT 法［11］检测蛋白对
肿瘤细胞的影响。
2 结果与分析
2． 1 抗菌蛋白的抑菌活性
采用滤纸片法测定抗菌蛋白对五种细菌指示
菌的抑制情况，结果表明抗菌蛋白能够抑制全部
五种细菌指示菌的生长，但抑菌活性存在差异，对
枯草芽胞杆菌的抑制效果最强，其次为变形杆菌，
对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、产气杆菌也具有一
定的抑制作用(表 1)。
表 1 抗菌蛋白的抑菌作用
Table 1 Inhibition of antibacterial protin to
different pathogens．
细菌指示菌 抑菌圈直径 (mm)
枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis) + + + +
大肠杆菌(Escherichia coli) +
产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes) +
变形杆菌(Proteus vulgaris) + + +
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) +
注:+:d≤8 mm;+ +:8 mm ＜ d≤9 mm;+ + +:9 mm ＜ d≤10
mm;+ + + +:d ＞ 10 mm
2． 2 抗菌蛋白抑菌活性的最佳浓度
用不同浓度的抗菌蛋白对枯草芽胞杆菌进行
抑菌活性测定，结果发现抑菌活性随抗菌蛋白浓
度的 升 高 而 提 高，当 抗 菌 蛋 白 浓 度 达 到
750 μg /mL时，抑制效果达到最佳，当浓度超过
750 μg /mL 时，抑菌活性随着浓度增加而降低
(图 1)。
图 1 不同浓度抗菌蛋白的抑菌作用
Fig． 1 The antimicrobial effect of different concentration of the protein．
2． 3 最佳硫酸铵饱和度
分别对硫酸铵饱和度 55%、60%、65%、
70%、75%、80%、85%和 90%的蛋白沉淀物进行
活性检测。当硫酸铵饱和度达到 65%时，蛋白对
枯草芽胞杆菌的抑制活性达到最高(图 2) ，且抑
菌活性随着硫酸铵饱和度的增加而降低，由此确
定，沉淀抗菌蛋白的最佳硫酸铵饱和度为 65%。
2． 4 抗菌蛋白稳定性的测定
2． 4． 1 温度和 pH 对抗菌蛋白抑菌活性的影响
分别考察4 ～121℃处理 30 min和 pH 1 ～13
条件下抑菌蛋白的抑菌活性，结果见图3。当抗
图 2 不同饱和度的硫酸铵盐析对抗菌蛋白
抑菌活性的影响
Fig． 2 Effect of different saturation of ammonium sulfate
on the antibacterial activity of antibacterial protein．
621 生物技术进展 Current Biotechnology
菌蛋白经过低于 100℃的温度处理后，抑菌活性
没有发生明显改变;经 100℃ 处理后，抑菌活性略
有下降;经 121℃处理后，抗菌蛋白几乎失去抑菌
活性。pH 7 时，蛋白液有着良好抑菌性，在 pH 5
和 pH 9 时，抑菌活性显著下降，在 pH 1 或 pH 13
时，抗菌蛋白的抑菌活性完全丧失(图 3)。说明
抗菌蛋白可以耐受的 pH 范围较窄，在中性条件
下稳定，但在酸性或碱性条件下不稳定。
图 3 温度和 pH对抗菌蛋白抑菌活性的影响
Fig． 3 Effect of different temperature and pH on inhibition
actitity of antifungal protein．
2． 4． 2 有机试剂对抗菌蛋白抑菌活性的影响
对用不同有机试剂处理后的蛋白液进行抑菌
活性检测，实验结果表明，丙三醇和甲醇对抑菌蛋
白的抑菌活性几乎无影响，正丁醇和石油醚对抑
菌蛋白的抑菌活性影响较大，其余有机溶剂都使
抑菌蛋白的抑菌活性有所下降，但幅度不大。
2． 4． 3 紫外照射对抗菌蛋白抑菌活性的影响
抗菌蛋白经过不同时间的紫外线照射处理
后，进行抑菌活性检测，实验结果表明，抑菌活性
有上下起伏，但变化不大，说明紫外线照射对抗菌
蛋白抑菌活性的影响不大。
2． 4． 4 蛋白酶对抗菌蛋白抑菌活性的影响 对被
不同蛋白酶处理过的蛋白液进行抑菌活性检测，
实验结果表明，胰蛋白酶可降低抑菌蛋白的抑菌
活性，但降低幅度不大。抑菌蛋白对蛋白酶 K 的
稳定性较差，其对枯草芽胞杆菌的抑菌活性完全
丧失。
2． 5 抗菌蛋白的抗氧化活性
通过抗氧化活性检测结果表明，测得的不同浓
度的蛋白液对超氧阴离子均有清除效果(如图 4)，
随着浓度的增加，清除效果也随之增加。当浓度达
到 1 000 μg /mL时，清除率能达到 53． 7%。
图 4 抗菌蛋白抗氧化活性结果
Fig． 4 The antioxidant activity of antibacterial protein．
2． 6 抗菌蛋白的抗肿瘤活性
结果表明(如图 5) ，来源于 NSS1 的抗菌蛋白
的不同剂量对 SH-SY5Y P7 有较强的抑制活性，
且该蛋白对 SH-SY5Y P7 的抑制作用随剂量的增
加而增强，呈明显的剂量效应关系。当浓度达到
360 μg /mL时，抑瘤率最高达到 59． 07%。
图 5 抑菌蛋白对神经母细胞瘤细胞
SH-SY5Y P7 抑制活性
Fig． 5 Inhibitory activity of antibacterial protein
on neuroblastoma cells SH-SY5Y P7．
3 讨论
植物内生真菌因能产生多种抗菌物质成为植
物病害生物防治的重要生防菌株［12］。目前，对于
植物内生真菌产生抗菌物质的报道较多，郑忠辉
等［13］从江蓠中分离出的 5 株附生微生物的代谢
产物对枯草芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌和霍乱弧菌
有较好的抑制作用，对金黄色葡萄球菌有一定的
抑制作用。本文报道的江蓠内生真菌 NSS1 产生
的抗菌蛋白对 5 种细菌病原菌有较好的抑制作
用，其中对枯草芽胞杆菌的抑制作用最强。
抗氧化剂因能帮助祛除自由基对人体的损害
而引起重视，目前对藻类抗氧化的研究多集中在
721王维才，等:江蓠内生真菌 NSS1 蛋白活性的初步研究
多糖类，但是微生物抗氧化也有很大的潜力［14］。
随着动植物抗肿瘤资源的深入开发，从其中发现
新的抗肿瘤物质已经逐渐减慢，而微生物作为抗
肿瘤新的研究方向已经得到重视，王建锋［15］对
172 株内生真菌采用细胞毒筛选模型(MTT法)对
这些内生真菌发酵液的抗肿瘤活性进行了检测，
结果表明，共有 25 株内生真菌的发酵液对 KB 有
明显的抑制作用。本文报道的江蓠内生真菌
NSS1 产生的蛋白对超氧阴离子自由基(O －2 )清除
率能达到 50%以上，而且具有较强的抑瘤作用，
当浓度达到 360 μg /mL时，抑瘤率高达 59． 07%。
同时该抗菌蛋白具有很强的耐热性，抗紫外线照
射，而且对各种有机溶剂具有较好的稳定性。这
些性质表明该抗菌蛋白在较恶劣的环境下，稳定
性好、活性高，因此该抗菌蛋白具有良好的应用前
景，可进一步开发应用。
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