全 文 ：凹顶藻萜类化合物抑瘤活性及其对免疫作用的研究■＊
梁惠1 , 3 , 贺娟2 ,张士璀1 , 董春景3 , 马爱国3
(1.中国海洋大学生命学院 ,山东 青岛 , 266003;2.青岛大学医学院附属医院 , 山东 青岛 266003;
3.青岛大学医学院 , 山东 青岛 266021)
摘　要:目的 通过对接种 S180肉瘤细胞株小鼠灌胃给予不同剂量凹顶藻萜类化合物 , 观察其抑瘤和免疫调
节作用。方法 1、以反相高效液相色谱法测定凹顶藻萜类化合物中总萜的含量 , 并采用 H orn 法检测其毒性
(LD50)。2 、用 S180荷瘤鼠体内实验模型进行萜类化合物的抗肿瘤评价 ,分别测定抑瘤率 、胸腺指数 、脾指数 、
脾淋巴细胞增殖活性(M TT)、免疫球蛋白 IgA 、IgG 、IgM 等指标;应用软件 SPSS11.5 进行数据处理。结果
总萜含量的测定结果显示萜类化合物中总萜含量为 63.29%。凹顶藻萜类化合物 LD50 >3160mg · kg -1 , 属
于低毒。萜类化合物组表现出较高的抑瘤率 ,升高胸腺指数和脾指数 , 促进脾淋巴细胞增殖 ,并提高血 IgA、
IgG 、IgM 含量。结论 凹顶藻含丰富的天然萜类化合物 , 且使用安全。凹顶藻萜类化合物可有效抑制 S180肉
瘤的生长 ,促进荷瘤鼠胸腺和脾脏的生长发育 , 可通过全面提高动物的细胞免疫和体液免疫功能来达到控制
和杀灭肿瘤细胞的目的。
关键词:凹顶藻;萜类化合物;抑瘤活性;MT T ;免疫作用
中图分类号:Q949.29 +3.6　R931.711　文献标识码:A　文章编号:1002-3461(2005)01-0006-04
Antitumor activities and its immunologic functions of Lauren-
cia terpenoids
LIANG Hui
1 , 3 , HE Juan2 ,ZHANG Shi-cui1 ,DONG Chun-jing3 , MA Ai-guo3
(1.College of Marine Li f e Science , Ocean Universi ty of China , Qing dao 266003 , China;
2.The A f f i l iated Hospi tal of Medical College , Qing dao University , Qingdao 266003 ,
China;3.College o f Medicine ,Qingdao Universi ty , Qingdao 266012 ,China)
Abstract:Objective To investig ate the antitumor and immunologic activit ies of Laurencia ex-
t ract(LET)in Sarcoma 180(S180).Methods The content of to tal terpenoids in LET w as detec-
ted by RP-HPLC and i ts to xici ty(LD50)was estimated by Horn assay.Tumor inhibi tion
rates , index of thymus and spleen , proliferat ion o f spleen lymph cells , IgA , IgG , IgM were
detected.The data w ere analyzed by SPSS sof tw are.Results The content of to tal terpenoids
in LET w as proved to be 63.29%.LET show ed low toxicity wi th i t s LD 50 more than 3160mg
·kg-1 .Tumor inhibition rates o f test g roups w ere significantly higher than tho se of the
control g roup.LET could obviously increase the levels of index of thymus and spleen.LET
increase the multiplication of spleen lymph cell.Concentrations o f IgA 、IgG and IgM in plas-
ma of the test groups w ere higher than tho se of the control g roup.Conclusion LET rich in
terpenoids is safety to be taken orally.The alg a ex tract show ed obvious anti tumo r activit ies
and immunologic functions.
Key words:Laurencia;terpenoid;anti tumo r activity;M TT ;immunologic function
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Chin J Mar Drugs , 2005 February , Vol.24 No.1 中国海洋药物杂志 2005年 2 月第 24 卷第 1 期
＊ ■山东省卫生厅资助项目(2001CAICBA5)
　　随着海洋药物研究的深入 ,发现许多海
洋生物体内存在的各种抗肿瘤生物活性物
质 ,不仅显示强力的细胞毒作用 ,尚有多种生
物学功能 ,诸如免疫增强或抑制 、细胞诱导分
化 、离子通道激活等作用 , 且具有作用浓度
小 、毒副作用低等特点 ,已成为天然产物研究
的主要目标。其中 ,萜类化合物因其结构独
特 、生物活性强 ,很久以来引起人们的广泛关
注[ 1] 。近十几年来 ,仅从凹顶藻属中就分离
出 400多种萜类化合物 ,代表着 26种类型结
构骨架 ,是海洋萜类化合物的重要来源。本
文从三列凹顶藻中提取了天然萜类化合物 ,
并进行了安全性和抗肿瘤实验研究 。
1　材料
1.1 　三列凹顶 藻(Laurencia tristicha
Tseng ,Chang ,E.Z.et.B.M .Xia)属红藻门
(Rhodophy ta)红藻纲(Rhodophyceae),仙菜
目(Ceramiales),仙菜科(Cermiaceae),凹顶
藻属(Laurencia),由中国科学院海洋研究所
提供并鉴定。
1.2　瘤株
小鼠 S180实体瘤 ,中国医学科学院药物
研究所引进 ,山东医学科学院药物研究所药
理室低温冻存保种 ,复苏后传代 5 、6 、7代的
细胞悬液 。
1.3　实验动物
青岛市实验动物中心提供昆明小鼠 ,动
物合格证号:鲁动质字 D2002009号 。雌雄
各半 ,体重 18 ～ 23g ,随机分组。
2　方法
2.1　凹顶藻萜类化合物制备
凹顶藻干品约 5kg ,粉碎过筛;95%乙醇
提取 3次 ,合并得浸膏 325g ;用约 10倍量的
水混悬浸膏 ,醋酸乙酯萃取;减压蒸干。
2.2　凹顶藻萜类化合物中总萜含量的测
定[ 2 ～ 4]
2.2.1　仪器与试剂
反相高效液相色谱仪(Beckman公司),
配二极管阵列检测器 ,用 Gold软件控制仪器
操作数据采集(美国 Beckman 公司);Terpi-
noel标准品(Sigma公司);甲醇为优级纯;去
离子水。
2.2.2　色谱条件
色谱柱:Beckman C18柱(25cm×4.6mm
i.d., 5μm)和 Beckman预保护柱(4.5cm ×
4.6mm i.d., 5μm)。流动相为甲醇∶水=
55∶45 , 流速为 1.0ml · min-1 , 检测波长
242nm ,检测灵敏度 0.05AUFS 。
2.2.3　样品处理和测定
准确称取凹顶藻萜类化合物 0.775g ,置
于 5mL 容量瓶中 ,甲醇定容至刻度 ,在 4℃、
3000r · min-1 离心 5min , 取上清液进行
HPLC分析。根据 Terpinoel标准品定性定
量测得凹顶藻萜类化合物中总萜含量为
63.29%。
2.3 　半数致死量(LD50)的测定(Horn
法)[ 5]
20只昆明小鼠 , 随机分成 4组 ,每组雌
性 3只 ,雄性 2只 ,分笼 ,适应性饲养 3 d;第
四天给药前禁食 16 h , 饮水不限 , 分别以
3160 ,1000 , 316 , 100mg · kg -1剂量灌胃 ,观
察 14 d ,记录出现症状及死亡情况 。
2.4　凹顶藻萜类化合物抑瘤作用及机制分析
2.4.1　小鼠 S180瘤细胞悬液制备[ 6]
选取接种 S180实体瘤 7 ～ 8d后生长良好
的小鼠 ,处死 ,抽取腹水瘤细胞 ,用生理盐水
洗涤离心 2次 ,换用 RPM I-l640培养液再洗
1次;将肿瘤细胞悬液放入含 10%小牛血清 、
青霉素 100U · mL-1的 RPM I-l640 培养液
中 ,稀释成最终浓度 104 ～ 107个 ·mL-1的单
细胞悬液 。台盼蓝(T rypanblue)染色检查活
细胞数 ,成活率 95%以上即可接种。
2.4.2　昆明小鼠 50只 ,雌雄各半 ,分笼喂
养 ,每只于左前肢腋窝皮下接种 0.2mL S1 80
瘤细胞悬液 ,整个操作过程 30min 内完成;
24 h后随机分为 5 组 , 10 只/组 ,雌雄各半 ,
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中国海洋药物杂志 2005 年 2月第 24 卷第 1期 Chin J Mar Drugs , 2005 February , Vol.24 No.1
分笼喂养;受试组灌服凹顶藻萜类化合物色
拉油稀释液 ,剂量分别为 25 , 50 , 100 mg ·
kg -1 ,阳性对照组腹腔注射环磷酰胺 20 mg
·kg-1 ,空白对照组灌服等量大豆色拉油。
每日 1 次 ,连续 10d ,隔天称体重 ,观察小鼠
生长情况 。
2.4.3　检测指标
2.4.3.1　血样采集 末次给药 24h 后 ,将小
鼠称重 ,眼眶取血置于 1mL 肝素抗凝的玻璃
试管中 ,混匀 , 3000r ·min-1离心 10min ,收
集上层无溶血的血浆于 EP 管中 ,-20℃冰箱
中保存备用 ,1周内测定。
2.4.3.2　抑瘤率　抑瘤率(%)=(对照组平
均瘤重-实验组平均瘤重)/对照组平均瘤重
×100%
2.4.3.3　胸腺 、脾脏指数　脏器指数=(脏
器重量/体重)×10
2.4.3.4 　脾淋巴细胞增殖活性的测定
(MTT 法):无菌取脾于 PBS 中 ,制成单细胞
悬液;台盼蓝染色计活细胞数(95%以上),调
整细胞浓度为 2×10 6个 ·mL-1 ;加入 24孔
培养板 ,每孔 1.0mL ,一孔加 50μL 刀豆蛋白
A (5μg · mL-1),另一孔作为对照 , 37℃培
养 68h;每孔吸去上清液 0.7mL ,加入0.7mL
不含小牛血清的 RPM I-1640培养液和 MT T
50μL(5mg ·mL-1),继续培养 4h;然后加入
酸性异丙醇 1mL , 吹打均匀 , 使紫色结晶
(Fo rmazane)完全溶解 ,分装到 96 孔板 ,酶
标仪 570nm处测定 A值[ 7] 。
2.4.3.5　血清免疫球蛋白 IgA 、IgG 、IgM 含
量的测定:采用日本 Olympus400 全自动生
化分析仪 ,试剂盒由南京建成生物工程研究
所提供。
3　结　果
3.1　LD50实验结果显示:小鼠灌胃凹顶藻萜
类化合物经 14d观察未见任何中毒症状 ,无动
物死亡。其 LD50 >3160mg ·kg-1 ,属低毒[ 8] 。
3.2　凹顶藻萜类化合物对小鼠 S180肉瘤生
长的影响
萜类化合物各个剂量组的平均瘤重明显
低于空白对照组 ,差异显著 ,其中 ,高剂量组
的抑瘤率达 39.1%(见表 1)。
表 1　凹顶藻萜类化合物对小鼠 S180肉瘤生长的
影响( x±s)
分　组　 动物数 瘤重(g) 抑瘤率(%)
空白对照组 9 1.576±0.879
低剂量组 8 1.023±0.591＊ 35.1
中剂量组 8 1.150±0.950＊ 27.0
高剂量组 6 0.959±0.415＊＊ 39.1
阳性对照组 7 0.684±0.561＊＊ 56.6
注:＊P<0.05 , ＊＊P<0.01 vs 空白对照组
3.3　胸腺指数 、脾指数
低剂量组的胸腺指数上升 ,与空白对照
组有显著性差异 ,提示萜类化合物可促进胸
腺的生长发育 ,缓解荷瘤小鼠所引起的胸腺
抑制作用 。高剂量组的脾指数高于空白对照
组 ,有显著性差异 ,提示萜类化合物可能具有
促进荷瘤鼠脾脏的功能(见表 2)。
表 2 凹顶藻萜类化合物对荷 S180肉瘤小鼠
脏器指数的影响( x±s)
分　组　 动物数 胸腺指数 脾指数
空白对照组 9 0.0195±0.0038 0.0480±0.0064
低剂量组 8 0.0231±0.0052＊ 0.0358±0.0056
中剂量组 8 0.0163±0.0024 0.0417±0.0085
高剂量组 6 0.0158±0.0033 0.0520±0.0145＊
阳性对照组 7 0.0096±0.0024＊ 0.0471±0.0082
注:＊P<0.05 vs空白对照组
3.4　淋巴细胞增殖实验
萜类化合物低 、中 、高剂量组的脾淋巴细
胞增殖率与空白对照组相比升高 ,且差异有
显著性 ,说明萜类化合物对荷瘤鼠脾淋巴细
胞的增殖有显著促进作用 。且随剂量增加其
脾淋巴细胞增殖率有增高的趋势(见表 3)。
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Chin J Mar Drugs , 2005 February , Vol.24 No.1 中国海洋药物杂志 2005年 2 月第 24 卷第 1 期
表 3　凹顶藻萜类化合物对荷 S180肉瘤小鼠脾
淋巴细胞增殖的影响( x±s)
分　组 　　 动物数 A 值
空白对照组 9 0.0159±0.0163
低剂量组 8 0.0264±0.0292＊
中剂量组 8 0.0297±0.0312＊
高剂量组 6 0.0678±0.1026＊
阳性对照组 7 0.0143±0.0138
注:＊P<0.05 vs空白对照组
3.5　血清 IgA , IgG , IgM 含量
萜类化合物高剂量组的血清 IgA 含量
较空白对照组相比增高 ,且差异有显著性。
说明高剂量萜类化合物可提高荷瘤鼠的血清
IgA含量。萜类化合物中 、高剂量组的血清
IgG和血清 IgM 含量较空白对照组增高 ,且
差异有显著性 。说明中 、高剂量萜类化合物
可显著提高荷瘤鼠的血清 IgG 和 IgM 含量
(见表 4)。
表 4 凹顶藻萜类化合物对荷 S180肉瘤
小鼠血清 IgA , IgG , IgM 含量的影响( x±s)
分组 n IgA(g ·L-1) IgG(g ·L-1) IgM(g·L -1)
空白对照组 9 0.123±0.0126 0.630±0.138 0.526±0.353
低剂量组 8 0.102±0.043 0.645±0.302 0.660±0.313
中剂量组 8 0.120±0.0110 0.892±0.157＊0.749±0.181＊
高剂量组 6 0.130±0.0255＊0.982±0.161＊ 0.873±0.170＊
阳性对照组 7 0.050±0.0707＊0.245±0.346＊ 0.355±0.501＊
注:＊P<0.05 v s空白对照组
4　讨　论
萜类化合物各个剂量组的平均瘤重明显
低于空白对照组 ,抑瘤率达 39.1%, 表明凹
顶藻萜类化合物具有较好的抑瘤作用。
现代医学应用肿瘤免疫疗法能调整患者
的免疫功能 ,防止化疗对免疫系统的损伤 ,但
在大剂量使用时也面临不良反应的问题[ 9] ,海
藻作为天然植物 、毒性低 ,副作用小 ,萜类化合
物灌胃的小鼠经 14 d观察未见任何中毒症
状 ,其 LD50值>3160mg ·kg-1 ,属于低毒。
应用凹顶藻萜类化合物后 ,小鼠的胸腺
和脾指数显著增加 ,可能为引起免疫器官活
性细胞发生增生反应(10) ,由此有效地改善了
动物因荷瘤而导致的非特异性免疫功能低下
状况 。
本实验用刀豆蛋白 A 刺激的 T 淋巴细
胞转化实验(即 M TT 实验)来推测荷瘤鼠 T
淋巴细胞的特异性转化增殖功能 ,可间接反
映细胞免疫功能的强弱。结果显示凹顶藻萜
类化合物对荷瘤鼠脾淋巴细胞的增殖有显著
促进作用 。
应用凹顶藻萜类化合物后 ,荷瘤鼠的血
清 IgA , IgG和 IgM 含量升高 ,提示萜类化合
物能够改善小鼠荷瘤所诱导的体液免疫功能
低下 ,增强巨噬细胞的吞噬能力和提高了血
清抗体效价 ,从而增强了体液免疫功能 。
凹顶藻萜类化合物可显著抑制肿瘤的增
生 ,且不伴有明显的毒副作用 ,还能治疗或预
防肿瘤化疗和放疗过程中对正常细胞的损
伤。显然 ,这种双重作用有利于肿瘤病人的
综合治疗和康复 ,因此 ,凹顶藻萜类化合物作
为一种新型抗肿瘤活性产物 ,具有广阔的应
用前景。
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中国海洋药物杂志 2005 年 2月第 24 卷第 1期 Chin J Mar Drugs , 2005 February , Vol.24 No.1