全 文 ：论 著
癌变 畸变 突变
CARCINOGENESIS , TERATOGENESIS ＆ MUTAGENESIS
Vol.22 No.61 O Nov.
收稿日期:2010-05-31;修订日期:2010-10-06基金项目:国家自然科学基金 (8107255), 河北省自然科学基金 (08B032 ,
C2010000489),河北省留学回国人员科技活动项目(2006-02)作者简介:陈进军(1960- ),男 , 河北人 ,硕士 , 主任医师 , 研究方向:肝脏恶性肿瘤的基础与临床。＊Correspondence to:DONG Mei , E-mail:meimeidong11@126.com;SHI
Qing_wen , E-mail:shiqing_w@163.com
土木香根中 5种
倍半萜化合物抗
肝癌活性的研究
陈进军 1/赵 路 2/董 玫 3 , ＊/王思明 4/
秦琪瑜 1/陈 虎 1/史清文 3 , ＊
(1.河北医科大学第一医院肝胆外科 , 石家庄
050031;2.北京军区 66010部队卫生队 , 石家庄
050061;3.河北医科大学基础医学院法医学系 ,
河北省法医学重点实验室 , 石家庄 050017;4.
河北医科大学药学院 ,石家庄 050017)
Anti_human hepatoma activity
of five sesquiterpenoids
from Inula helenium
CHEN Jin_jun1 , ZHAO Lu2 , DONG Mei 3 , ＊, WANG Si_ming4 ,
QIN Qi_yu1 , CHEN Hu1 , SHI Qing_wen3 , ＊
(1 .The First Affiliated Hospital of Hebei Medical University ,
Shijiazhuang 050031 ;2.Beijing Military Command , No.66010
Health Team of PLA , Shijiazhuang 050061;3.Department of
Forensic Medicine , Hebei Medical University , Hebei Key Laboratory
of Forensic Medicine , Shijiazhuang 050017;4.School of
Pharmaceutical Sciences , Hebei Medical University ,
Shijiazhuang 050017 , China)
【摘要】目的:检测菊科植物土木香中分离出的 5种倍半萜类化合物对肝肿瘤活性的影响 , 探讨这 5种倍半萜类化合物结构与活
性之间的关系以及可能的作用机制 。 方法:利用噻唑蓝(MTT)比色法检测 5种倍半萜类化合物对人肝肿瘤细胞增殖活性的影响;以
移植性小鼠肝肿瘤 H22为模型 , 检测异土木香内酯对昆明小鼠在体肿瘤生长以及机体免疫能力的影响;以体外培养的人胚肺成纤维
细胞为模型 ,评价异土木香内酯对正常细胞的毒性 。 结果:异土木香内酯对人肝肿瘤细胞(HLE)的增殖显示较强的抑制活性;其余 4
种化合物对 HLE的增殖不显示抑制活性;异土木香内酯对小鼠移植性肝肿瘤 H22体内生长具有较强的抑制活性 , 但对荷瘤小鼠胸腺
指数和脾指数的影响与对照组相比差异均无统计学意义 (P> 0.05);异土木香内酯对体外培养的人胚肺成纤维细胞显示较弱的毒
性 。 结论:异土木香内酯具有较强的抗肝癌活性;其它 4种倍半萜类化合物抑制活性的丧失可能是由于化合物中五元内酯环的环外
双键饱和所致 ,或 A 、 B环的 C5_C10键断开生成十元大环所致;增加机体免疫能力可能是异土木香内酯抗肝肿瘤的作用机制之一 。
【关键词】土木香;倍半萜类化合物;人肝肿瘤细胞;增殖抑制活性;构_效关系
中图分类号:R730.1 文献标识码:A 文章编号:1004-616X(2010)06-0440-04
【ABSTRACT】 OBJECTIVE:To assess the anti_human hepatoma effects of five sesquiterpene lactones from the roots of
Inula helenium , and to explore the relationship between structure and activi ty and the possible mechanism of antitumor
action.METHODS:Using MTT assay to evaluate the antitumor activities of five sesquiterpene lactones on the human
hepatoma cell line HLE , and to explore the cytotoxicity on human embryonic lung cells.The rate of cell proliferation
was determined by grafted tumor assay in vivo.RESULTS:Isoalantolactone exhibited significant anti_proliferative activities
to hepatoma cell , while other compounds demonstrated weak anti_proliferative activities.Isoalantolactone significantly
inhibited tumor growth of H22 tumor_bearing mice.Isoalantolactone showed no toxicity to human embryonic lung cell line
in vitro.CONCLUSION:These results clearly demonstrated that the anti_tumor activities had close relationship with the
structures , β_unsaturated five_membered lactone ring was necessary for the activities.When β_unsaturated five_membered
lactone become saturated or the bond between C_5 and C_10 of ring_A and ring_B broken to form a 10_membered
macroring , anti_proliferative activity was either diminished or lost.
【KEY WORDS】 inula helenium;sesquiterpenes;human hepatoma cell line;anti_proliferative activi ty;structure_activity
relationship
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癌变 畸变 突变
CARCINOGENESIS , TERATOGENESIS ＆ MUTAGENESIS
第 22卷 第 6期 1O 11月
土木香(inula helenium)系菊科旋覆花属植物 , 为多
年生草本 ,是入药历史悠久 、应用广泛的传统中药 , 具有
健胃 、利尿 、祛痰和驱虫等功效 [1]。研究表明土木香提取
物土木香内酯类成分具有抗肿瘤 、抗炎和抗真菌等多种
生物活性[ 2-3]。本课题主要研究从土木香根中分离纯化
的 5种倍半萜内酯化合物对人肝肿瘤细胞增殖活性的影
响 , 探讨了这 5种倍半萜内酯化合物结构与活性之间的
关系 ,为临床更好地开发利用土木香提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 受试物
5种倍半萜类化合物 :异土木香内酯(isoalanto_
lactone);2_羟基_11 , 13_二氢异土木香内酯(2_hydroxy_11 ,
13_dihydroisoalantolactone);11 , 13_二氢异土木香内酯(11 ,
13_dihydroisoalantolactone);3 , 9_二乙酰基 , 10_环氧_4(5)_
吉玛烷_12 , 6α_交酯 [ 3 , 9_diacetoxy1 , 10_epoxy , 4(5)
_germacraen_12 , 6a_olide] ;3 , 9_二乙酰基 , (10)_4(5)_吉玛
烷_12 , 6α_交酯 [ 3 , 9_diacetoxy1(10), 4(5)_germacra_dien_
12 , 6a_olide] 等 , 均从土木香的根中分离得到 , 为白色针
晶 , 经一维和二维核磁共振光谱 (one_dimension and
two_dimension nuclear magnetic resonance , NMR)和质谱确
定它们的结构如图 1所示 , 经高效液相色谱法 (high
performance liquid chromatography , HPLC)和 1H_NMR检
查 ,纯度在 99%以上。
1.2 药品和试剂
噻唑蓝(MTT , Sigma);RPMI 1640培养基 (Gibco);
顺铂 (Sigma)。
1.3 细胞系和实验动物
人肝肿瘤细胞株 (HLE)由日本千叶大学医学部第
二生物化学教室提供;人胚肺成纤维细胞 (HEL)由河
北医科大学基础医学院细胞生物学实验室提供。各实验
用细胞接种于直径为 100 mm的培养皿中 , 加入含 10%
胎牛血清的 RPMI 1640培养基 , 37 ℃和 5%CO 2培养箱
中培养 。实验用小鼠为昆明小鼠 ,体质量 18 ～ 22 g ,合格
证号:(冀)动字 805213号。小鼠由河北医科大学实验动
物中心提供 , 试验期间饲以该中心提供的饲料 , 自由饮
水 。
1.4 体外抑制细胞增殖实验
参照文献[ 4]中的方法 。HLE细胞和 HEL细胞接种
于 96孔板 , 每孔含 1×104个细胞 , 分别加入溶剂对照
(终浓度 0.1%DMSO), 阳性对照顺铂和紫杉醇以及化
合物 1 ～ 5各受试物 ,终浓度均设为 100、10和 1 μmol/L
3个浓度组 , 每组设 3个复孔 , 置于饱和湿度 、 37 ℃和
5%CO 2培养箱中培养 48 h 。于培养结束前 4 h ,各培养
孔加入 5 mg/ml MTT。实验终止时测定各孔吸光度值
D(570),并按下式计算细胞增殖抑制率。
细胞增殖抑制率(%)=[ 1-实验组 D(570)值/对照组 D
(570)值] ×100%
1.5 体内抑制肿瘤细胞增殖实验
参考文献 [ 5] 的方法 , 建立移植性肝癌 H22小鼠模
型 。取小鼠腹腔传代的处于对数生长期的肝癌 H22细
胞 ,计数后用无菌生理盐水调整细胞浓度为 5×107/ml ,
接种于小鼠右前肢腋窝皮下 ,每只 0.2 ml , 即 1×107个
细胞 ,接种 1 d后 ,随机分为 5组 ,每组 10只。空白对照
组按 0.02 ml/g灌胃给予水;环磷酰胺组腹腔注射环磷
酰胺[ 30 mg/(kg ·d)] ;给药实验组分为 1、 10和 100
mg/(kg ·d)3个剂量组 , 灌胃给予异土木香内酯(0.02
ml/g),每日给药 1 次 ,连续 10 d。第 10天处死小鼠 ,迅
速剥取瘤块 、胸腺和脾脏 , 称取瘤质量 、胸腺和脾质量 ,
按下式计算肿瘤抑制率 、胸腺指数和脾指数 。
肿瘤抑制率(%)=(1-给药组平均瘤质量/对照组平均瘤
质量)×100%
胸腺(脾)指数=1 000×胸腺(脾)质量/体质量
1.6 统计学处理
数据用 x-±s表示;两组间均数的比较用 t检验 ,
多组间均数的比较用单因素方差分析 。应用 SAS6.12统
计软件计算。
图 1 实验用 5种倍半萜化合物的结构 . 1:异土木香内酯;2:2_羟基_11 , 13_二氢异土木香内酯;3:11, 13_二氢异土木香内酯;4:3, 9_二乙酰
基 , 10_环氧_4(5)_吉玛烷_12, 6α_交酯;5:3 , 9_二乙酰基 ,(10)_4(5)_吉玛烷_12, 6α_交酯 .
Figure 1 Chemical structures of five sesquiterpenoids for experiment. 1:isoalantolactone;2:2_hydroxy_11, 13_11, dihydroisoalantolactone;3:11 ,
13_dihydroisoalantolactone;4:3, 9_diacetoxy1, 10_epoxy , 4(5)_germacraen_12, 6α_olide;5:3, 9_diacetoxy1 , 4(5)germacra_dien_12 , 6α_olide
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CARCINOGENESIS , TERATOGENESIS ＆ MUTAGENESIS
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2 结 果
2.1 化合物 1～ 5对体外培养的 HLE细胞增殖的抑制
作用
结果如图 2所示 , 100 μmol/L阳性对照紫杉醇及化
合物 1对 HLE细胞的增殖显示较强的抑制活性 , 其细
胞增殖抑制率分别为 73.18%和 64.14%(图 2A), 并且
与溶剂对照组相比较差异有统计学意义(P <0.01)。紫
杉醇及化合物 1对HLE细胞增殖的半数抑制浓度(IC50)
分别为 4.03 μmol/L和 19.41 μmol/L ,而阳性对照顺铂
对 HLE的增殖显示较弱的抑制活性 , 其 IC50大于 100
μmol/L(图 2B), 提示异土木香内酯有较强的抑制 HLE
细胞增殖的作用;而与化合物 1结构相似的化合物 2、3
和 A 、 B 环变成十元大环的化合物 4、 5即使用 100
μmol/L处理HLE细胞 ,对其增殖均显示弱的抑制活性 ,
细胞增殖抑制率分别为 22.45%、 11.89%、 9.14%和
11.07%(图 2A)。
图 2 五种倍半萜内酯对人肝肿瘤细胞 HLE增殖的影响.与溶剂对照组比较 , ＊P<0.05, ＊＊P<0.01
Figure 2 The effect of five sesquiterpene lactones on the proliferation of HLE hepatoma cell line. Compared with control , ＊P<0.05, ＊＊P<0.01
2.2 异土木香内酯对体外培养的 HEL细胞增殖的抑
制活性的影响
实验结果如图 3所示 ,阳性对照顺铂对 HEL细胞的
增殖呈现较强的抑制活性 , IC50为 26.69μmol/L ,而异土
木香内酯在 100μmol/L剂量组显示较低的细胞抑制活
性 ,其细胞增殖抑制率为 22.37%, IC50大于 100μmol/L。
2.3 异土木香内酯对小鼠移植性肿瘤 H22增长的抑
制作用
实验结果如图 4所示 , 腹腔给予环磷酰胺 , 显著地
抑制小鼠肝癌 H22的生长 , 肿瘤抑制率为 67.56%, 异
土木香内酯连续给药 10 d , 100和 10 mg/(kg ·d)剂量
组可显著抑制小鼠肝癌 H22的生长 , 肿瘤抑制率为
65.50%和 42.97%,与空白对照组比较差异有统计学意
义 (P<0.01)(图 4A)。环磷酰胺组比对照组的胸腺指
数和脾指数显著降低 (P<0.01),但化合物 1各剂量组
的胸腺指数以及脾指数与对照组相比差异无统计学意
义(P >0.05)(图 4B)。
图 3 异土木香内酯对人胚肺成纤维细胞 HEL的增殖的影响 .与溶剂
对照组比较 , ＊P<0.05, ＊＊P<0.01
Figure 3 The effect of isoalantolactone on the prol iferation of HEL cell
l ine.Compared with control , ＊P<0.05 , ＊＊P<0.01
图 4 异土木香内酯对小鼠移植性肿瘤 H22生长影响 . A:肿瘤抑制率;B:胸腺指数和脾指数 .与对照组比较 , ＊P<0.05, ＊＊P<0.01
Figure 4 The anti_tumor activity of isoalantolactone on the H22 in mice. A:Inhibition rate;B:Thymus index and spleen index.Compared with
control , ＊P<0.05, ＊ ＊P<0.01
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3 讨 论
肝癌是人类最常见的恶性肿瘤之一 , 目前外科手
术治疗仍是肝癌治疗的首选方案 , 但是 95%的肝癌患
者在确诊时已失去手术机会 , 只能依赖于化学药物的
治疗 , 但是由于肝癌属于化疗不敏感的恶性肿瘤 , 大
多数的化疗药物并不能提高肝癌患者的生存质量[ 6]。寻
找高效低毒的新的抗癌成分一直是药物学家和肿瘤专
家努力的方向 [ 7-8] , 因此 , 新的肿瘤治疗药物的研制已
经成为十分迫切的医学与社会问题 。
我们以前的系列研究发现 , 土木香中提取的多种
倍半萜类化合物对恶性肿瘤细胞显示出较强的抗增殖
活性 [ 9-10] ,本实验中 ,我们采用土木香根中提取的 5种
倍半萜内酯化合物 , 研究其对人肝肿瘤细胞增殖的抑
制活性。
结果显示 ,异土木香内酯对人肝肿瘤细胞的增殖有
明显的抑制作用 , 并且呈现较好的剂量依赖关系;进一
步的在体实验表明 , 异土木香内酯对小鼠移植性肿瘤
H22生长具有抑制作用 , 并且不降低荷瘤小鼠的胸腺指
数和脾指数 ,推测异土木香内酯有可能是提高机体的免
疫能力来实现其抗肿瘤活性的 。有关作用机制的实验正
在进一步研究中。同样从土木香根中提取得到的 2_羟
基_11 , 13_二氢异土木香内酯 , 11 , 13_二氢异土木香内
酯 , 3 , 9_二乙酰基 , 10_环氧_4(5)_吉玛烷_12 , 6α_交酯
和 3 , 9_二乙酰基 , (10)_4(5)_吉玛烷_12 , 6α_交酯 ,即
使用 100 μmol/L的浓度处理HLE肿瘤细胞 , 对其增殖
均显示较弱的抑制活性。从结构上分析异土木香内酯属
于桉叶烷型(eudesmane)倍半萜内酯 ,其活性与其具有的
α, β_不饱和五元内酯环的结构有关 , 抑制活性的丧失
可能是由于化合物 2 、 3中五元内酯环的环外双键饱和
所致;而化合物 4和 5属于吉玛烷型(germacrane)倍半萜
内酯 , A_, B_环的 C5_C10键断开生成十元大环可能是其
活性消失或减弱的原因 。
我们通过对土木香中提取的 5种倍半萜内酯化合物
对人肝肿瘤细胞的增殖抑制活性筛选的研究 , 探讨化合
物构_效关系 , 并将在下一步对土木香提取的异土木香
内酯的抑制人肝肿瘤细胞增殖机制进行深入研究 , 为临
床更好地开发利用土木香提供实验依据。
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