全 文 ：广西菲牛蛭中提取的抗凝活性成分与马尼拉菲牛蛭
中提取的水蛭素 P6 ,P18[ 5]有多大的同源性。
从广西菲牛蛭消化液中分离提取菲牛蛭素 ,从
根本上解决了水蛭素类产品因来源少而限制其在临
床使用的问题 ,如果研制新型高效水蛭素溶栓剂用
于治疗脑血栓病人 ,将大大减少心脑疾病的死亡率 ,
降低致残率 ,提高长寿率 ,造福人类 ,产生较大的社
会效益。
参考文献:
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孔石莼多糖对小鼠免疫功能的影响
卞　俊1 , 储智勇2 , 鲍蕾蕾1 , 成　熙1 , 梁小锋1 , 刘先降1 , 周　翔1
(1.中国人民解放军第 411医院 药学专科中心 , 上海 200434;
2.中国人民解放军 海军医学研究所 , 上海 200433)
　　摘　要:目的 观察孔石莼多糖对小鼠免疫功能的影响。方法 应用水煮醇沉法从海洋生物孔石莼中获得孔石
莼多糖 ,观察孔石莼多糖对小鼠免疫功能的调节作用。结果 200 mg/(kg·d)孔石莼多糖能明显促进小鼠的胸腺指
数和脾指数。100 , 200 mg/(kg·d)剂量能显著促进 ConA 诱导的小鼠脾淋巴细胞转化能力 , 增强小鼠的迟发性超敏
反应 ,提高小鼠的血清溶血素水平 , 增强小鼠的碳廓清能力 , 提高小鼠NK细胞的杀伤活性。结论 孔石莼多糖能明
显调节机体的细胞免疫与体液免疫功能 ,促进 NK细胞的杀伤活性及巨噬细胞的吞噬能力。
　　关键词:海洋生物;孔石莼;多糖;免疫调节
　　中图分类号:R282.71;R965　　文献标识码:A　　文章编号:1005-1678(2006)05-0276-04
Effect of polysaccharides from Ulva pertusa on immune function in mice
BIAN Jun
1 , CHU Zhi-yong2 , BAO Lei-lei1 , CHENG Xi1 , LIANG Xiao-feng1 , LIU Xian-jiang1 , ZHOU Xiang1
(1.Reasearch Center of Pharmacy , PLA Navy , Shanghai 200434 , China;2.PLANavy Medical Research
Institute , Shanghai 200433 , China)
　　Abstract:Purpose To investigate the effect of polysaccharides from Ulva pertusa on immune function in
mice.Methods The effect of ig polysaccharides from Ulva pertusa in dose of 50 , 100 ,200mg/(kg·d)for 15
days on immune function was studied in mice.Results The polysaccharides from Ulva pertusa markedly en-
hanced the weight index of thymus and spleen at the dose of 200 mg/(kg·d), and significantly enhanced the
收稿日期:2005-12-12;修回日期:2006-01-08
作者简介:卞俊(1960-),男 ,湖南华容人 ,主任药师 ,主要从事中
药新药制剂开发研究;储智勇(1969-),通讯作者 , 副研究员 , 主要从
事心血管药理学研究 , Tel:021-51667102, E-mail:zhiyongchu@hotmail.
com。
276 中国生化药物杂志 Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics 2006年第 27 卷第 5 期
proliferation of spleen T lymphocytes , the activity of NK cells , the clearance of charcoal particle , the delayed
type hypersensitivity (DTH)and the serum hemolysins inmice at the dose of 100 and 200mg/(kg·d)respec-
tively.Conclusion The results showed that the polysaccharides from Ulva pertusa had an obvious effect of im-
proving immune function in mice , which suggested one of mechanisms of its inhibiting the growth of sarcoma in
mice.
Key words:marine biology;Ulva pertusa;polysaccharides;immune regulation
　　孔石莼(Ulva pertusa Kjellm)是一种广泛分布于
黄海渤海的大型绿藻[ 1] ,其资源极为丰富。关于石
莼类药用 ,始载于《本草拾遗》 ,“石莼生南海 ,附石而
生 ,似紫菜 ,色青” ,主“味甘无毒 , 入水 , 利小便” 。
《本草纲目》中也记载石莼具有软坚散结 、清热解清 ,
利水消肿等功效 。我国民间一直用孔石莼与其他药
用植物配伍治疗中暑 、颈淋巴结肿 、甲状腺肿 、疮疥 、
急慢性胃肠炎 、高血压 、水肿和小便不利 、喉炎及咳
嗽等等[ 2-3] 。现代药理学研究也表明 ,孔石莼提取物
具有降血脂 、降胆固醇 、抗凝 、抗病毒 、抗肿瘤等作
用[ 4-5] 。本研究用水煮醇沉法提取孔石莼多糖 ,同时
考察了孔石莼多糖对小鼠免疫功能的调节作用。
1　材　料
孔石莼 ,采自浙江省苍南县南麂岛 ,经上海自然
博物馆杭金欣研究员鉴定 。用冷水冲洗干净 ,自然
风干 ,剪碎 ,塑料袋封口备用。
ConA 、四甲基偶氮唑盐(MTT), Sigma 公司;壬
基苯酚聚乙二醇 40(NP40)、硝基氯化四氮唑 、吩嗪
二甲酯硫酸盐 ,Fluka 公司;氧化型辅酶 Ⅰ ,上海化学
试剂公司;RPMI 1640培养基 ,Scientific公司;小牛血
清 ,上海华美生物工程公司;印度墨汁 ,Winsaw &
Newton 公司 。
756型紫外可见分光光度计 ,上海第三分析仪
器厂 。
ICR小鼠 ,雄性 ,18 ～ 20 g ,清洁级 ,上海西普尔-
必凯实验动物有限公司 ,动物合格证号:SCXK(沪)
2003-0002。实验动物饲养温度为(22±2)℃,相对湿
度为 50%～ 70%。
2　方　法
2.1　孔石莼多糖的提取
称取孔石莼干藻 200 g ,加水 6 L ,煮沸提取 2 h ,
80目绢网过滤 ,滤渣继加水 6 L煮沸提取2次 ,每次
1 h ,绢网过滤 ,初滤液用硅藻土助滤 ,减压浓缩至体
积约 1 L ,流水透析 48 h ,加入 3倍体积的 95%乙醇
沉淀过夜 ,离心分离沉淀 ,于 70℃减压烘干得黄褐
色孔石莼粗多糖 ,称重42.36 g ,得率为21.18%。取
孔石莼粗多糖 40 g ,加入蒸馏水500 mL ,磁力搅拌溶
解 ,用5%碳酸氢钠调 pH 8 ,加入1∶250胰酶 1.25 g ,
加入甲苯 2 mL ,置于 37℃恒温箱振荡 24 h ,取出多
糖溶液 ,13 000 r/min离心 20 min ,去沉淀 ,上清用改
良的Sevag 法[ 6]去蛋白质至界面无白色沉积为止。
将脱蛋白质液透析袋用流水及蒸馏水各透析 24 h ,
取出袋内液 ,加入 3倍量 95%乙醇 , 4℃冰箱静置过
夜 ,离心得沉淀 ,沉淀用无水酒精洗涤至洗涤液无
色 ,沉淀物加入双蒸水溶解 ,再用透析袋对流水及蒸
馏水透析1 d ,离心去沉淀 ,冷冻干燥得初步纯化的
孔石莼多糖 ,称重得 24.1 g ,总得率为 12.76%。
2.2　孔石莼多糖对小鼠体重 、胸腺指数和脾指数的
影响
ICR小鼠 40 只 ,随机分成 4 组:蒸馏水对照组
和孔石莼多糖低 、中 、高 3 个剂量组[ 50 ,100和 200
mg/(kg·d)] ,给药体积为 0.4 mL/只 ,连续灌胃给药
15 d ,于末次给药后次日脱颈处死动物 ,称重 ,无菌
取出脾脏和胸腺 ,分别精确称量小鼠脾脏和胸腺 ,按
公式(1)计算胸腺指数和脾指数。
胸腺(脾)指数(%)=胸腺(脾)重量(g)/小鼠重
量(g)×100 (1)
2.3　ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验(MTT
法)
动物分组 、给药方案均同 2.2项 , 实验方法参
考文献[ 7] 。
2.4　孔石莼多糖对小鼠迟发性超敏反应(DTH)的
影响
动物分组 、给药方案均同 2.2项 ,实验方法参考
文献[ 8] 。
2.5　小鼠碳廓清试验
小鼠尾静脉注射 1∶3稀释的印度墨汁 ,待墨汁
注入 ,立即计时。注入墨汁后2 , 10 min ,分别从眼静
脉丛取血20μL ,并将其加到 0.1%Na2CO3 溶液 2 mL
中 ,在 600 nm 波长处测吸光度(A)值 , 以 0.1%
Na2CO3溶液作空白对照。根据动物体重 、肝重和脾
重计算吞噬指数[ 7] 。
2.6　孔石莼多糖对小鼠血清溶血素的影响(血凝
法)
277中国生化药物杂志 Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics 2006年第 27 卷第 5 期
实验结束前的第 4 天每只动物腹腔注射 2%
(v/v)的绵羊红细胞 0.2 mL ,5 d 后摘除眼球采血 ,
分离血清 ,用生理盐水对血清倍比稀释于微量反应
板内 ,各 100 μL ,加入 0.5%(v/v)的绵羊红细胞 100
μL ,混匀 ,装入湿润饭盒内盖好 ,置于 37℃温箱 3 h ,
观察抗体凝集反应程度[ 8] 。
2.7　孔石莼多糖对小鼠 NK细胞活性的影响[ 7]
将脾细胞用含 10%小牛血清的 RPMI 1640制成
5×106 个/mL 的脾细胞悬液作为效应细胞 。试验前
24 h 将 YAC-1细胞进行传代培养 ,应用前用 Hanks
液洗涤 3次 ,用 RPMI 1640完全培养基调整细胞浓
度为 1×105 个/mL 作用靶细胞 。取效应细胞和靶
细胞各0.5 mL(效靶比 50∶1),加入 24孔培养板中 ,
靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各 0.5 mL ,靶
细胞最大释放孔加靶细胞和 1%NP40 各 0.5 mL。
于 5%CO2 , 37℃培养 4 h ,然后 ,将 24 孔板以 1 500
r/min离心 5 min ,每孔吸取上清 0.5 mL ,加入 LDH
基质液 0.5 mL ,反应 3 min ,每孔加入 1 mol/L 盐酸
150μL ,在 490 nm 波长处测 A 值。按公式(2)[ 7]计
算 NK细胞活性 。
NK 细胞 活性(%)=(A实验组 - A自然释放)/
(A最大释放-A自然释放)×100 (2)
2.8　统计方法
实验结果用 t 检验比较组间差异的显著性。
3　结　果
3.1　孔石莼多糖对小鼠体重及胸腺和脾脏重量指
数的影响
喂养15 d后 ,孔石莼多糖对小鼠的体重无明显
影响 ,对小鼠免疫器官胸腺和脾脏的重量指数的影
响在高剂量时有显著性差异(P<0.05),见表 1。
表 1　孔石莼多糖对小鼠体重 、胸腺指数和脾指数的影响(n=10 , x±s)
Tab 1　effect of polysaccharides from Ulva pertusa on the weight of thymus and spleen in mice(n =10 , x±s)
组　别 剂量/ [ mg/(kg·d)] 终期体重/ g 胸腺指数/ % 脾指数/ %
对照组　 - 29.8±2.0 0.30±0.03 0.43±0.03
低剂量组 50 29.6±2.0 0.33±0.03 0.47±0.05
中剂量组 100 29.5±1.5 0.34±0.05 0.47±0.05
高剂量组 200 29.5±1.2 0.35±0.051 0.49±0.061
　　　　　　　　与对照组比较:1P <0.05
　　　　　　　　vs normal control:1P <0.05
3.2　孔石莼多糖对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响
由表 2可见 ,在中 、高剂量组 ,孔石莼多糖可明
显促进 ConA诱导的小鼠脾 T淋巴细胞增殖反应。
表 2　ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验(n=10 , x±s)
Tab 2　Effect of polysaccharides from Ulva pertusa on the trnsformation of spleen lymphocytes induced by ConA in mice(n=10 , x±s)
组　别 剂量/[ mg/(kg·d)]
A 值
加 ConA 不加 ConA 差值
对照组　 0 0.290±0.030 0.095±0.011 0.195±0.026
低剂量组 50 0.319±0.041 0.102±0.012 0.218±0.037
中剂量组 100 0.335±0.0411 0.104±0.011 0.231±0.0451
高剂量组 200 0.347±0.0412 0.106±0.010 0.241±0.0412
　　　　　　　　　与对照组比较:1P<0.05 , 2P <0.01
　　　　　　　　　vs normal control:1P <0.05, 2P <0.01
3.3　孔石莼多糖对小鼠迟发性超敏反应(DTH)的
影响
从表 3可见 ,孔石莼多糖给药 15 d 后 ,中 、高剂
量组小鼠右耳与左耳的重量差值明显增加(P <
0.05),说明孔石莼多糖使中 、高剂量组小鼠 DTH 水
平明显增强。
3.4　孔石莼多糖对小鼠血清溶血素水平的影响
从表 4可见 ,孔石莼多糖中 、高剂量组的血清溶
血素抗体滴度明显高于对照组 。
表 3　孔石莼多糖对小鼠 DTH 的影响(n=10 , x±s)
Tab 3　Effect of polysaccharides from Ulva pertusa on delayed type
hypersensitevety(DTH)in mice(n=10 , x±s)
组别 剂量[ mg/(kg·d)] 耳重均值/mg右 左 差值
对照组　 0 30.3±3.8 16.7±2.0 13.6±2.7
低剂量组 50 31.9±3.2 16.8±1.9 15.1±3.5
中剂量组 100 33.1±2.3 16.9±1.4 16.2±2.51
高剂量组 200 33.7±3.21 17.1±1.7 16.6±2.11
　　与对照组比较:1P<0.05
　　vs normal control:1P <0.05
278 中国生化药物杂志 Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics 2006年第 27 卷第 5 期
表 4　孔石莼多糖对小鼠血清溶血素抗体滴度 、碳廓清能力
及NK细胞活性的影响(n =10 , x±s)
Tab 4　Effect of poly saccharides from Ulva pertusa on the serum
hemolysins , clearance of charcoal particle and the activity of NK
cells in mice(n=10 , x±s)
组　别剂量/[ mg/(kg·d)] 抗体积数 吞噬指数 NK细胞活性
对照组　 - 44.3±13.2 4.10±0.49 23.95±8.51
低剂量组 50 48.8±7.6 4.39±0.32 29.11±9.65
中剂量组 100 56.0±10.91 4.54±0.321 34.09±10.811
高剂量组 200 61.9±9.72 4.67±0.362 35.89±11.721
　　与对照组比较:1P <0.05, 2P <0.01
　　vs normal cont rol:1P<0.05 , 2P<0.01
3.5　孔石莼多糖对小鼠碳廓清能力及 NK 细胞活
性的影响
从表 4可见 ,喂养 15 d后 ,孔石莼多糖中 、高剂
量组的碳廓清能力明显高于对照组 。中 、高 2个剂
量组小鼠NK细胞活性均明显高于生理盐水对照组
(P<0.05)。
4　讨　论
近年对孔石莼多糖进行了分离 、提纯 、结构分析
及药理研究 ,有文献报道 ,孔石莼多糖口服给药具有
显著的抗肿瘤作用 ,对 Ehrlichcarcinoma 的抑制率达
到56.0%;孔石莼的糖蛋白质(PPF)对 S180细胞也具
有明显的生长抑制效果[ 4] 。我们的研究也表明 ,孔
石莼多糖在体内外对肿瘤生长均有一定的抑制效应
(资料另文发表)。口服孔石莼多糖还具有调节血脂
等作用[ 5] 。
多糖及多糖复合物参与和介导细胞各种生命现
象的调节 , 特别是免疫功能的调节 , 是免疫调节
剂[ 9-10] 。本研究发现 ,在剂量为 200 mg/(kg·d)时 ,
孔石莼多糖能明显促进小鼠的胸腺指数和脾指数;
在100 ,200 mg/(kg·d)剂量时 ,能显著促进 ConA 诱
导的小鼠脾淋巴细胞转化能力 ,促进小鼠的迟发性
超敏反应 ,表明孔石莼多糖可明显提高小鼠的细胞
免疫功能;在 100 , 200 mg/(kg·d)剂量时 ,能显著提
高小鼠的血清溶血素含量 ,提示孔石莼多糖对小鼠
的体液免疫功能具有明显的促进作用;孔石莼多糖
可增强小鼠的碳廓清能力 、促进 NK 细胞的杀伤活
性 ,表明其具有促进小鼠巨噬细胞吞噬作用和增强
小鼠机体 NK 细胞杀伤作用的功能。B 细胞 、T 细
胞 、NK细胞和单核吞噬细胞是调节机体免疫反应的
重要活性细胞 ,它们可通过分泌抗体 、分泌细胞因
子 、细胞毒作用 、吞噬作用等来抑制和杀伤靶细胞。
本研究提示 ,孔石莼多糖通过提高机体的免疫功能 ,
促进NK细胞杀伤活性及巨噬细胞的吞噬活力 ,增
强机体对肿瘤生长的抵抗作用。
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《中国药品标准杂志》2007年征订启事
《中国药品标准杂志》是经国家科学技术部批准 、国家食品药品监督管理局主管 、由国家药典委员会主办的我国第一部在
药品标准领域进行报道和交流的学术性期刊 ,《中国药品标准》杂志的出版发行 , 将为进一步贯彻实施国家药品标准法制化发
挥积极作用。
该刊于 2000年 4 月 18 日创刊 ,刊号为:CN11-4422/R ,双月刊 , 80页 , 国内外公开发行 ,邮发代号:2-509 , 2007年全年定价 72
元。欢迎单位和个人在当地邮局或中国药品标准杂志社订阅。编辑部尚存有部分 2002 年 、2003 年 、2004 年 、2005 年合订本 , 欢
迎补购。《中国药品标准杂志》设立的栏目有:综述 、论著 、标准管理与法规 、标准论坛 、实验与研究 、辅料与包装 、标准与临床 、
标准发布 、国外药典信息。适合药品生产企业 、药品监督与检验机构 、医疗机构 、相关仪器设备制造企业 、医院药房与社会药
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279中国生化药物杂志 Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics 2006年第 27 卷第 5 期