全 文 ：2014 年 5 月
第 29 卷第 5 期
中国粮油学报
Journal of the Chinese Cereals and Oils Association
Vol． 29，No． 5
May 2014
培养条件对眼点拟微绿球藻油脂含量和 EPA产率的影响
卢美贞 沈林杰 陆向红 窦 晓 计建炳
(浙江省生物燃料利用技术研究重点实验室 浙江工业大学化学工程与材料学院，杭州 310014)
摘 要 眼点拟微绿球藻(N． oculata)具有生长速度快、含油量高等优点，且其脂肪酸组成中含有大量二
十碳五烯酸(EPA)，因此它是微藻生物柴油的良好原料。以眼点拟微绿球藻为对象，研究了培养时间、盐度、
pH值等培养条件对眼点拟微绿球藻油脂含量和 EPA 产率的影响。试验表明:选择稳定 5 d 为眼点拟微绿球
藻的最佳采收时间，油脂含量为 378． 1 mg /g干藻，EPA产率为 5． 5 mg /(L·d);当盐度为 16． 7 时，眼点拟微绿
球藻的油脂含量和 EPA产率均能达到最高，油脂含量为 506． 0 mg /g干藻，EPA产率为 7． 37 mg /(L·d);在适
合眼点拟微绿球藻生长的 pH值(8． 0 ～ 10． 0)下，保持整个培养过程中 pH 值为 8． 0，油脂含量和 EPA 产率均
较高，油脂含量为 471． 7 mg /g干藻，EPA产率为 7． 45 mg /(L·d)。
关键词 培养时间 盐度 pH值 眼点拟微绿球藻 油脂含量 EPA产率
中图分类号:TQ646． 4 文献标识码:A 文章编号:1003 － 0174(2014)05 － 0080 － 05
基金项目:浙江省重大科技专项(2006C11015)，浙江省教育厅项
目(Y201224695)
收稿日期:2013 － 06 － 07
作者简介:卢美贞，女，1980 年出生，讲师，化学工程
通讯作者:陆向红，女，1971 年出生，副教授，化学工程
生物燃料作为一种清洁的可再生资源已经在国
际上得到了广泛的重视。在生物燃料的众多原材料
中微藻具有含油量高、生长周期短、不与粮食争地等
优点，被科研人员认为是最有前景的可再生能源之
一［1 － 3］。目前制约微藻生物柴油产业化发展的一个
关键性的问题就是成本问题，为了降低成本除了可
以对微藻生物柴油的各个环节进行技术的改进和条
件的优化之外，还可以提取高价值副产物。二十碳
五烯酸(EPA)，属于 ω － 3 系列多不饱和脂肪酸，是
人体自身不能合成但又不可缺少的重要营养素［4 － 8］。
传统的 EPA主要从鱼油中提取，但是由于鱼油资源
有限、产量不稳定、得率低、纯化工艺复杂，单靠鱼油
来生产 EPA很难满足人们的要求。
眼点拟微绿球藻(N． oculata)具有生长速度快、
含油量高等优点，是微藻生物柴油的良好原料，且其
脂肪酸含有大量 EPA，在获取微藻生物柴油的同时
提取 EPA，是一种综合开发、降低微藻生物柴油成本
的有效途经。培养条件对眼点拟微绿球藻油脂含量
和 EPA 影响的研究较多，魏东等［9］研究了细胞生长
时期对眼点拟微绿球藻总脂含量和脂肪酸组成的影
响;王秀良等［10］报告了 pH 对眼点拟微绿球藻生长、
总脂含量及脂肪酸组成的影响;周洪琪等［11］报告了
盐度、温度、光照强、光照周期和氮水平对微绿球藻
脂肪酸组成的影响;杨官品等［12］报告了温度逆境处
理对拟微球藻 EPA 含量的影响;蒋霞敏［13］、Ｒocha
等［14］报告了光照强度对微绿球藻油脂含量和 EPA
含量的影响，他们的研究讨论了各培养条件对眼点
拟微绿球藻 EPA 在脂肪酸中所占百分含量的影响，
但是培养条件对眼点拟微绿球藻 EPA产率的影响还
未有报告。本试验研究了培养条件对眼点拟微绿球
藻油脂含量和 EPA 产率的影响，以期筛选出眼点拟
微绿球藻产 EPA 的最佳条件，降低微藻生物柴油的
成本。
1 材料与方法
1． 1 材料
眼点拟微绿球藻:海洋生物种质库，经过涂布平
板的方法纯化之后，在实验室保存待用。
1． 2 培养基
基础培养基采用 F /2 加富培养基，其中氮源为
0． 225 g /L的 NaNO3，磷源为 0． 045 g /L的 NaH2PO4·
2H2O，其余营养盐均与 F /2 培养基
［15］一致，海水采
用每升去离子水中加入 30 g 海水晶(盐度为 25)配
制成的人工海水，pH 8． 0。
1． 3 藻种预处理
将纯化之后镜检无原生动物污染、生长状况良
好的眼点拟微绿球藻接入 7 L 气升式光反应器中培
养，培养体积 5 L，培养采用 F /2 加富培养基，培养过
程连续充入无菌空气，自然光照，培养温度 20 ～ 25
第 29 卷第 5 期 卢美贞等 培养条件对眼点拟微绿球藻油脂含量和 EPA产率的影响
℃。待眼点拟微绿球藻生长至对数期后，取 2 L 藻
液，3 000 r /min离心去除营养盐，得到待用藻泥。
1． 4 试验设计
1． 4． 1 培养时间对眼点拟微绿球藻产率的影响
将离心所得的藻泥接种至 7 L气升式反应器中，
培养体积 5 L，初始接种密度为 OD440nm = 0． 20，培养
基为 F /2 加富培养基，盐度为 25，培养温度为 20 ～ 25
℃，自然光照，pH 8． 0，培养过程中 pH 不调节，培养
至对数中期后每隔 2 d、培养至稳定期后每隔 3 d，取
300 mL藻液测其油脂含量和 EPA产率。
1． 4． 2 盐度对眼点拟微绿球藻 EPA产率的影响
陈洁等［16］研究表明眼点拟微绿球藻生长的最适
盐度范围为 13． 7 ～ 33． 4，参考他们的研究结果，考查
盐度分别为 16． 7、25． 0、33． 3 时对眼点拟微绿球藻油
脂含量和 EPA产率的影响，其余培养条件同 1． 4． 1。
1． 4． 3 pH值对眼点拟微绿球藻 EPA产率的影响
一般海水藻类生存的适宜 pH 值为 8． 3，王秀良
等［10］研究表明酸性条件不利于眼点拟微绿球藻生
长，该藻在强碱条件 pH 9． 8 时仍然能较好的生长，
参考以上研究结果，设置 3 组试验，用 1 mol /L 的
HCl和 NaOH将藻液的 pH调节为 8． 0、10． 0，及初始
pH调节为 8． 0 培养过程中不再调节，每隔 24 h 测量
培养液的 pH值，其余培养条件同 1． 4． 1，考察在适合
眼点拟微绿球藻生长的 pH 下，不同 pH 值对其油脂
含量和 EPA产率的影响。
1． 5 分析方法
1． 5． 1 眼点拟微绿球藻细胞密度的测定
每隔 24 h，采用紫外可见分光光度仪测定微藻
溶液在 440 nm处的吸光值(OD440nm)，每个样品重复
测定 3 次，取平均值。
1． 5． 2 眼点拟微绿球藻油脂含量的测定
用 1 mol /L的 NaOH溶液将藻液的 pH值调节为
10． 5(絮凝)，静置 24 h 之后，去除上清液得到藻泥，
藻泥中加入去离子水在 3 000 r /min 的速度下离心 5
min，去除上清液，此过程重复 3 次以去除培养盐，将
无培养盐的藻泥在 70 ℃的烘箱中烘干至恒重，采用
改良酸法［17］测定藻粉中油脂的含量。
1． 5． 3 眼点拟微绿球藻藻油成分的分析
藻油的甲酯化:将所得到的藻油用 CHCl3 溶解，
转入 1． 5 mL Agillient 玻璃瓶中，加入 1 mL 1 mol /L
的硫酸甲醇溶液，充 N2 密封，于 100 ℃反应 1 h，自
然冷却，加入 200 μL去离子水，混匀，用 200 μL正己
烷萃取 3 次，合并有机相，用 200 μL去离子水反萃取
洗涤 3 次，取有机相，转入 1． 5 mL Agillient 玻璃瓶
中，N2 吹干，称重。
气相色谱定量分析:采用 Aglient 公司生产的
7890 型气相色谱仪(GC)对甲酯化后微藻油脂中的
脂肪酸甲酯进行定量分析。GC 分析条件:DB －
WAX毛细管色谱柱(30 m × 0． 32 mm × 0． 50 μm)。
柱升温程序:从 50 ℃升至 150 ℃，保持 2 min;以 10
℃ /min升至 200 ℃，保持 6 min;再以 10 ℃ /min升至
230 ℃，保持 5 min。载气:氮气;流量:3 mL /min。检
测器:氢火焰检测器，氢气:30 mL /min;空气:300
mL /min。进样口温度:280 ℃;检测器温度 300 ℃。
1． 5． 4 EPA产率的计算
EPA产率 = EPA 含量 ×含油量 ×干藻质量 /培
养时间
2 结果与讨论
2． 1 培养时间对眼点拟微绿球藻油脂含量和 EPA
产率的影响
当眼点拟微绿球藻生长至对数中期 OD440nm =
1． 50时，开始取样分析眼点拟微绿球藻的油脂含量
和 EPA产率，具体结果见表 1。从表 1 中可以看出培
养时间对眼点拟微绿球藻的油脂含量和 EPA产率有
着较大的影响，随着培养时间的增加眼点拟微绿球
藻的油脂含量先增加后下降，EPA 的含量则逐渐下
降，这与黄旭雄等［18］的研究结论一致，EPA产率在对
数中期第 2 天达到最大，随着培养时间的增加 EPA
产率先下降再增加再下降，这是因为 EPA 产率受油
脂含量、藻粉干重及培养时间这 3 个因素的影响，微
藻的油脂积累主要发生在稳定期，从表中可以看出
稳定 5 d的时候微藻的油脂含量达到最高，随着稳定
时间的增加，油脂含量开始下降。综合考虑油脂含
量和 EPA 产率，选择稳定 5 d 为眼点拟微绿球藻的
最佳采收时间。
表 1 采收时间对眼点拟微绿球藻 EPA产率的影响
采收
时间
对数
中期
对数中
期 2 d
对数中
期 4 d
稳定
3 d
稳定
5 d
稳定
8 d
干重 / g /L 1． 36 1． 64 1． 89 2． 02 2． 03 2． 00
含油量 /mg /g干藻 179． 7 207． 5 220 253． 8 378． 1 194． 4
EPA含量 28． 84 27． 68 18． 54 20． 31 16． 32 12． 17
EPA产率 /mg /(L·d) 5． 42 6． 29 4． 53 5． 19 5． 46 1． 82
2． 2 盐度对眼点拟微绿球藻油脂含量和 EPA 产率
的影响
盐度对眼点拟微绿球藻生长密度的影响见图 1。
18
中国粮油学报 2014 年第 5 期
从图 1 中可以看出当盐度从 16． 7 增加到 33． 3 的时
候，眼点拟微绿球藻的生长速率逐渐变慢，16． 7 为眼
点拟微绿球藻的生长的最适盐度，而陈洁等［16］研究
显示眼点拟微绿球藻的适盐范围为 13． 7 ～ 33． 4，最
适盐度为 26． 9。从陈洁等的研究中可以看出盐度从
0 增加到 13． 7 时，眼点拟微绿球藻的生长率逐步上
升，从 13． 7 增加到 20． 2，20． 2 增加到 26． 9，26． 9 增
加到 40． 1，眼点拟微绿球藻的生长率先下降再增加
再下降，16． 9 没有考虑到，而 16． 9 是眼点拟微绿球
藻的生长率从高到低的一个拐点。高盐度不利于眼
点拟微绿球藻生长密度的提高，这可能是因为高盐
度下微藻生长需要更多的能量以维持其正常的渗透
压以及特定的离子浓度，从而使用于生长的能量减
少［20］。
图 1 盐度对眼点拟微绿球藻生长密度的影响
盐度通过影响微藻的光合作用和呼吸作用，从
而对其体内生化成分产生影响［21 － 22］，盐度严重影响
微藻的油脂含量和脂肪酸组成，但是不同的藻种差
别比较大，Teshima等［23］研究表明在盐度 4 ～ 30 的时
候，一种海水小球藻 C． saccharophial 的脂肪酸组成
及含量基本不变，陈峰等［24］研究表明，高盐度下杜氏
盐藻的多不饱和脂肪酸含量下降、总脂肪酸增加，吴
瑞珊等［19］研究表明当盐度为 32 的时候眼点拟微绿
球藻中的 EPA在总脂肪酸中的含量达到最高，眼点
拟微绿球藻细胞生长和 EPA 积累的最适盐度范围在
25 ～ 32。本次试验中盐度对眼点拟微绿球藻油脂含
量和 EPA产率的影响见表 2。从表 2 中可以当盐度
从 16． 7 增加到 33． 3 的时候，眼点拟微绿球藻中
EPA占总脂肪酸的含量逐步上升，油脂含量和 EPA
产率逐步降低。本次试验中当盐度为 16． 7 的时候，
眼点拟微绿球藻的油脂含量和 EPA产率均能达到最
高，16． 7 为眼点拟微绿球藻生长油脂和 EPA 的最佳
盐度。
表 2 盐度对眼点拟微绿球藻 EPA产率的影响
盐度 16． 7 25 33． 3
干重 / g /L 2． 24 2． 01 1． 78
含油量 /mg /g干藻 506 388 231． 6
EPA质量分数 /% 11． 0 15． 0 19． 1
EPA产率 /mg(L·d) 7． 37 6． 88 4． 62
2． 3 pH值对眼点拟微绿球藻油脂含量和 EPA产率
的影响
pH值能改变微藻体内相关酶的结构状态和活
性、培养液中碳源的存在形式以及各种金属复合物
的溶解度，从而影响微藻生长及脂肪酸的含量［25］。
pH值对眼点拟微绿球藻生长密度的影响见图 2。从
图 2 可以看出在适和眼点拟微绿球藻生长的 pH 值
(8． 0 ～ 10． 0)下，pH 值对眼点拟微绿球藻生长的影
响不大。pH 值的变化与眼点拟微绿球藻生长情况
密切相关，对数期眼点拟微绿球藻 pH 值的变化较
大，随着眼点拟微绿球藻生长进入稳定期，pH 值趋
于不变。3 种情况下，随着眼点拟微绿球藻的生长向
对数中期靠近，眼点拟微绿球藻的 pH值都向 9． 0 靠
近，过了对数中期眼点拟微绿球藻的 pH 值的变化逐
渐变小。
图 2 pH值对眼点拟微绿球藻生长密度的影响及
培养过程中 pH值的变化
pH值对眼点拟微绿球藻 EPA 产率的影响见表
3。从表 3 中可以看出 pH 10． 0 不利于眼点拟微绿球
藻油脂的积累，pH值保持 8． 0 和对照组(初始 pH值
为 8． 0 培养过程中 pH 值保持不变)，这 2 种情况下
眼点拟微绿球藻的油脂含量较高，但变化不大。王
秀良等［10］研究表明 pH 9． 8 时眼点拟微绿球藻的油
脂含量明显下降，这个结论与本次试验 pH 10． 0 不
利于眼点拟微绿球藻油脂积累相一致，但是他们的
另外一个结论 pH 9． 2 时眼点拟微绿球藻油脂含量
28
第 29 卷第 5 期 卢美贞等 培养条件对眼点拟微绿球藻油脂含量和 EPA产率的影响
最高与本次试验的结论有出入，本次试验中 pH 8． 0
和对照组都能获得较高的油脂含量，且高于王秀良
等 pH 9． 2 时的最高值 25． 57%，可能的原因是与王
秀良等［10］所用的基础培养基、采收时间不同。从表
3 中可以看出眼点拟微绿球藻中 EPA 占总脂肪酸的
百分比与 pH值有一定关系，pH 10． 0 不利于 EPA的
积累，这可能是因为强碱作用使促进生物体内长链
脂肪酸向多不饱和脂肪酸转化的脱氢酶、加氧酶和
链延长酶的活性降低从而使 EPA含量降低。相对于
pH值保持 8． 0 组，对照组的 EPA含量更高，从 pH值
随培养时间变化来看，对照组的 pH 值在眼点拟微绿
球藻生长的稳定期稳定在 8． 55 ± 0． 05，这可能是眼
点拟微绿球藻产 EPA 的最佳 pH 值。本次试验眼点
拟微绿球藻高油脂含量和 EPA 产率的培养 pH 条件
为初始 pH 8． 0，培养过程中 pH值不调。
表 3 pH值对眼点拟微绿球藻 EPA产率的影响
pH 8． 0 10． 0 初始 8． 0 培养过程不调
干重 / g /L 2． 27 2． 36 2． 24
含油量 /mg /g干藻 472． 4 212． 7 471． 7
EPA质量分数 /% 11． 71 10． 88 14． 80
EPA产率 /(mg /L·d) 7． 11 2． 80 7． 45
3 结论
培养时间对眼点拟微绿球藻的油脂含量和 EPA
产率有着较大的影响，综合考虑油脂含量和 EPA 产
率，选择稳定 5 d为眼点拟微绿球藻的最佳采收时间。
当盐度从 16． 7 增加到 33． 3 的时候，眼点拟微绿
球藻的生长速率逐渐变慢，16． 7 为眼点拟微绿球藻
生长的最适盐度，同时眼点拟微绿球藻的油脂含量
和 EPA产率均能达到最高。
pH 10． 0 不利于 EPA 的积累，本次试验眼点拟
微绿球藻高油脂含量和 EPA 产率的培养 pH 条件为
初始 pH 8． 0，培养过程中 pH值不调。
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(下转第 89 页)
38
第 29 卷第 5 期 朱 磊等 膨化饲料中玉米蛋白粉对黄颡鱼生长的影响
the amount of corn gluten meal is set to 0%，6%，10%，14%，and the control group of lutein added，a total of five test
groups． Each group set up three parallels． Ｒeared in cages in ponds for 58d，the results showed that the survival
rate，feed conversion ratio，specific growth rate，weight gain，protein efficiency difference of Pelteobagrus fulvidraco
in different food group were not significant (P ＞ 0． 05);Pelteobagrus fulvidraco in each group visceral body length，
liver body ratio，fatness and nutritional composition of fish was not significant (P ＞ 0． 05);Blood lipid content，non
－ specific immunity，liver and pancreas function of Pelteobagrus fulvidraco had no significant effect (P ＞ 0． 05);
While it had a significant impact on the levels of blood sugar． Experimental results showed that extruded feed of Pel-
teobagrus fulvidraco can use 6% corn gluten meal，and it can able to maintain normal production performance and
normal physiological function of Pelteobagrus fulvidraco．
Key words corn gluten meal，physiological function，growth，
檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪
Pelteobagrus fulvidraco
(上接第 83 页)
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The Effect of Culture Conditions on the Lipid Content and
Epa Productivity of Nannochloropis Oculata
Lu Meizhen Shen Linjie Lu Xianghong Dou Xiao Ji Jianbing
(Zhejiang Province Key Laboratory of Biofuel College of Chemical Engineering and Materials Science，
Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014)
Abstract The Nannochloropis oculata (N． oculata)is one of the favorable materials for microalgae biodiesel，
which grows well and has high lipid content． Meanwhile，it＇s rich in eicosapentaenoic acid (EPA)． In the study we-
have taken the N． oculata as the research object to study the effects of the cultural condition such as the salinity，the
medium pH，culture time on the lipid contents，and EPA productivity． The results of this experiment showed that:
The optimum collecting time was when the N． oculata cells had stayed in the stationary phase for five days，with the
lipid content of 378． 1 mg /g dry algae and the EPA productivity of 5． 5 mg /(L·d)． Both of the lipid contents and
EPA productivity reached the highest when the salinity was 16． 7 with lipid content of 506． 0 mg /g dry algae and the
EPA productivity of 7． 37 mg /(L·d)． On the condition of pH of 8． 0 ～ 10． 0 which was suitable for N． oculata grow-
ing，while keeping the pH of 8． 0 during the culture process，both of the lipid content and EPA productivity reached
much more higher with lipid content of 471． 7 mg /g dry algae and the EPA productivity of 7． 45 mg /L·d．
Key words culture time，salinity，pH，N． oculata，lipid content，EPA productivity
98