全 文 ：第 20卷 　第 2期
2008年 6月 　　　　　　　　　　
塔 　里 　木 　大　学 　学 　报
JournalofTarimUniversity 　　　　　　　　　　
Vol.20 No.2
Jun.2008
①　　文章编号:1009 -0568(2008)02 -0047 -06
不同保存方法对胡杨 、灰叶胡杨叶片
总 DNA质量的影响
张海燕 　焦培培 　李志军＊ 　杨赵平
(1　新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室 , 新疆 阿拉尔 　843300)
(2　塔里木大学植物科技学院 , 新疆 阿拉尔 　843300)
摘要 　针对胡杨 、灰叶胡杨分布偏远 、新鲜叶片褐化快等特点 , 探索了新鲜叶片 、硅胶干燥后 -70℃保存 3个月的叶片 、硅胶
干燥后常温保存 15个月的叶片 、自然晾干 3天的叶片 、3个月标本的叶片 、 15个月的标本的叶片等六种采集保存方法对胡杨 、
灰叶胡杨总 DNA提取质量的影响 ,并利用分子系统学研究的常用的核糖体 RNA基因 、线粒体基因 、叶绿体基因的保守引物对
所提的 DNA进行 PCR扩增 , 结果表明:硅胶干燥 -70 ℃保存 3个月的叶片和自然晾干 3天的叶片均能得到与新鲜叶片相当
质量的 DNA。考虑到野外样品采集条件的限制 , 认为野外采集大量样品进行胡杨 、灰叶胡杨分子系统学研究的最佳方法为采
样后硅胶干燥 -70℃长期保存。
关键词 　胡杨;灰叶胡杨;保存方法;DNA提取;PCR
中图分类号:Q946.2　　　　　　　　　　文献标识码:A
ComparisonoftheEffectiononDifferentPreservationMethedsofLeavesof
PopulusEuphraticaOliv.andPopulusPruinosaSchrenk.forDNAAnalysis
ZhangHaiyan　JiaoPeipei　LiZhijun＊　YangZhaopin
(1 KeyLaboratoryofBiologicalResourceProptectionandUtilizationofTarimBasin, XinjiangProduction
andConstructionGroup, Alar, Xinjiang843300)
(2 ColegeofPlantScienceandTechnology, TarimUniversity, Alar, Xinjiang843300)
Abstract　ItisofgreatimportancethatthepreservationmethodsoftheleavesofPopuluseuphraticaOliv.andPopuluspruinosa
Schrenk.forDNAextractionconsideringthefreshleavebrowningquicklyandout-of-the-waydistributingoftheplant.The
effectofsixdiferentpreservationmethods(fresh, storedabout3 monthsatthetemperatureof-70 ℃ afterdriedwithsilicagel,
storedabout15monthsatroomtemperatureafterdriedwithsilicagel, dryedabout3 daysatroomtemperature, specimenstoredat
roomtemperature3 monthsand15months)onthequalityoftotalDNAwasinvestigated.PCRamplifiedwithprimersofITS1-5.
8s-ITS2, trnL-trnFintervalsequencesandnad7 intron2forappraisingtheintegralityofgDNA, mtDNA, cpDNA.Theresults
showedthattheDNAextractedfromleavesstoredabout3 monthsatthetemperature-70℃ afterdriedwithsilicagelanddrying
about3 daysatroomtemperaturecouldgetthesamehighqualityasfromthefreshleaves.Themethodofstoredatthetemperature
-70 ℃ afterdriedwithsilicagelcouldbeconsideredforthebestpreservationmethodforstudyonMolecularSystematicsof
Populuseuphraticaoliv.andPopuluspruinosaSchrenk.
Keywords　 Populuseuphraticaoliv;Populuspruinosaschrenk;Preservedmethods;DNA extraction;Polymerasechain
reaction
①收稿日期:2008 -04 -10
基金项目:国家自然科学基金(项目编号:30660018)
作者简介:张海燕(1979 -),女 ,硕士 ,讲师 ,主要从事干旱区生物分子生物学研究。　　E-mail:zhanghaiyan 088@yahoo.com
　　　　 ＊为通讯作者.　　E-mail:lizhijun0202@ 126.com
塔 　里 　木　大 　学 　学 　报 第 20卷
　　胡杨 (PopuluseuphraticaOliv.)和灰叶胡杨
(PopuluspruinosaSchrenk.)均为杨柳科杨属胡杨
派植物 ,具有耐盐碱 、抗旱 、抗寒 、抗风沙 、适应性强
等特点 ,是西北干旱荒漠地区的主要乔木树种 。胡杨
分布于地中海周围 、中国(西北部)和蒙古人民共和
国等 20多个国家的干旱 、半干旱荒漠地带 ,其显著
特点是分布区的不连续性和沿河流两岸呈走廊状天
然林。胡杨是杨属中最古老的一种 ,属中世纪残留物
种 ,由于上世纪中叶对胡杨的人为采伐 、自然条件的
恶化及自我更新能力极低 ,使胡杨数量锐减 。灰叶胡
杨只在我国的塔里木盆地分布 ,目前这两个物种均
已被列入国家珍稀濒危保护植物 [ 1 ～ 3] ,如何对胡杨 、
灰叶胡杨采取合理有效的保护策略成为亟待解决的
问题。近年利用分子系统学的方法研究物种的起源 、
传播 、遗传多样性中心对制定濒危物种的保护策略
提供了可靠的科学依据。
在提取植物叶片 DNA的研究中 , 常规方法多采
用新鲜或冷冻的材料 ,但这些常规方法对野外采集
样品显然不适用 。由于胡杨 、灰叶胡杨多生长于环境
恶劣的偏远地区 ,这些地区交通十分不便 ,对大量采
集样品进行系统学研究造成极大的不便 ,同时胡杨
叶片的次生代谢产物丰富 ,采集的叶片如不采用适
当的处理方法 ,叶片褐化很快 ,对 DNA提取质量带
来很大影响 。有研究表明 , 用硅胶干燥保存的野外
标本的叶子可用于基因组 DNA的提取 [ 4 ～ 6] 。还有研
究认为 ,从硅胶脱水干燥的样品中提取的 DNA有不
同程度的降解 ,其质量不如从鲜样中提取的[ 7 ～ 8] ,也
有部分研究认为 , 利用标本提取 DNA, 发现标本的
制作和储存条件对于植物标本 DNA的质量有重要
影响 [ 9 ～ 10] ,另外还有一些研究认为 , 不同种植物采
集后叶片保存温度 、保存方法和保存时间对总 DNA
质量的影响也有很大的不同[ 11] 。
探索了胡杨 、灰叶胡杨叶片采集保存的六种方
法对总 DNA提取 、基因组 DNA、线粒体 DNA、叶绿体
DNA的完整性的影响 ,试图确定适于胡杨 、灰叶胡
杨远距离 、大批量的采样方法 ,为进一步进行胡杨 、
灰叶胡杨的分子系统学研究提供可行的实验方法。
1 　材料与方法
1.1 　材料
供试材料分别于 2006年 4月 、2007年 4月采自
新疆塔里木大学校园内生长的胡杨和灰叶胡杨 ,分
别为硅胶干燥 -70 ℃保存 3个月的叶片 、硅胶干燥
常温保存 15个月的叶片 、自然晾干 3天的叶片 、压制
3个月和 15个月标本的叶片 ,新鲜的叶片为对照 。
1.2 　总 DNA提取
对 CTAB法稍作改进:加液氮充分研磨叶片 ,研
磨时加入少量的 PVP和抗坏血酸钠 ,立即加入 1 mL
预热的提取液 (2.0 % CTAB, 1.4 mol/LNaCl, 100
mmol/LTris-HCl(pH8.0), 20 mmol/LEDTA(pH
8.0),加入 14 μLβ -巯基乙醇混匀 , 65 ℃保温 60
min(期间颠倒几次);加入等体积的氯仿 /异戊醇
(24︰ 1)抽提 ,颠倒混匀 , 12 000 rpm/min, 4 ℃离
心 10 min;重复三次 ,取上清 ,加入 2/3体积的冰异
丙醇(-20 ℃预冷), 混匀后在 -20 ℃下放置 20
min;10000 rpm/min, 4 ℃离心 10 min;弃去上清液 ,
加入 70 %乙醇配置的 10 mmol/LNaAc;10000 rpm
/min, 4 ℃离心 10 min;弃上清后将沉淀晾干;50 μL
1 ×TE溶解备用。
1.3 　DNA纯度及浓度测定
所得 DNA稀释 400倍后 , 在紫外分光光度计
(ultrospec4300 pro,安马西亚公司 ,瑞典)上测定总
DNA在 260 nm和 280 nm处的吸光值 ,根据 A260 /
A280确定 DNA纯度 。根据 260 nm处测定的光吸收
值估测样品 DNA的浓度 。1% 的琼脂糖凝胶
(Gelview染色 , 0.5 μg/mL)电泳 ,估算 DNA样品的
纯度及浓度 。
1.4 　总 DNA质量的 PCR鉴定
以所得胡杨 、灰叶胡杨总 DNA为模板 ,使用真
核生物核糖体 DNA引物 , 用于扩增 ITS1 -5.8s-
ITS2的通用引物为 P1和 P2[ 12] ,其序列如下:P1为
5 , -CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAAC-3,位于
18S上 , P2为 5, -TCCTCCTCCGCTTATTGATATGC
-3,位于 26S上(引物由上海杰瑞公司合成),目标
片段 800bp左右 。叶绿体 DNA的扩增 , 用 Y1:5, -
GGTTCAAGTCCCTCTATCCC - 3, , Y2:5, -
ATTTGAACTGGTGACACGAG-3,扩增 trnL-trnF
基因间隔区的序列[ 13] ,线粒体 DNA的扩增 ,用引物
X1:5, -GCTTTACCTTATTCTGATCG-3 , , X2:5, -
TGTTCTTGGGCCATCATAGA-3,扩增线粒体 nad7
基因内含子 2区域序列 [ 14] 。扩增反应在 BIO-RAD
公司生产的 MyCyclePCR仪中进行 ,反应总体积为
20 μL:模板 DNA40 ng,引物(1 μM)各 1.5 μL, Tag
酶(5 U/μL)0.2 μL, PCRbufer2 μL, Mg2 +2 μL,
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第 2期 张海燕等:不同保存方法对胡杨 、灰叶胡杨叶片总 DNA质量的影响
dNTPs(各 1 mM)1.5μL, ddH2O补齐至 20 μL。ITS
区扩增程序为:94 ℃ 4 min, 94 ℃ 40 s, 47℃ 40 s,
72℃ 45s, 共循环 32次 , 72 ℃延伸 7 min。叶绿体
DNA的扩增程序:95 ℃ 4 min, 94 ℃ 30 s, 52℃ 40 s,
72℃ 40s, 共循环 37次 , 72 ℃延伸 7 min。线粒体
DNA的扩增程序为:95 ℃ 4 min, 94 ℃ 45 s, 50 ℃
45 s, 72 ℃ 1 m,循环 37次 , 72 ℃延伸 10 min。扩增
产物在 65 V电压 , 1.5 %的琼脂糖凝胶(GELview染
色)中电泳 , ITS区序列扩增产物点样量 4 μL,其他
点样量 10 μL, 35分钟后用凝胶成像分析系统观察
结果并保存 。
2　结果与分析
2.1 　DNA纯度及浓度
所提总 DNA经紫外分光光度计测得 260 nm及
280 nm的吸光度比值在 1.53 ～ 1.86之间 ,灰叶胡
杨 DNA均在 1.60 ～ 2.00之间 ,根据 260 nm处的吸
表 1　不同保存方法叶片 DNA提取的纯度和浓度
叶片保存方法 树种 A260 A280 A260/280 C(ng/μL)
新鲜的叶片 胡杨 0.132 0.078 1.833 2640
　 灰叶胡杨 0.198 0.110 1.800 3960
硅胶干燥 -70℃保存 3个月的叶片 胡杨 0.14 0.081 1.728 2800
　 灰叶胡杨 0.133 0.083 1.602 2660
硅胶干燥常温保存 15个月的叶片 胡杨 0.025 0.014 1.786 500
　 灰叶胡杨 0.201 1.861 0.108 4020
自然晾干 3天的叶片 胡杨 0.108 0.058 1.862 2190
　 灰叶胡杨 0.248 0.138 1.797 4960
3个月标本的叶片 胡杨 0.056 0.030 1.533 920
　 灰叶胡杨 0.199 0.103 1.932 3980
15个月标本的叶片 胡杨 0.018 0.011 1.636 360
　 灰叶胡杨 0.022 0.011 2.000 440
图 1　胡杨灰叶胡杨叶片不同保存方法所得基因组 DNA的电泳图谱
1, 2, 3, 4, 5, 6:胡杨 DNA;7, 8, 9, 10, 11, 12:灰叶胡杨 DNA;1, 7:新鲜的叶片;2, 8:硅胶干燥后 -70℃保存 3个月的叶片;
3, 9:硅胶干燥后室温保存 15个月叶片;4, 10:自然晾干 3天的叶片;5, 11:3个月的标本上取得叶片;6, 12:15个月的标本叶片。
图 2　ITS1 -5.8s-ITS2区的 PCR扩增结果
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塔 　里 　木　大 　学 　学 　报 第 20卷
光度估算 DNA的浓度(表 1)。实验结果表面不同的
保存方法都能够提出 DNA,胡杨 、灰叶胡杨硅胶干
燥后 -70℃保存 3个月的叶片 、自然晾干 3天的叶
片所提取的 DNA的质量和浓度均能达到与新鲜叶
片相当的质量和浓度 ,灰叶胡杨的硅胶干燥 15个月
叶片 、3个月的标本上取得叶片也能达到与新鲜样
品接近的质量和浓度 ,胡杨 、灰叶胡杨 15个月的标
本叶片所提 DNA比值浓度均偏低 ,灰叶胡杨 15个
月的标本叶片所提 DNA存在明显的降解 。胡杨的
DNA浓度普遍较灰杨低 ,不同的保存方法对 DNA质
量有较大的影响 , DNA的凝胶电泳检测结果见图 1,
电泳检测结果与分光光度计结果一致 ,蛋白 、多糖等
杂质去除效果均较好 。并且灰叶胡杨的 DNA浓度 、
纯度普遍较胡杨的 DNA浓度 、纯度高 。
图 3　叶绿体基因 trnL-trnF基因间隔区的 PCR扩增结果
图 4　线粒体 nad7基因内含子 2的 PCR扩增结果
2.2 　总 DNA质量的 PCR鉴定
利用真核生物 ITS1 -5.8s-ITS2引物对胡杨基
因组 DNA进行扩增 ,在硅胶干燥后 -70℃保存 3个
月的叶片 、自然晾干的叶片 、3个月的标本三个样品
中扩增获得与新鲜的叶片相当的扩增效果 ,在两物
种的硅胶干燥后室温保存 15个月的叶片及灰叶胡
杨的 15个月的标本样品扩增条带稍弱(图 2)。
　　利用叶绿体引物扩增 trnL-trnF基因间隔区的
序列以检测叶绿体 DNA保存情况 ,在两个物种硅胶
干燥后 -70℃保存 3个月的叶片 、自然干燥 3天的叶
片叶片中获得与新鲜的叶片相当的扩增效果;在 3
个月的标本叶片 DNA中也扩增到目标片段 ,但扩增
较弱;在硅胶干燥后室温保存 15个月的叶片 、15个
月的标本中未扩增到目标片段(图 3)。
　　利用线粒体引物扩增线粒体 nad7基因内含子 2
区域序列以检测所提总 DNA中线粒体 DNA的保存
情况 。在胡杨样品中 ,硅胶干燥后 -70℃保存 3个月
的叶片 、自然晾干 3天的叶片中获得与新鲜叶片相
当的扩增效果 , 3个月的标本叶片 DNA扩增稍弱 、在
硅胶干燥后室温保存 15个月的叶片 、15个月的标本
未扩增到目标片段;灰叶胡杨的叶片中硅胶干燥后
-70℃保存 3个月的叶片 、自然晾干 3天的叶片获得
与新鲜的叶片相当的扩增结果 ,在硅胶干燥后室温
保存 15个月的叶片和 3个月的标本叶片中有较弱的
扩增 ,在 15个月的标本未扩增到目标片段(图 4)。
3 　讨论
3.1 　不同保存方法对总 DNA质量的影响
通过比较发现:从两个物种的硅胶干燥后 -70
℃冰箱保存的样品所提的总 DNA的质量和数量都
50
第 2期 张海燕等:不同保存方法对胡杨 、灰叶胡杨叶片总 DNA质量的影响
与新鲜叶片相当 ,对其基因组 DNA的 ITS1 -5.8s-
ITS2区的扩增 、线粒体基因的扩增 、叶绿体基因的扩
增 ,均与新鲜样品 DNA的扩增效果完全一致 。故可
以认为 ,硅胶干燥 -70 ℃保存可长期保留叶片中总
DNA的完整性。
研究过程发现自然干燥后室温放置 3天的叶片
也可达到与新鲜叶片相当的效果 ,可能与新疆南疆
极端干燥 、终年降雨极少的气候条件有关。采集叶片
过程中发现 ,夏季采集叶片置于室温状态下 , 24 h后
已完全干燥 ,并且样品保存时间较短 ,对总 DNA影
响不大 。我们尝试在野外采样采用自然干燥的方法 ,
将采集的叶片放至信封袋中 ,约 2 h后发现胡杨叶片
出现非常明显的褐化 ,这些样品所提取的总 DNA降
解非常严重 ,因而在采集适于胡杨分子系统学研究
的大量样品时 ,不宜采用此方法;而采用相同方法保
存的灰叶胡杨叶片褐化不明显 ,过夜后仍保持新鲜
绿色 ,故条件合适的情况下可采用此方法 ,既节省成
本 ,又可达到实验的要求。
从压制 3个月标本的叶片中提取总 DNA的浓度
较低 ,三对引物的PCR扩增较弱 ,可能与标本的压制
是一个缓慢失水过程有关 , DNA在此过程中存在一
定程度的降解。叶片在硅胶干燥后室温保存 15个月
以及保存 15个月的标本叶片中 ,基因组 DNA的 ITS
区扩增稍弱 ,不影响观察分析 ,但胡杨线粒体基因 、
叶绿体基因的扩增均没有结果 ,灰叶胡杨线粒体基
因有扩增结果但比较弱 ,叶绿体基因的扩增没有结
果 。故胡杨 、灰叶胡杨 DNA完整性与保存时间 、保存
条件有很大的关系 , 并且在室温条件下保存利于
DNA的降解 。
研究认为 ,对于胡杨 、灰叶胡杨这种分布偏远的
物种进行分子系统学研究最佳且最实用的采样方法
是用硅胶干燥样品 ,使其迅速失水 ,待彻底干燥后带
回实验室 -70℃冰箱长期保存。对于灰叶胡杨野外
采样除采用上述方法外 ,也可以将叶片采用装入信
封袋自然晾干的方法 ,但室温长期保存不利于保持
DNA的完整性 ,彻底干燥后仍需置于 -70℃冰箱长
期保存 。
3.2　两物种叶片褐化对 DNA提取质量的影响
一般干旱区多年生植物的次生代谢产物较多 ,
对 DNA提取质量有很大的影响 , DNA提取过程中 ,
胡杨叶片褐化非常快 ,要避免褐化有几点需多加注
意:首先制备样品时一定要用液氮充分研磨 。我们在
实验过程中发现 , 干燥的叶片不用液氮研磨 , DNA
提取量非常低 ,这可能由于干燥的叶片在脱水的过
程中 ,一些次生代谢产物也很容易脱水 、氧化 ,使植
物组织变硬 ,不加液氮研磨 ,很难把样品的细胞充分
碾磨破碎有关;液氮研磨前需加入 PVP和抗坏血酸 ,
对防止叶片提取过程中样品褐化有明显的抑制作
用;加入提取液时 ,需同时加入 β -巯基乙醇 ,对防
止样品褐化也非常重要。
同时发现胡杨较灰叶胡杨的叶片褐化要更快一
些 ,因此对于胡杨叶片采集保存及 DNA的提取过程
中采用合适的方法防止其褐化是获得高质量的
DNA的前提 。灰叶胡杨虽然与胡杨生活环境非常相
似 ,并且常常伴生 ,但其叶片褐化程度远远低于胡杨
叶片 ,线粒体 DNA的降解速度也低于胡杨 ,可能与
灰叶胡杨的叶片较肥厚 ,保水性较强 、自身次生代谢
产物较胡杨少有极大的关系 ,因此采集保存灰叶胡
杨叶片的要求低于胡杨。
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(上接第 34页)
可先对矩阵施以初等列变换再施以对应的初等行变
换 ,将矩阵直接化为对角型 ,再利用对角元的符号判
定正定性 ,且可求出其正负惯性指数 。
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